Hplc法分析蛹蟲草子實體和殘基中有效物含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，包括首先進行腺苷和蟲草素標準溶液和蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基供試溶液的制備，然后在色譜柱為XBridgeTMC18(5μm,4.6x150mm)；流動相：甲醇、超純水，體積比為10:90；流速：1.0ml/min；進樣量：10μL(自動進樣)；柱溫：30℃；檢測波長：254nm條件下分別測定蛹蟲草子實體、固體培養(yǎng)殘基供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰。本發(fā)明方法簡便有效，特別適于分析人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基中的腺苷和蟲草素含量，具有很好的重復性和穩(wěn)定性。
【專利說明】HPLC法分析蛹蟲草子實體和殘基中有效物含量的方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及到分析化學領域，特別涉及一種用HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，該方法特別適用于分析人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基。
【背景技術】
[0002]蛹蟲草(又名北蟲草、北冬蟲夏草)子實體為麥角菌科蟲草屬真菌蛹草菌[Cordyc印smilitaris^Link)的干燥子座，是我國特有的名貴藥用真菌，具有擴張器官、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、降血壓、抗病原微生物、抗惡性腫瘤等多種藥理活性。腺苷、蟲草素等核苷類成分被作為蟲草質(zhì)量的主要參考指標。腺苷(CltlH13N5O4)全稱腺嘌呤核苷，是核酸的基本結(jié)構單位，它具有參與人體代謝和生理調(diào)節(jié)的功能。蟲草素(CltlH13N5O3)又稱蟲草菌素、3 '-脫氧腺苷，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等作用。
[0003]目前蛹蟲草的人工培植技術主要有液體發(fā)酵方式和以大米為基質(zhì)的固體培養(yǎng)方式等，目前由于固體培養(yǎng)方式所需投資較小，簡便易行，目前已在國內(nèi)許多地區(qū)應用。對于固體培養(yǎng)過程中的附屬產(chǎn)物-富含菌絲體的固體培養(yǎng)殘基，目前還沒有對其進行系統(tǒng)的開發(fā)利用，仍當作廢物扔棄，造成資源的浪費，而蛹蟲草在培植過程中固體培養(yǎng)殘基是干子實體量的3~3.5倍，在蛹蟲草子實體被采收后，仍有大量含有腺苷與蟲草素等有效成分的菌絲殘留在其中，因此對其進行開發(fā)研究是非常有必要的。
[0004]蛹蟲草作為一種藥食兩用的真菌，因品種產(chǎn)地，培養(yǎng)條件等原因，其中所含有效成分不盡相同。而蛹蟲草的固體培養(yǎng)殘基有大量菌絲殘留且成分復雜，其有效成分也有很大差異。蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量測定是蟲草產(chǎn)品質(zhì)量控制及代謝途徑研究的前提。目前，蛹蟲草及其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的含量測定還沒有統(tǒng)一的國標方法，因此確立一個簡便可靠的方法一次性進樣同時分析子實體與其固體培養(yǎng)殘基中的腺苷和蟲草素的含量具有現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，本發(fā)明的方法具有快速、準確測定蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量，有效控制人工培養(yǎng)蛹蟲草產(chǎn)品質(zhì)量的特點。
[0006]—種HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，包括以下步驟:
(I)腺苷和蟲草素標準溶液的制備和蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制
備;
腺苷和蟲草素標準溶液制備:稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品置于容器中，用水溶解并定容作為標準儲備液，加超純水將所述標準儲備液稀釋成若干不同濃度的腺苷和蟲草素標準溶液； 分別制備蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液:將蛹蟲草子實體烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品，加入提取液進行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草子實體供試溶液；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品，加入提取液進行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液；
(2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草子實體供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草子實體供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進樣量:10 μ L,自動進樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
[0007]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述腺苷和蟲草素標準溶液制備方法為:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品各4mg，準確到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標準儲備液，濃度記為80 μ g/ml ;然后將所述標準儲備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml> 10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml 的腺苷和蟲草素標準溶液。
[0008]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備方法為:將蛹蟲草子實體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩,精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾。本發(fā)明優(yōu)選，提取液為水。
[0009]本發(fā)明還提供一種可作為分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量標準的HPLC分析方法，包括以下步驟:
(I)腺苷和蟲草素標準溶液的制備和蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備；
腺苷和蟲草素標準溶液制備:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品各4mg，準確到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標準儲備液，濃度記為80 μ g/ml ；然后將所述標準儲備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標準溶液；
蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備:將蛹蟲草子實體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；
(2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草子實體供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草子實體供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進樣量:10 μ L,自動進樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
[0010]以上，所提到的腺苷和蟲草素標準溶液的制備、蛹蟲草子實體供試溶液、蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備不分先后。
[0011]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下:
本發(fā)明的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法簡便有效，特別適用于分析人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中的主要有效成分，即腺苷和蟲草素，有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明的方法為通過大量實驗所得到的切實可行的科學方法，具有很好的重復性和穩(wěn)定性，在實際應用中具有使用方便，快速、準確的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明實施例1的提取液中乙醇濃度對測得的腺苷和蟲草素含量的影響； 圖2為本發(fā)明實施例1中蟲草素的標準曲線；
圖3為本發(fā)明實施例1中腺苷的標準曲線；
圖4和圖5為應用本發(fā)明實施例1的方法對一個未知蛹蟲草樣品子實體和其固體培養(yǎng)殘基測定的色譜圖，其中圖4為蛹蟲草子實體樣品的色譜圖，圖5為蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基樣品的色譜圖。
【具體實施方式】
[0013]下方結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。
[0014]以下實施例中所用儀器和試劑為:
儀器:Waters e2695型高效液相色譜儀；Waters 2489紫外可見光檢測器；millinium工作站及empowerf數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司)；ΚΗ_700Ε型超聲波清洗器；Milli_Q超純水制備及分配儀；
供試品:蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基(上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院蟲草課題組培植)；
試劑:腺苷標準品(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)；蟲草素標準品(純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)；無水甲醇(JTBaker化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司)，色譜純；無水乙醇(中九科技有限公司)，分析純；超純水(經(jīng)Mill1-Q超純水制備及分配儀制備)；其它試劑均為分析純。
[0015]實施例1
本實施例中測試所用色譜條件為:色譜柱:由waters公司提供的XBridgeTM C18(5μ m, 4.6 X 150 mm)；流動相:甲醇:水的體積比為10:90 ；
檢測波長:254nm ；
流速:1.0ml/min ；
柱溫:30 V
進樣量:10 uL(自動進樣)。
[0016]本實施例中HPLC法分析蛹蟲草子實體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法包括如下步驟:
第一步、腺苷和蟲草素標準溶液的制備和蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制
備
腺苷和蟲草素標準溶液制備:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品各4mg，準確到0.0OOl g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標準儲備液，濃度記為80 μ g/ml ；然后將所述標準儲備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標準溶液；
蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備:將蛹蟲草子實體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；
第二步、分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草子實體供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草子實體供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18(5 μ m, 4.6 x 150mm);流動相:甲醇、超純水,體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進樣量:10 μ I,自動進樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
[0017]本實施例中首先對影響提取結(jié)果的因素進行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)提取和測定條件，并對本實施例的方法的精密度和靈敏度進行了評估。
[0018]首先對蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備過程中提取液的組成和比例進行了優(yōu)化選取，具體為:選取乙醇和/或水作為提取液，其中乙醇濃度分別為O %、20%、40 %、60 %、80 %> 100 %，不同提取液系統(tǒng)得到的同一樣品中腺苷和蟲草素含量結(jié)果見圖1，由圖可知，所測樣 品中腺苷和蟲草素的含量均隨著提取液中乙醇濃度的增大而明顯降低，當乙醇濃度為100 %時，腺苷和蟲草素含量極低，而當提取液為純水時，兩者的提取含量均為最高，因此，本發(fā)明優(yōu)選水為提取液。
