時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，包括以下步驟：1）激發(fā)光經(jīng)顯微物鏡投射到的待測樣品之上，對待測樣品進行寬敞激發(fā)發(fā)出熒光；2）損耗光通過光束調(diào)制模塊進行調(diào)制后，同樣經(jīng)顯微物鏡投射到待測樣品上，形成暗斑陣列狀照明光斑，對寬敞激發(fā)區(qū)域進行受激輻射損耗；3）待測樣品在受激輻射損耗后發(fā)出的熒光由顯微物鏡收集，并聚焦投射到光電感應(yīng)器件上，得到待測樣品的熒光圖像；4）平移待測樣品，并重復(fù)步驟1）～3），對待測樣品進行水平二維掃描，得到與各掃描位置相對應(yīng)的熒光圖像；5）對所有熒光圖像進行平移、疊加處理，最終恢復(fù)出二維超分辨圖像。本發(fā)明還公開了一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置。
【專利說明】時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法及裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光學(xué)超分辨顯微領(lǐng)域，特別涉及一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]由于衍射極限的存在，常規(guī)光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率一直被限制在半波長左右，無法在可見光波段內(nèi)對于亞百納米尺寸的微觀物體進行分辨。20世紀90年代以來，研究人員們陸續(xù)提出了多種超分辨顯微成像方法來實現(xiàn)小于衍射極限的空間分辨率。其中，受激輻射損耗顯微術(shù)(STED)是第一種能在遠場實現(xiàn)超分辨顯微的技術(shù)，同時也是目前應(yīng)用最為廣泛的。
[0003]STED顯微鏡是在常規(guī)共焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，通過引入一路損耗光，以受激輻射的方式將激發(fā)光斑外圍部分的被激發(fā)電子送回基態(tài)，從而減少有效熒光的發(fā)光面積，提高成像分辨率。這種技術(shù)可以突破衍射極限的限制，實現(xiàn)小于10納米的橫向分辨率。但是，由于目前的STED顯微術(shù)均是通過單點掃描的方式來進行成像的，其成像速度在一定程度上受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法及裝置，可以有效地提高STED顯微術(shù)的成像速度。
[0005]一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，包括以下步驟:
[0006]I)平行入射的激發(fā)光，經(jīng)顯微物鏡投射在位于納米水平位移臺的待測樣品之上，對所述的待測樣品進行寬敞激發(fā)發(fā)出熒光；
[0007]2)平行入射的損耗光，通過光束調(diào)制模塊進行調(diào)制后，同樣經(jīng)所述的顯微物鏡投射到所述的待測樣品上，形成暗斑陣列狀照明光斑，對寬敞激發(fā)區(qū)域進行受激輻射損耗；
[0008]3)所述待測樣品在受激輻射損耗后發(fā)出的熒光由顯微物鏡收集，并通過聚焦投射到光電感應(yīng)器件上，得到待測樣品的熒光圖像；
[0009]4)移動所述的納米水平位移臺，并重復(fù)步驟I)?3)，對待測樣品進行水平二維掃描，得到與各掃描位置相對應(yīng)的熒光圖像；
[0010]5)對所得到的各幅熒光圖像進行平移、疊加處理，最終恢復(fù)出待測樣品的二維超分辨圖像。
[0011]其中，所述光束調(diào)制器件的作用為對損耗光束進行調(diào)制，使其在待測樣品上形成暗斑陣列狀照明光斑；一般可采用兩個渥拉斯頓棱鏡使兩對尋常光與非尋常光發(fā)生相干或是采用空間光調(diào)制器對損耗光束進行位相編碼來實現(xiàn)。
