鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條或試紙卡及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條或試紙卡及制備方法，試紙條結(jié)構(gòu)包括支撐板、樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊，試紙條兩端設(shè)有保護(hù)膜，所述樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜、吸水墊依次粘貼于支撐板上；金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體或多克隆抗體；包被膜上設(shè)有偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隱形對(duì)照印跡。本發(fā)明的膠體金層析檢測(cè)試紙條或試紙卡特異性強(qiáng)、敏感性高、使用便捷、快速、時(shí)效性強(qiáng)；結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確、節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。
【專利說明】鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條或試紙卡及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)微量鋅離子的器具，特別是涉及一種用于快速檢測(cè)鋅離子的金標(biāo)試紙條/卡及制備方法，屬于免疫學(xué)和衛(wèi)生檢驗(yàn)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤和農(nóng)產(chǎn)品中的重金屬與人類健康密切相關(guān)。重金屬污染主要是指生物毒性顯著的汞、鉻、鎘、鉛以及類金屬砷，還包括具有毒性的重金屬銅、鈷、鎳、錫等金屬污染物。重金屬污染不同于其他類型污染，具有隱蔽性、長(zhǎng)期性和不可逆轉(zhuǎn)性等特點(diǎn)。隨著城市的擴(kuò)大和大規(guī)模工業(yè)發(fā)展，大量重金屬進(jìn)入環(huán)境后，即使?jié)舛群艿鸵部赡茉斐晌：?，通過飲用水或者通過生物富集以及食物鏈等方式最終威脅到人體健康。
[0003]鋅參與體內(nèi)200多種酶的合成和活化，是機(jī)體新陳代謝的重要物質(zhì)，是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及維持正常生理機(jī)能所必須的微量元素，參與蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和再生；但環(huán)境污染和飼料、藥物添加劑的濫用，造成畜禽產(chǎn)品鋅的殘留不同程度超標(biāo)。過量鋅是一種作用迅速的中樞神經(jīng)毒素，通過對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接損害以及對(duì)體內(nèi)各種物質(zhì)的拮抗而影響腦功能，攝入過量會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂；過量的鋅還可明顯抑制紅細(xì)胞的免疫功能，造成雛雞肝、脾的結(jié)構(gòu)和功能受損。許多實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查已證實(shí)，如果鋅在體內(nèi)含量過高，將會(huì)抑制吞噬細(xì)胞的活性和殺菌力，降低人體免疫功能，抵抗力減弱，對(duì)疾病易感性增加。
[0004]同時(shí)，鋅主要來源于采礦、電鍍和冶煉行業(yè)污染物的排放，水和土壤中的鋅污染已經(jīng)引起環(huán)境科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。土壤中鋅超過200mg /kg時(shí)可能對(duì)植物生長(zhǎng)造成危害，過量鋅可直接導(dǎo)致植物發(fā)生鋅污染中毒，也可能間接影響植物對(duì)于重要營(yíng)養(yǎng)元素Fe的吸收，進(jìn)而使植物因缺Fe而引起生長(zhǎng)障礙、甚至死亡。在重金屬污染的預(yù)防和治理中，重金屬污染物的監(jiān)測(cè)和識(shí)別至關(guān)重要。
[0005]因此，痕量重金屬的定性定量分析在食品和環(huán)境檢測(cè)等方面非常重要。傳統(tǒng)的重金屬離子檢測(cè)法有無火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、火焰原子吸收光譜法、伏安法和離子色譜法，以及電熱原子化原子吸收光譜法等，檢測(cè)必須在具備大型分析儀器的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，無法用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且受到費(fèi)用高、處理量有限和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等限制，不利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，難以適應(yīng)環(huán)境及市場(chǎng)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)抽查及產(chǎn)品進(jìn)出口快速通關(guān)的要求。
