基于代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量判別的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別的方法。利用新鮮煙葉中蕓香苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量的比值對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉質(zhì)量進行判別，該法操作簡單快速、結(jié)果準確可靠，可為煙草代謝特征分析及相關(guān)煙草代謝組學(xué)研究提供借鑒。
【專利說明】基于代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量判別的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，是一種基于新鮮煙葉中的酷類物質(zhì)含量對代謝組學(xué)研 究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物代謝組學(xué)是通過考察植物受刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的 變化，來研究植物體系的一種技術(shù)。代謝物是基因調(diào)控的最終產(chǎn)物，是聯(lián)系基因型和生物表 型的紐帶，通過小分子代謝物的定性和定量分析可直接反映植物體當前的生理狀態(tài)。在植 物代謝組學(xué)研究中，要想得到真實客觀的定性定量分析數(shù)據(jù)，其樣品質(zhì)量極為重要，該與樣 品保存條件密切相關(guān)。對于不能在取樣后立刻提取代謝產(chǎn)物的植物樣品，通常建議超低溫 保存。超低溫保存是指在-8(TCW下的極低溫度環(huán)境下保存生物樣品，此法可大大減慢甚至 終止植物樣品的代謝和衰老過程，保持植物材料的穩(wěn)定性。
[0003] 作為最早開展植物次生代謝研究的模式植物之一，煙草的分子代謝特征及重要代 謝物的變化規(guī)律研究正逐漸受到關(guān)注。各種煙草祀向代謝組學(xué)及非祀向代謝組學(xué)研究技術(shù) 也正被逐漸開發(fā)及應(yīng)用。但由于煙草樣品保存不當而導(dǎo)致的質(zhì)量發(fā)生變化、代謝物水平不 能反映煙草樣品真實狀態(tài)的情況時有發(fā)生。急需一種簡單、快速的分析方法對植物代謝組 學(xué)研究中的煙草樣品質(zhì)量進行判別。
[0004] 酷類化合物是植物中分布最廣泛的次生代謝產(chǎn)物之一，主要由單寧類、黃麗類、香 豆素類物質(zhì)組成?？犷惢衔锞哂姓{(diào)節(jié)自身生長、抗病毒、抗逆等生理功能，煙草中的酷類 化合物在煙草的生長、煙草病毒的防治、煙葉的調(diào)制、分級及卷煙香氣等方面都起著重要作 用。近年來有關(guān)煙草中酷類化合物的提取、檢測等方法的報道也是層出不窮，但未曾有人提 出將新鮮煙葉中的酷類物質(zhì)含量或含量比值用于代謝組學(xué)新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判別。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別的方 法。利用新鮮煙葉中蕓香巧與山奈酷-3-0-蕓香糖巧(簡稱山奈酷巧)含量的比值對代謝組 學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別，該法操作簡單快速、結(jié)果準確可靠。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明技術(shù)方案為：
[0007] 基于代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量判別的方法；通過檢測新鮮煙葉中蕓香 巧與山奈酷-3-0-蕓香糖巧(簡稱山奈酷巧)含量，計算其比值，對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙 葉樣品質(zhì)量進行判別。
[0008] 其具體方法為；1)稱取一定量的新鮮煙葉樣本，加入含內(nèi)標的提取溶劑，超聲 10-20分鐘后離也，將上清液移至進樣瓶中用于HPLC分析。
[0009] 2) HPLC分析方法的具體參數(shù)；色譜柱SymmetiT C18 (5 y m4. 6mmX250mm);柱溫 3(TC;檢測波長340nm ;進樣量5 y L ;柱流量1. OmL/min ;流動相A為含體積濃度10%甲醇的 水溶液(含體積濃度2%己酸)，流動相B為含體積濃度10%水的甲醇溶液(含體積濃度2%己 酸）；洗脫梯度；Omin 時 90/10 (A/B，V/V)，15min 時 70/30 (A/B，V/V)，26min 時 10/90 (A/B, V/V)并保持 2min，28. Imin 時 90/10 (A/B，V/V)，隨后保持起始梯度 90/10 (A/B，V/V)至 35min ;其中0-15min為第一段線性梯度洗脫、15-26min為第二段線性梯度洗脫。