[0012]其中，在步驟3)中，對光電感應(yīng)器件的成像設(shè)置時間門控進行探測延時，即當(dāng)待測樣品被激發(fā)產(chǎn)生熒光時，并不立即對其成像，而是延后一定時間，才開始收集熒光。
[0013]其中，所述的光電感應(yīng)器件優(yōu)選使用ICXD。[0014]本發(fā)明還提供了一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，包括:
[0015]布置在激發(fā)光光路上的第一透鏡，
[0016]沿損耗光光路依次布置的光束調(diào)制模塊和第二透鏡，
[0017]用于承載熒光樣品的納米水平位移臺，
[0018]用于將所述激發(fā)光路和損耗光路的光線投射至熒光樣品的投射裝置，
[0019]以及檢測所述熒光樣品發(fā)光的探測成像系統(tǒng)。
[0020]其中，第一透鏡用于將平行入射的激發(fā)光束進行聚焦。
[0021]其中，光束調(diào)制模塊用于對平行入射的損耗光進行調(diào)制，使其在待測樣品上形成暗斑陣列狀照明光斑；一般可采用兩個渥拉斯頓棱鏡使兩對尋常光與非尋常光發(fā)生相干或是采用空間光調(diào)制器對損耗光束進行位相編碼來實現(xiàn)，優(yōu)選使用空間光調(diào)制器。
[0022]其中，第二透鏡，用于將調(diào)制后的損耗光束聚焦。
[0023]其中，投射裝置包括第一二色鏡、第二二色鏡和顯微物鏡；第一二色鏡用于使激發(fā)光束反射，同時使樣品發(fā)出的熒光透射；第二二色鏡用于使激發(fā)光束透射，使損耗光束反射，同時使樣品發(fā)出的熒光透射；顯微物鏡用于將激發(fā)光和損耗光投射到待測樣品之上，同時用于收集待測樣品所發(fā)出的熒光。
[0024]其中，納米水平位移臺用于放置待測樣品，并進行水平移動，實現(xiàn)對于樣品的二維掃描。
[0025]其中，探測成像系統(tǒng)包括場鏡和光電感應(yīng)器件；場鏡用于將熒光光束投射到光電感應(yīng)器件上；光電感應(yīng)器件用于收集熒光，得到相應(yīng)的熒光圖像。
[0026]其中，所述光電感應(yīng)器件的成像應(yīng)可以通過時間門控進行探測延時，即當(dāng)待測樣品被激發(fā)產(chǎn)生熒光時，并不立即對其成像，而是延后一定時間，才開始收集熒光。
[0027]本發(fā)明原理如下:
[0028]常規(guī)STED顯微方法是基于單點掃描成像的。換句話說，在常規(guī)STED方法中，單次只能獲得一個掃描點處的光強信息。因此，要實現(xiàn)對于樣品的二維成像，必須通過掃描，重復(fù)多次單點成像的過程，從而限制了其的成像速度。
[0029]要提高STED顯微術(shù)的成像速度，可以采用并行多點成像的方式，即單次獲取多個掃描點處的光強信息，從而減少所需的掃描次數(shù)。
[0030]在本發(fā)明中，通過對損耗光束進行調(diào)制，可以使其在樣品面上形成暗斑陣列狀照明光斑。在此照明光斑中，多個損耗暗斑以一定的間隔成陣列狀排布。根據(jù)STED的成像原理，在激發(fā)光成寬場照明的情況下，只有每個損耗暗斑中的空心區(qū)域所對應(yīng)的樣品才可以發(fā)出熒光。并且，由于此時所生成的暗斑陣列狀照明光斑中，相鄰兩個損耗暗斑之間的間隔大于衍射極限，因此，相鄰兩個損耗暗斑中空心區(qū)域所對應(yīng)的樣品發(fā)出的熒光不會在光電感應(yīng)器件上形成串?dāng)_，可以很好地被區(qū)分出來。
[0031]由于一般系統(tǒng)中所用激光光源的功率有限，在多點并行成像時，分到每個損耗暗斑單元上的光強將更為有限。因此，本發(fā)明中引入了時間門控STED技術(shù)，通過延時探測熒光，來提高損耗光強的利用率，實現(xiàn)在較低光強下的STED超分辨成像。
[0032]在本發(fā)明中，二維掃描是通過納米水平位移臺控制樣品相對損耗暗斑陣列進行平移來是實現(xiàn)的。此時，暗斑陣列相對光電感應(yīng)器件的位置是固定的，各暗斑中心位置所對應(yīng)的光電感應(yīng)器件上的像素單元也是固定的。根據(jù)STED顯微術(shù)的成像原理，損耗暗斑的中心位置決定了熒光的發(fā)光位置，因此，每次成像時只需記錄特定像素單元接收到的光強信息，并將其作為對應(yīng)掃描點位置的像素值即可。在后續(xù)恢復(fù)圖像時，將各幅圖像按照各自掃描位置和順序進行平移，再進行光強疊加便能得到待測樣品的超分辨顯微圖像。