[0006]因此，建立快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、大批量篩檢的鋅免疫檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于減少環(huán)境污染、提高食品質(zhì)量和保障食品安全具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:提供一種能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的檢測(cè)鋅離子污染殘留的鋅離子金標(biāo)試紙條或試紙卡；還提供鋅離子金標(biāo)試紙條的制備方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案: 一種鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條，包括支撐板、樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊，試紙條兩端設(shè)有保護(hù)膜，所述樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜、吸水墊依次粘貼于支撐板上；金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體或多克隆抗體；包被膜上設(shè)有偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隱形對(duì)照印跡。
[0009]所述支撐板為硬質(zhì)塑膠條或不吸水的硬紙條；所述樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊由玻璃纖維棉制成；所述吸水墊由吸水濾紙制成；所述包被膜由硝酸纖維素膜制成；所述載體蛋白為雞卵清蛋白(0VA)、血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清蛋白(BSA)。
[0010]所述保護(hù)膜覆蓋在樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸水墊上，保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該樣品標(biāo)記線偏向樣品墊一側(cè)0.3-0.5cm處；隱形檢測(cè)印跡上偶聯(lián)六價(jià)鋅離子的載體蛋白溶液的包被量為I μ L/cm，載體蛋白濃度為lmg/mL ;隱形對(duì)照印跡上羊抗小鼠IgG抗體的包被量為I μ L/cm，抗體濃度為lmg/mL ;所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡的排列方式為“I I ”、“ + + ”或“籲.”。
[0011]鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條的制備方法，所述制備步驟如下:
(1)偶聯(lián)鋅離子載體蛋白溶液的制備:
稱取20mg載體蛋白溶于lmL、濃度為10mmoL/L、pH值為9.0的N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸的緩沖液中，形成載體蛋白溶液；稱取IOmg對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于ImL 二甲基亞颯中，形成金屬鰲合劑溶液；取IOOuL DTPA溶液在攪拌下逐滴加到0.5mL載體蛋白溶液中，用lOmol/L的KOH調(diào)節(jié)其pH至9.0，室溫反應(yīng)24h，形成DTPA-載體蛋白溶液；稱取IOOmg氯化鋅溶于100 μ L濃硝酸中，加純水溶解得到終體積為lmL、濃度為733.7mmoL/L 的 Zn2+ 溶液；
將Zn2+溶液加入到DTPA-載體蛋白溶液中，調(diào)節(jié)其pH值至7.4，室溫孵育4h，用PBS緩沖液透析10d，形成Zn2+-DTPA -載體蛋白人工抗原，收集分裝，一 20°C凍存；
(2)單克隆抗體的制備:用Zn2+-DTPA-載體蛋白免疫6周齡BALB/C小鼠，采用細(xì)胞融合技術(shù)，在PEG-1500作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用ELISA法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并鑒定，制備雜交瘤細(xì)胞株，之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備鋅離子單克隆抗體；
(3)金標(biāo)抗體制備:
將待標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,取膠體金溶液IOmL,用0.1mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;取等量鋅離子單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,將所得沉淀用每升含10 g BSA、0.5 g疊氮鈉、濃度為0.02 mol/L的Na2B4O7溶液稀釋，即獲得膠體金標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體，4 °C保存?zhèn)溆茫?br> (4)金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:按規(guī)格裁取玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (5)隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡的制備:將Zn2+-DTPA-載體蛋白人工抗原放于X-only單向噴點(diǎn)儀貯存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于貯存池B，開機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間距0.5cm的隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在試紙條兩端的表面粘貼保護(hù)膜，在切槽機(jī)上切割成試紙條。