[0019]其次，采用上述類似的方法對蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備過程中提取時間及溫度的優(yōu)化選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
當提取時間少于30 min時，所測腺苷含量隨提取時間的增加有較明顯的提高，當提取時間為40 min時，所測腺苷含量達到最大，為192.87 mg/100g ;隨提取溫度升高，所測腺苷含量有下降趨勢，這可能由于腺苷分子中羥基較多，在溫度較高的條件下，腺苷分子內(nèi)或分子間易形成氫鍵，導致分子結(jié)構發(fā)生變化所致?？傮w觀察發(fā)現(xiàn)，提取時間及溫度對所測蟲草素的影響均不大，并根據(jù)以上相關實驗結(jié)果，最終確定40 min為最佳時間，25°C為最佳提取溫度。
[0020]再次，采用上述類似的方法對蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備過程中超聲功率及提取次數(shù)進行了優(yōu)選，結(jié)果發(fā)現(xiàn):超聲功率改變對蟲草素的含量影響較小，但隨超聲功率的提聞，腺昔含量略有提聞，因此，本實驗優(yōu)選實驗儀器所能達到的最大超聲功率，此處為500 W ;而提取次數(shù)對蟲草素和腺苷的影響較小，本實驗結(jié)果表明:用水提取I次，提取40 min即可將腺苷和蟲草素提取完全，提取2次僅使腺苷和蟲草素分別增加了
0.044 %，2.32 %，因此一次提取即可滿足分析要求，優(yōu)選提取次數(shù)為一次。
[0021]此外，發(fā)明人還對本實施例方法的測試精密度進行了評估，方法如下:
質(zhì)量濃度為20 μ g/ml的腺苷和蟲草素標準溶液，過0.45 μ m微孔濾膜后注入進樣瓶并編號；連續(xù)進樣6次進行測試，計算得腺苷和蟲草素的RSD (relative standarddeviation (相對標準偏差))值分別為0.559 %、0.433 %，均小于2.0 %，證明采用本實驗方法對腺苷和蟲草素進行一次性定量分析時，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。
[0022]發(fā)明人還做了空白回收率實驗對本實施例方法的測試靈敏度進行了評估，具體如下:
取質(zhì)量濃度為20 μ g/ml的腺苷和蟲草素標準溶液，過0.45 μ m微孔濾膜后注入進樣瓶中，連續(xù)進樣3次，以標準曲線定量。測得腺苷和蟲草素的空白回收率平均值分別為99.06 %、99.11 %，說明色譜系統(tǒng)檢測靈敏度高，穩(wěn)定性好。
[0023]發(fā)明人還做了加標回收`率實驗以確定本實施例方法的加標回收效果，具體如下: 分別稱取蛹蟲草子實體、固體培養(yǎng)殘基干燥粉末0.25 g，分別放至50 mL具塞離心管
中，分別加入15 mL超純水，塞緊，分別超聲提取40 min，分別過濾至25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL、1.25mL 80ppm腺苷和蟲草素標準溶液,定容至25mL,分別過0.45 μ m微孔濾膜后分別注入進樣瓶中，編號，進樣分析，結(jié)果見下表:
子實體中腺苷回收率為91.92 %~95.82 %，平均回收率為93.67 %，RSD為2.1 % ;蟲草素回收率為88.28 %~92.43 %，平均回收率為90.57 %，RSD為2.3 %。
[0024]固體培養(yǎng)殘基中腺苷回收率89.50 %~95.75 %，平均回收率為92.18 %, RSD為3.5% ;蟲草素回收率為94.65 %~95.20 %，平均回收率為94.86 %，RSD為2.3 %。
[0025]以上結(jié)果說明該實驗方法加標回收效果較好，可用于蛹蟲草子實體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的含量測定。
[0026]此外，發(fā)明人還對本實施例方法的供試溶液穩(wěn)定性進行了實驗，具體為:采用上述優(yōu)化后的提取方法對某一樣品進行前處理，將提取得到的上清液分別在室溫下放置不同時間(O h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h),然后分別測定不同時間放置后的樣品中腺苷和蟲草素的含量。實驗發(fā)現(xiàn):在24 h內(nèi)，采用本實驗提取條件提取的溶液，其腺苷和蟲草素的含量保持相對穩(wěn)定，腺苷和蟲草素七次實驗的RSD值分別為4.61 %和0.56 %。
[0027]在蛹蟲草子實體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量在色譜柱中進行測試時，首先做出腺苷、蟲草素含量的標準曲線，方法如下:取配好的6個不同濃度的腺苷和蟲草素標準溶液(2 μ g/ml>5 μ g/ml> 10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml)潤旋振蕩充分混勻，用0.45μπι水相微孔濾膜過濾后直接注入進樣瓶。每個進樣重復3次，以濃度(yg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，作出測定腺苷、蟲草素含量的標準曲線，結(jié)果見圖2和圖3。
[0028]采用本實施例優(yōu)化后的方法對兩個未知供試樣品的蟲草素和腺苷含量進行了測定，具體如下:
采用優(yōu)化后的提取條件對某一人工培養(yǎng)的蛹蟲草樣品進行前處理，具體處理步驟及液相條件參照前面所述優(yōu)選條件。分別測定蛹蟲草子實體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷、蟲草素含量。測試方法為:吸取處理好的樣品供試溶液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾后注入進樣瓶中。所得子實體中腺苷和蟲草素含量和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的液相色譜圖分別如圖4和圖5所示。其中，子實體中腺苷和蟲草素的含量分別為52.993 mg/100g,10.189 mg/100g，平行處理3次，RSD值分別為2.087 %、1.131 % ;固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的含量分別為7.013 mg/100g, 19.340 mg/100g，平行處理3次，RSD值分別為6.78%、5.65 %。
[0029]本發(fā)明確立了一種高效液相色譜法一次進樣同時測定蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的方法，并對樣品提取條件進行了較全面的優(yōu)化。該方法主要有以下優(yōu)點:
1)樣品前處理簡單，經(jīng)水超聲，一次性提取即可；