[0033]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0034]1、成像速度快；
[0035]2、能量利用率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為本發(fā)明時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置的示意圖。
[0037]圖2為本發(fā)明中所生成的損耗暗斑陣列狀光斑示意圖。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。
[0039]如圖1所示，一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，包括:第一透鏡1，光束調(diào)制模塊2，第二透鏡3，第一二色鏡4，第二二色鏡5，顯微物鏡6，納米水平位移臺7，場鏡8和光電感應(yīng)器件9。
[0040]其中，第一透鏡I位于激發(fā)光光路上，用于將平行入射的激發(fā)光束進行聚焦。
[0041]光束調(diào)制模塊2位于損耗光光路上，用于對平行入射的損耗光進行調(diào)制，使其在待測樣品上形成暗斑陣列狀照明光斑；一般可采用兩個渥拉斯頓棱鏡使兩對尋常光與非尋常光發(fā)生相干或是采用空間光調(diào)制器對損耗光束進行位相編碼來實現(xiàn)。
[0042]第二透鏡3，位于損耗光光路上，用于將調(diào)制后的損耗光束聚焦。
[0043]第一二色鏡4，用于使激發(fā)光束反射，同時使樣品發(fā)出的熒光透射。
[0044]第二二色鏡5，用于使激發(fā)光束透射，使損耗光束反射，同時使樣品發(fā)出的熒光透射。
[0045]顯微物鏡6，用于將激發(fā)光和損耗光投射到待測樣品之上，同時用于收集待測樣品所發(fā)出的熒光。
[0046]納米水平位移臺7，用于放置待測樣品，并進行水平移動，實現(xiàn)對于樣品的二維掃描。
[0047]場鏡8,用于將突光光束投射到光電感應(yīng)器件上。
[0048]光電感應(yīng)器件9，用于收集熒光，得到相應(yīng)的熒光圖像。
[0049]其中，所述光電感應(yīng)器件9選用ICXD，其成像應(yīng)可以通過時間門控進行探測延時，即當(dāng)待測樣品被激發(fā)產(chǎn)生熒光時，并不立即對其成像，而是延后一定時間，才開始收集熒光。
[0050]其中，所述光束調(diào)制模塊選用空間光調(diào)制器。
[0051]采用圖1所示的裝置實現(xiàn)時間門控寬場受激輻射超分辨顯微過程如下:
[0052]平行入射的激發(fā)光通首先過第一透鏡I聚焦，之后由第一二色鏡4反射；由第一二色鏡反射4的激發(fā)光，透過第二二色鏡5，之后經(jīng)過顯微物鏡6投射在位于納米水平位移臺7的待測樣品之上，對其進行寬場激發(fā)；
[0053]平行入射的損耗光，通過空間光調(diào)制器進行調(diào)制后，由第二透鏡3聚焦，之后由第二二色鏡5反射；由第二二色鏡5反射的損耗光，經(jīng)過顯微物鏡6投射在位于納米水平位移臺7的待測樣品之上，形成暗斑陣列狀照明光斑，對待測樣品進行受激輻射損耗；
[0054]由待測樣品發(fā)出的熒光由顯微物鏡6收集，之后依次透過第二二色鏡5和第一二色鏡4，并經(jīng)場鏡8聚焦，投射在ICCD9之上，得到待測樣品的熒光圖像；
[0055]移動納米水平位移臺7，實現(xiàn)對于待測樣品的水平二維掃描，并得到與各掃描位置相對應(yīng)的熒光圖像；
[0056]對所得到的各幅熒光圖像進行平移，疊加處理，最終恢復(fù)出待測樣品的二維超分辨圖像。
[0057]在上述方法中，利用空間光調(diào)制器對損耗光束進行位相編碼，使其在待測樣品上形成如圖2所示的暗斑陣列狀照明光斑；
[0058]ICXD9的成像通過時間門控進行探測延時，即當(dāng)待測樣品被激發(fā)產(chǎn)生熒光時，并不立即對其成像，而是延后一定時間，才開始收集熒光。通過這種方法來降低所需的損耗光強。