[0012]其中鋅離子單克隆抗體與膠體金溶液的標(biāo)記比為1: 5.2X 104，所得膠體金溶液中金顆粒的粒徑為30 nm ;所含羊抗小鼠IgG溶液的濃度為0.34 μ g/mL。
[0013]一種鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙卡，包括殼體和位于殼體內(nèi)的試紙芯,試紙芯包括底層支撐板、樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊，所述樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊依次粘貼于底層支撐板上；金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體；所述包被膜上設(shè)有偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隱形對(duì)照印跡。
[0014]所述殼體由底座和面蓋構(gòu)成，底座和面蓋通過嵌合連在一起，底座上設(shè)有放置試紙芯的凹槽，面蓋上設(shè)有觀察窗、加樣孔，觀察窗與試紙芯的包被膜相對(duì)應(yīng)，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對(duì)應(yīng)。
[0015]所述支撐板為硬質(zhì)塑膠條或不吸水的硬紙條；所述樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊由玻璃纖維棉制成；所述吸水墊由吸水濾紙制成；所述包被膜由硝酸纖維素膜制成；所述載體蛋白為雞卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白；所述隱形檢測(cè)印跡上偶聯(lián)六價(jià)鋅離子的載體蛋白的包被量為I μ L/cm,載體蛋白濃度為lmg/mL ;隱形對(duì)照印跡上羊抗小鼠IgG抗體的包被量為luL/cm，抗體濃度為lmg/mL;所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡的排列方式為“ I
I”、“ + + ” 或“籲.”。
[0016]所述偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液是通過以下步驟制備的:
(1)稱取20mg載體蛋白溶于lmL、濃度為10mmoL/L、pH值為9.0的N_(2_羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸的緩沖液中，形成載體蛋白溶液；
(2)稱取IOmg金屬鰲合劑對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于ImL二甲基亞諷中，形成金屬鰲合劑溶液；
(3)取IOOuLDTPA溶液輕輕攪拌下逐滴滴加到0.5mL載體蛋白溶液中，用lOmol/L KOH調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫下反應(yīng)24h，形成DTPA-載體蛋白溶液；
(4)稱取IOOmg氯化鋅溶于100μ L濃硝酸中，加純水溶解得到終體積為lmL、濃度為733.7mmoL/L 的 Zn2+ 溶液；
(5)將Zn2+溶液加入到DTPA-載體蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，室溫孵育4h，用PBS透析10d，即形成Zn2+-DTPA -載體蛋白人工抗原，收集分裝，一 20°C凍存。
[0017]所述膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體是由以下方法制備的:
(1)單克隆抗體的制備:用Zn2+-DTPA-KLH免疫6周齡雌性BALB/C小鼠，劑量為20μδ/0.2mL/只，背部皮下分點(diǎn)注射；采用細(xì)胞融合技術(shù)，在PEG-1500作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，篩選后進(jìn)行有限稀釋克隆化，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并鑒定，獲得雜交瘤細(xì)胞株，之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備鋒尚子單克隆抗體；
(2)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,取膠體金溶液10mL，用0.1 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;取等量鋅離子單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清，將得到的沉淀物用每升含10 g BSA、0.5 g疊氮鈉、濃度為0.02 mol/L的Na2B407溶液稀釋，即獲得膠體金標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體，4 1:保存?zhèn)溆茫凰媚z體金溶液中金顆粒的粒徑為30 nm，每毫升膠體金中含有5 ng鋅離子的單克隆抗體。
[0018]本發(fā)明的鋅離子檢測(cè)試紙條/卡具有下列優(yōu)點(diǎn):
Φ特異性強(qiáng)，敏感性高。Zn2+-Strip以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體或多克隆
抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價(jià)鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對(duì)單克隆抗體或多克隆抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，該試紙條或卡具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，最低檢測(cè)限為I μ g/L，與其它金屬離子交叉反應(yīng)較小。