[0010] 所述內(nèi)標為牡荊黃素，其含量為0. 012g/L，所述提取溶劑為含甲醇60-90%的水溶 液，所述煙草鮮葉與含內(nèi)標的提取溶劑按質(zhì)量（mg) /體積（mL)比加入量為=25:1-3。
[0011] 采用高效液相色譜法（WLC)對新鮮煙葉樣品中的蕓香巧及山奈酷巧進行絕對定 量分析，分析步驟如下：
[0012] HPLC分析數(shù)據(jù)可定性新鮮煙葉中的蕓香巧及山奈酷巧，通過繪制標準曲線可對 所測定的蕓香巧、山奈酷巧進行絕對定量；將蕓香巧與山奈酷巧含量的比值作為區(qū)分代 謝組學(xué)合格樣品、變質(zhì)的不合格樣品及部分變質(zhì)的不合格樣品的標準，即待測品種中蕓香 巧與山奈酷巧含量的比值在6. 4及W上的為合格樣品，可用于代謝組學(xué)分析，蕓香巧與山 奈酷巧含量的比值在2.0 W下的為變質(zhì)的不合格樣品，蕓香巧與山奈酷巧含量的比值在 2. 0-6. 4之間的為部分變質(zhì)的不合格樣品。
[0013] 本發(fā)明研究人員經(jīng)過大量新鮮煙葉樣品的分析研究，發(fā)現(xiàn)新鮮煙葉如果保存不 當，其酷類物質(zhì)的含量會發(fā)生較大變化，蕓香巧與山奈酷-3-0-蕓香糖巧(簡稱山奈酷巧)含 量的比值也會明顯降低，此類樣品將不能用于代謝組學(xué)分析。因此可WW蕓香巧與山奈酷 巧含量的比值作為一個標準對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別。本發(fā)明的優(yōu) 點
[0014] 本發(fā)明研究人員利用新鮮煙葉樣品中蕓香巧與山奈酷-3-0-蕓香糖巧(簡稱山奈 酷巧)含量的比值和樣品質(zhì)量的相關(guān)性，對代謝組學(xué)新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別。本發(fā)明具 有W下特點：1)操作簡單快速；2)結(jié)果準確可靠；3)樣品用量少；4)適用于不同生育期的 新鮮煙葉。本方法可為煙草代謝特征分析及相關(guān)煙草代謝組學(xué)研究提供借鑒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1實施例2中煙葉樣品的蕓香巧與山奈酷巧含量比值。

【具體實施方式】
[0016] 下面實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā) 明。
[0017] 蕓香巧(俗稱蘆下）和山奈酷-3-0-蕓香糖巧(簡稱山奈酷巧）是植物中廣泛存在 的兩種酷類物質(zhì)，分子量分別為610. 15和594. 15。為得到酷類物質(zhì)的絕對含量，本實驗采 用高效液相色譜法（HPLC)及內(nèi)標法對新鮮煙葉樣品中的蕓香巧和山奈酷巧進行絕對定量 分析。分析步驟如下：
[0018] 1)稱取一定量的新鮮煙葉樣本，加入含內(nèi)標牡荊黃素（〇.〇12g/L)的提取溶劑(含 甲醇60-90%的水溶液)，超聲10-20分鐘后離也，將上清液移至進樣瓶中用于HPLC分析。
[0019] 2) HPLC分析方法的具體參數(shù)；色譜柱SymmetiT C18 (5 y m4. 6mmX250mm);柱溫 3(TC;檢測波長340nm ;進樣量5 y L ;柱流量1. OmL/min ;流動相A為含體積濃度10%甲醇的 水溶液(含體積濃度2%己酸)，流動相B為含體積濃度10%水的甲醇溶液(含體積濃度2%己 酸）;洗脫梯度；Omin 時 90/10 (A/B，V/V)，15min 時 70/30 (A/B，V/V)，26min 時 10/90 (A/B, v/v)并保持 2min，28. Imin 時 90/10 (A/B，V/V)，隨后保持起始梯度 90/10 (A/B，V/V)至 35min ;其中0-15min為第一段線性梯度洗脫、15-26min為第二段線性梯度洗脫。
[0020] 采用標準曲線法可對所測定的酷類物質(zhì)進行絕對定量。
[00川 實施例1
[0022] 采用HPLC方法測定新鮮煙葉樣品中的酷類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)褐化樣品的大部分酷 類物質(zhì)含量顯著降低，蕓香巧與山奈酷-3-0-蕓香糖巧(簡稱山奈酷巧）含量的比值也明顯 降低。
[0023] 待測樣品包括福建、貴州、湖南等省份的7個品種、21個產(chǎn)地的不同生育期新鮮煙 葉樣品243份(每個點有5-7個生物學(xué)重復(fù))。其中包括208份合格樣品(樣本在采集、運送 及預(yù)處理過程中均嚴格控制在-8(TC )，24份褐變樣品（由于儲運過程中液氮不足等原因已 完全褐變)，11份樣品已知保存不當，但外觀無明顯變化。
[0024] 樣品分析步驟如下所述：
[002引 1)稱取25mg新鮮煙葉樣本，加入2血含內(nèi)標牡荊黃素0. 012g/L的提取溶劑冷甲 醇80%的水溶液)，超聲20分鐘后離也，將上清液移至進樣瓶中用于HPLC分析。