【權(quán)利要求】
1.一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)激發(fā)光經(jīng)顯微物鏡投射在位于納米水平位移臺的待測樣品之上，對所述的待測樣品進行寬敞激發(fā)發(fā)出熒光； 2)損耗光通過光束調(diào)制模塊進行調(diào)制后，同樣經(jīng)所述的顯微物鏡投射到所述的待測樣品上，形成暗斑陣列狀照明光斑，對寬敞激發(fā)區(qū)域進行受激輻射損耗； 3)所述待測樣品在受激輻射損耗后發(fā)出的熒光由顯微物鏡收集，并通過聚焦投射到光電感應(yīng)器件上，得到待測樣品的熒光圖像； 4)移動所述的納米水平位移臺，并重復(fù)步驟I)?3)，對待測樣品進行水平二維掃描，得到與各掃描位置相對應(yīng)的熒光圖像； 5)對所得到的各幅熒光圖像進行平移、疊加處理，最終恢復(fù)出待測樣品的二維超分辨圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，其特征在于，所述的光束調(diào)制模塊為依次布置的損耗光光路上的兩個渥拉斯頓棱鏡。
3.如權(quán)利要求1所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，其特征在于，所述的光束調(diào)制模塊為用于對所述損耗光進行位相編碼的空間光調(diào)制器。
4.如權(quán)利要求1所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，其特征在于，在步驟3)中，在采集所述熒光圖像時，對光電感應(yīng)器件的成像設(shè)置時間門控進行探測延時。
5.如權(quán)利要求1所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微方法，其特征在于，所述的光電感應(yīng)器件為ICCD。
6.一種時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，其特征在于，包括: 布置在激發(fā)光光路上的第一透鏡， 沿損耗光光路依次布置的光束調(diào)制模塊和第二透鏡， 用于承載熒光樣品的納米水平位移臺， 用于將所述激發(fā)光光路和損耗光光路的光線投射至待測樣品的投射裝置， 以及檢測所述待測樣品發(fā)光的探測成像系統(tǒng)。
7.如權(quán)利要求6所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的光束調(diào)制模塊為依次布置的損耗光光路上的兩個渥拉斯頓棱鏡。
8.如權(quán)利要求6所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的光束調(diào)制模塊為用于對損耗光進行位相編碼的空間光調(diào)制器。
9.如權(quán)利要求6所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的投射裝置包括第一二色鏡、第二二色鏡和顯微物鏡； 第一二色鏡用于使激發(fā)光反射，同時使待測樣品發(fā)出的熒光透射； 第二二色鏡用于使激發(fā)光透射，使損耗光束反射，同時使待測樣品發(fā)出的熒光透射； 顯微物鏡用于將激發(fā)光和損耗光投射到待測樣品之上，同時用于收集待測樣品所發(fā)出的突光。
10.如權(quán)利要求6所述的時間門控寬場受激輻射超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的探測成像系統(tǒng)包括場鏡和光電感應(yīng)器件；場鏡用于將熒光光束投射到光電感應(yīng)器件上；所述光電感應(yīng)器件用于收集熒光并得到相應(yīng)的熒光圖像。
【文檔編號】G01N21/64GK103487421SQ201310460512
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】匡翠方, 李帥, 葛劍虹, 劉旭 申請人:浙江大學(xué)