[0019](?簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)。使用Zn2+-StriP,無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操
作，只需將試紙條插入待檢樣品或?qū)⒋龣z樣品滴加在試紙卡上10-20秒，5分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0020]:|)結(jié)果顯示直觀、形象、準(zhǔn)確。Zn2+-Strip以顯示棕紅色線“ I ”和“ I I ”作為檢
測(cè)結(jié)果陽性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條棕紅色線“ I ”時(shí)，表示在被檢樣品中含有Zn2+，顯示兩條棕紅色線“ I I ”時(shí)，表示被檢樣品中不含Zn2+。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。
[0021]:3)本發(fā)明金標(biāo)試紙條的制備方法，制備出了鋅離子載體蛋白偶聯(lián)物，得到了適宜
分子結(jié)合比的人工免疫抗原和包被抗原，獲得了高效價(jià)、敏感、特異的抗血清；采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，反應(yīng)過程比較溫和，可在常溫和中性PH條件下進(jìn)行，易于操作和控制。
[0022]⑤本發(fā)明金標(biāo)試紙的制備方法，制備了抗鋅離子高效價(jià)、高親和力、特異性強(qiáng)的單克隆抗體，抗體腹水效價(jià)為1: 1.2X106，交叉反應(yīng)率小于0.01%，為鋅離子的痕量快速檢測(cè)提供了保障。
[0023]⑥適用范圍廣，節(jié)省費(fèi)用，便于推廣。使用Zn2+-Strip比儀器分析費(fèi)用低，適用范圍廣，可滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)檢驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)和加工企業(yè)和養(yǎng)殖場(chǎng)戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1、鋅離子檢測(cè)試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]圖2、鋅離子檢測(cè)試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖3、鋅離子檢測(cè)試紙卡俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖4、鋅離子檢測(cè)試紙卡剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]圖中，1:支撐板，2:樣品墊，3:金標(biāo)抗體結(jié)合墊，4:包被膜，5:隱形檢測(cè)印跡，6:隱形對(duì)照印跡，7:吸水墊，8-1:樣品端保護(hù)膜，8-2:手柄端保護(hù)膜，9:樣品標(biāo)記線，10:加樣孔，11:觀察窗，12:面板，13:固定槽，14:底座，15:凹槽。
【具體實(shí)施方式】[0029]以下用實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但是并不表示對(duì)本發(fā)明的任何限制，如沒有特別說明，其中的百分含量均為重量百分含量。
[0030]要制備檢測(cè)鋅離子金標(biāo)試紙條或試紙卡，首先要制備鋅離子人工免疫抗原，之后免疫Balb/c小鼠，制備抗鋅離子的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上組裝鋅離子金標(biāo)試紙條或試紙卡。
[0031 ] 實(shí)施例1、Zn2+人工抗原的合成
稱取20mg KLH，溶于ImL濃度為10mmoL/L、pH9.0的N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸緩沖液(HBS)中，形成KLH溶液。
[0032]稱取IOmg金屬鰲合劑對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)，溶于ImL二甲基亞颯(DMSO)中，形成金屬鰲合劑溶液；取160uL金屬鰲合劑溶液在輕輕攪拌下逐滴加入到ImL的KLH溶液中，用10mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫下反應(yīng)24h ;反應(yīng)產(chǎn)物用30Kd的超濾管純化，超濾管內(nèi)加入反應(yīng)產(chǎn)物超濾，超濾管先用10 mmoL/L、pH9.0 HBS沖洗3次，再用10 mmoL/L、pH7.4的HBS緩沖液洗2次，除去其中未反應(yīng)的小分子金屬鰲合劑。
[0033]取16 μ L濃度為733.7mmoL/L鋅溶液滴加到已反應(yīng)過的載體蛋白溶液中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其PH值至9.0，室溫?fù)u床反應(yīng)24小時(shí)，然后移入透析袋中透析10天。所得產(chǎn)物即為純化的鋅離子鰲合后的人工抗原Zn2+-DTPA-KIiL用蛋白核酸分析儀在280nm波長(zhǎng)下測(cè)定人工抗原中的蛋白濃度。
[0034]同法制得包被抗原Zn2+- DTPA-BSA或Zn2+-DTPA-OVA。反應(yīng)原理見以下反應(yīng)式。
【權(quán)利要求】