[0026] 2) HPLC分析方法的具體參數(shù)；色譜柱SymmetiT C18 (5 y m4. 6mmX250mm);柱溫 3(TC;檢測波長340nm ;進樣量5 y L ;柱流量1. OmL/min ;流動相A為含體積濃度10%甲醇的 水溶液(含體積濃度2%己酸)，流動相B為含體積濃度10%水的甲醇溶液(含體積濃度2%己 酸）;洗脫梯度；Omin 時 90/10 (A/B，V/V)，15min 時 70/30 (A/B，V/V)，26min 時 10/90 (A/B, V/V)并保持 2min，28. Imin 時 90/10 (A/B，V/V)，隨后保持起始梯度 90/10 (A/B，V/V)至 35min ;其中0-15min為第一段線性梯度洗脫、15-26min為第二段線性梯度洗脫。
[0027] 繪制了蕓香巧（1-400 yg/mL)與山奈酷巧（1-100 yg/mL)的標準曲線。W目標物 峰面積與內(nèi)標物(牡荊黃素）峰面積的比值為縱坐標Y，質(zhì)量濃度X ( y g/mL)為橫坐標，計 算其標準曲線及相關(guān)系數(shù)，測定結(jié)果如下；Ys=〇. 0387X-0. 0045，Y山=0. 0321X-0. 0082,相關(guān) 系數(shù)分別為0. 9998和0. 9999。
[0028] 在上述條件下獲得了 243份新鮮煙葉中蕓香巧與山奈酷巧等(說明書中是可W說 等的）8種酷類物質(zhì)的絕對含量，發(fā)現(xiàn)蕓香巧與山奈酷巧含量的比值變化顯著，詳細數(shù)據(jù)見 表1。
[0029] 表1實施例1中煙葉樣品信息及蕓香巧與山奈酷巧含量的比值
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 基于代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量判別的方法，其特征在于：通過檢測新鮮 煙葉中蕓香苷與山奈酚-3-0-蕓香糖苷(簡稱山奈酚苷)含量，計算其比值，對代謝組學(xué)研究 中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進行判別。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述判別方法，其特征在于：其具體方法為：1)稱取新鮮煙葉樣本， 加入含內(nèi)標的提取溶劑，超聲10-20分鐘后離心，將上清液移至進樣瓶中用于HPLC分析； 2. HPLC分析方法的具體參數(shù)：色譜柱Symmetry C18 (5 iim4.6mmX 250mm);柱溫30°C; 檢測波長340nm ;進樣量5 y L ;柱流量1. OmL/min ;流動相A為含體積濃度10%甲醇的水溶 液(含體積濃度2%乙酸)，流動相B為含體積濃度10%水的甲醇溶液(含體積濃度2%乙酸）； 洗脫梯度：〇min 時 90/10 (A/B，V/V)，15min 時 70/30 (A/B，V/V)，26min 時 10/90 (A/B，V/V) 并保持 2min 至 28min，28. lmin 時 90/10 (A/B，V/V)，隨后保持起始梯度 90/10 (A/B，V/V) 至35min ;其中0-15min為第一段線性梯度洗脫、15-26min為第二段線性梯度洗脫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述判別方法，其特征在于：所述內(nèi)標為牡荊黃素，其含量為 0. 012g/L提取溶劑，所述提取溶劑為含體積濃度甲醇60-90%的水溶液，所述新鮮煙葉與含 內(nèi)標的提取溶劑按質(zhì)量（mg) /體積（mL)比加入量為=25:1-3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于：采用高效液相色譜法（HPLC)對新鮮煙 葉樣品中的蕓香苷及山奈酚苷進行絕對定量分析，分析步驟如下： HPLC分析數(shù)據(jù)可定性新鮮煙葉中的蕓香苷及山奈酚苷。通過測定一系列已知質(zhì)量濃 度(橫坐標X軸)的目標物峰面積，用其峰面積與內(nèi)標物牡荊黃素的峰面積比值作為Y軸(縱 坐標)繪制相應(yīng)的標準曲線。通過標準曲線可對待測樣品中的蕓香苷、山奈酚苷進行絕對定 量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述判別方法，其特征在于：將蕓香苷與山奈酚苷質(zhì)量含量的比值 作為區(qū)分代謝組學(xué)合格樣品、變質(zhì)的不合格樣品及部分變質(zhì)的不合格樣品的標準，即待測 品種中蕓香苷與山奈酚苷含量的比值在大于6. 4的為合格樣品，可用于代謝組學(xué)分析，蕓 香苷與山奈酚苷含量的比值在小于2.0的為變質(zhì)的不合格樣品，蕓香苷與山奈酚苷含量的 比值在2. 0-6. 4之間的為部分變質(zhì)的不合格樣品。
【文檔編號】G01N30/02GK104422742SQ201310401539
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】趙春霞, 沈丹紅, 路鑫, 常玉瑋, 張俊杰, 趙燕妮, 許國旺 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所