2)回收率高、穩(wěn)定性好。子實體中腺苷和蟲草素的加標回收率分別為93.67 %、90.57%，重復測定的RSD分別為2.1 %、2.3 %(n=3);固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的加標回收率分別為92.18 %、91.62 %，重復測定的RSD分別為3.5 %、3.0 %(n=3)；
3)較已報道的分析方法，簡化了流動相的組成，尤其避免了緩沖鹽的使用對儀器的損傷，以甲醇和水為流動相等度洗脫，分析過程極其簡便。
[0030]這為今后蛹蟲草子實體中腺苷和蟲草素的分析提供了參考依據(jù)。
[0031]以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的【具體實施方式】。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應用，從而使所屬【技術領域】技術人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權利要求書及其全部范圍和等效物的限制。
【權利要求】
1.一種HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)腺苷和蟲草素標準溶液的制備和蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備； 腺苷和蟲草素標準溶液制備:稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品置于容器中，用水溶解并定容作為標準儲備液，加超純水將所述標準儲備液稀釋成若干不同濃度的腺苷和蟲草素標準溶液； 分別制備蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液:將蛹蟲草子實體烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品，加入提取液進行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草子實體供試溶液；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品，加入提取液進行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液； (2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草子實體供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草子實體供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18(5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進樣量:10 μ L,自動進樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
2.如權利要求1所述的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述腺苷和蟲草素標準溶液制備方法為:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品各4mg，準確到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標準儲備液，濃度記為80 μ g/ml ;然后將所述標準儲備液用超純水稀釋成2 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml>20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標準溶液。
3.如權利要求1所述的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述蛹蟲草子實體及其殘基供試溶液制備方法為:將蛹蟲草子實體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 5000 r/min的離心機中離心15min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾。
4.如權利要求3所述的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述提取液為水。
5.如權利要求4所述的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述超聲提取在25°C條件下提取40分鐘，提取一次。
6.—種HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法,其特征在于，包括以下步驟: (I)腺苷和蟲草素標準溶液的制備和蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備；腺苷和蟲草素標準溶液制備:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標準品各4mg，準確到0.0OOl g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標準儲備液，濃度記為80 μ g/ml ；然后將所述標準儲備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標準溶液； 蛹蟲草子實體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備:將蛹蟲草子實體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實體粉末樣品0.25 g于50ml離心管中，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾； (2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草子實體供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草子實體供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標準溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標準溶液色譜保留時間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進樣量:10 μ L,自動進樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
7.如權利要求6所述的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述提取液為水。
8.如權利要求7所述的HPLC法分析蛹蟲草子實體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述超聲提取在25°C條件下提取40分鐘，提取一次。
【文檔編號】G01N30/02GK103512975SQ201310424244
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權日:2013年9月17日
【發(fā)明者】周培, 支月娥, 樂昕, 詹學佳 申請人:上海交通大學