1.一種鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條，包括支撐板、樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊，試紙條兩端設(shè)有保護(hù)膜，其特征在于:所述樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜、吸水墊依次粘貼于支撐板上；金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體或多克隆抗體；包被膜上設(shè)有偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隱形對(duì)照印跡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是:所述支撐板為硬質(zhì)塑膠條或不吸水的硬紙條；所述樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊由玻璃纖維棉制成；所述吸水墊由吸水濾紙制成；所述包被膜由硝酸纖維素膜制成；所述載體蛋白為雞卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是:所述保護(hù)膜覆蓋在樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸水墊上，保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該樣品標(biāo)記線偏向樣品墊一側(cè)0.3-0.5cm處；隱形檢測(cè)印跡上偶聯(lián)六價(jià)鋅離子的載體蛋白溶液的包被量為luL/cm，載體蛋白濃度為lmg/mL ;隱形對(duì)照印跡上羊抗小鼠IgG抗體的包被量為I μ L/cm,抗體濃度為lmg/mL ;所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡的排列方式為“ I I ”、“ + + ”或“.?”。
4.權(quán)利要求1所述鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于:金標(biāo)試紙條制備步驟如下: (1)偶聯(lián)鋅離子載體蛋白溶液的制備: 稱取20mg載體蛋白溶于lmL、濃度為10mmoL/L、pH值為9.0的N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸的緩沖液中，形成載體蛋白溶液；稱取IOmg對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于ImL 二甲基亞颯中，形成金屬鰲合劑溶液；取IOOuL DTPA溶液在攪拌下逐滴加到0.5mL載體蛋白溶液中，用lOmol/L的KOH調(diào)節(jié)其pH至9.0，室溫反應(yīng)24h，形成DTPA-載體蛋白溶液；稱取IOOmg氯化鋅溶于100 μ L濃硝酸中，加純水溶解得到終體積為lmL、濃度為733.7mmoL/L 的 Zn2+ 溶液； 將Zn2+溶液加入到DTPA-載體蛋白溶液中，調(diào)節(jié)其pH值至7.4，室溫孵育4h，用PBS緩沖液透析10d，形成Zn2+-DTPA -載體蛋白人工抗原，收集分裝，一 20°C凍存； (2)單克隆抗體的制備:用Zn2+-DTPA-載體蛋白免疫6周齡BALB/C小鼠，采用細(xì)胞融合技術(shù)，在PEG-1500作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用ELISA法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并鑒定，制備雜交瘤細(xì)胞株，之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備鋅離子單克隆抗體； (3)金標(biāo)抗體制備: 將待標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,取膠體金溶液IOmL,用0.1mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;取等量鋅離子單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清,將所得沉淀用每升含10 g BSA、0.5 g疊氮鈉、濃度為0.02 mol/L的Na2B4O7溶液稀釋，即獲得膠體金標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體，4 °C保存?zhèn)溆茫? (4 )金標(biāo)抗體結(jié)合墊制備:按規(guī)格裁取玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體用單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37°C干燥lh，密封，4°C保存?zhèn)溆茫? (5)隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡的制備JfZn2+-DTPA-載體蛋白人工抗原放于單向噴點(diǎn)儀貯存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于貯存池B，開機(jī)分別點(diǎn)射于膜中央，形成間0.5cm的隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡，自然干燥，密封，4°C保存?zhèn)溆?；?6)試紙條組裝:將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊按順序依次粘貼于支撐板上，并在試紙條兩端的表面粘貼保護(hù)膜，在切槽機(jī)上切割成試紙條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:其中鋅離子單克隆抗體與膠體金溶液的標(biāo)記比為1: 5.2X 104，所得膠體金溶液中金顆粒的粒徑為30 nm;所含羊抗小鼠IgG溶液的濃度為0.34 μ g/mL。
6.一種鋅離子膠體金層析快速檢測(cè)試紙卡，包括殼體和位于殼體內(nèi)的試紙芯，試紙芯包括底層支撐板、樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊，其特征在于:所述樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、包被膜和吸水墊依次粘貼于底層支撐板上；金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體；所述包被膜上設(shè)有偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液印制的隱形檢測(cè)印跡，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隱形對(duì)照印跡。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試紙卡，其特征是:所述殼體由底座和面蓋構(gòu)成，底座和面蓋通過嵌合連在一起，底座上設(shè)有放置試紙芯的凹槽，面蓋上設(shè)有觀察窗、加樣孔，觀察窗與試紙芯的包被膜相對(duì)應(yīng)，加樣孔與試紙芯的樣品墊相對(duì)應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試紙卡，其特征是:所述支撐板為硬質(zhì)塑膠條或不吸水的硬紙條；所述樣品墊與金標(biāo)抗體結(jié)合墊由玻璃纖維棉制成；所述吸水墊由吸水濾紙制成；所述包被膜由硝酸纖維素膜制成；所述載體蛋白為雞卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白；所述隱形檢測(cè)印跡上偶聯(lián)六價(jià)鋅離子的載體蛋白的包被量為I μ L/cm，載體蛋白濃度為Img/mL ;隱形對(duì)照印跡上羊抗小鼠IgG抗體的包被量為I μ L/cm,抗體濃度為lmg/mL ;所述隱形檢測(cè)印跡和隱形對(duì)照印跡的排列方式為“ I I ”、“十十”或“籲籲”。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試紙卡，其特征在于:所述偶聯(lián)鋅離子的載體蛋白溶液是通過以下步驟制備的: (1)稱取20mg載體蛋白溶于lmL、濃度為10mmoL/L、pH值為9.0的N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸的緩沖液中，形成載體蛋白溶液； (2)稱取IOmg金屬鰲合劑對(duì)氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于ImL二甲基亞諷中，形成金屬鰲合劑溶液； (3)取IOOuLDTPA溶液輕輕攪拌下逐滴滴加到0.5mL載體蛋白溶液中，用lOmol/L KOH調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫下反應(yīng)24h，形成DTPA-載體蛋白溶液； (4)稱取IOOmg氯化鋅溶于100μ L濃硝酸中，加純水溶解得到終體積為lmL、濃度為733.7mmoL/L 的 Zn2+ 溶液； (5)將Zn2+溶液加入到DTPA-載體蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，室溫孵育4h，用PBS透析10d，即形成Zn2+-DTPA -載體蛋白人工抗原，收集分裝，一 20°C凍存。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的試紙卡，其特征在于:所述膠體金標(biāo)記的能識(shí)別鋅離子的單克隆抗體是由以下方法制備的: (1)單克隆抗體的制備:用Zn2+-DTPA-KLH免疫6周齡雌性BALB/C小鼠，劑量為20μδ/0.2mL/只，背部皮下分點(diǎn)注射；采用細(xì)胞融合技術(shù)，在PEG-1500作用下與NSO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA法進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選，篩選后進(jìn)行有限稀釋克隆化，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并鑒定，獲得雜交瘤細(xì)胞株，之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備鋒尚子單克隆抗體； (2)金標(biāo)抗體制備:將待標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體溶液10000r/min離心30min,取膠體金溶液10mL，用0.1 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至8.2 ;取等量鋅離子單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min, 10000r/min離心30min,棄上清，將得到的沉淀物用每升含10 g BSA、0.5 g疊氮鈉、濃度為0.02 mol/L的Na2B4O7溶液稀釋，即獲得膠體金標(biāo)記的鋅離子單克隆抗體，4 1:保存?zhèn)溆?；所得膠體金溶液中金顆粒的粒徑為30 nm， 每毫升膠體金中含有5 ng鋅離子的單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103472232SQ201310449633
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】王自良, 王愛萍, 范國(guó)英, 張海棠, 葛亞明, 王順崗, 李藝, 丁函 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院