快速檢測氟羅沙星的免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速檢測氟羅沙星的免疫層析試紙及其制備方法。該免疫層析試紙底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中纖維素膜層上有用偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白溶液印制的檢測印跡，用羊抗小鼠IgG抗體溶液印制的對照印跡，金標抗體為膠體金標記的氟羅沙星單克隆抗體。本發(fā)明的免疫層析試紙主要用于食品中氟羅沙星的快速檢測，結(jié)構(gòu)簡單，特異性強，靈敏度和準確度高，操作簡便，適用范圍廣，價格低廉，易于推廣應用，具有較好的社會和經(jīng)濟價值。
【專利說明】快速檢測氟羅沙星的免疫層析試紙及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫化學檢測領(lǐng)域，涉及一種快速檢測氟羅沙星殘留的免疫膠體金免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氟羅沙星（Fleroxacin,FLE）其化學名為6，8-二氟-1-(2_ 氟乙基)1，4_ 二氫-7- (4-甲基-1-哌嗪基)-4-氧-3-喹啉羧酸，分子式為C17H18F3N3O3,分子量為369.34，為廣譜類抗菌藥物，特別是對革蘭氏陰性菌有很強的抗菌活性，具有用量少，抗菌效果好等優(yōu)點。但其對人體有一定的毒副作用，主要包括胃腸道反應、肝腎毒性以及肌肉骨骼等副作用。我國農(nóng)業(yè)部制定的《2013年度動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃》中明確規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的殘留監(jiān)控指標以及最大殘留限量。盡管我國獸藥殘留限量參照國際和發(fā)達國家標準制定，并且獸藥使用都有休藥期規(guī)定，但從根本上解決動物性食品獸藥殘留超標問題仍存在較大難度。因此急需建立快速、靈敏、有效的氟羅沙星殘留檢測方法。
[0003]目前國內(nèi)外檢測氟羅沙星殘留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(GC/MS)等，這些方法檢測非常有效、準確和敏感，但也存在一定的缺陷，如待檢測樣品預處理過程復雜，繁瑣費時；需要昂貴的儀器設(shè)備，推廣使用受到一定限制；對專業(yè)人員素質(zhì)要求高；儀器保養(yǎng)要求高，保養(yǎng)的好壞直接影響分析結(jié)果的準確性；檢測費用高，無法進行現(xiàn)場檢測和大規(guī)模批量檢測，時效性較差。
[0004]免疫學檢測法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測物的初步信息，該法靈敏度較高，精確性好，分析過程相對簡單，用作氟羅沙星篩查有獨特優(yōu)勢，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測技術(shù)，急待研究解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:提供一種特異性強、靈敏度高、操作簡便、精準快速的用于檢測氟羅沙星殘留的免疫層析試紙及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種快速檢測氟羅沙星的免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白印制的檢測印跡和用羊抗小鼠IgG抗體印制的對照印跡；所述金標抗體纖維層中的金標抗體為膠體金標記的抗氟羅沙星單克隆抗體。
[0007]所述偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白是通過以下方法得到的:
將5.3 mg氟羅沙星、3.1 mg DCC和1.7 mg NHS先后溶于1.0 mL DMF溶液中，室溫避光攪拌4 h，充分反應后得到A液；稱取9.5 mg BSA溶于2 mL PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，40C反應9 h后用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，I&藏于_20°C,備用。
[0008]所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
[0009]所述吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜、尼龍膜、玻璃纖維棉或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標抗體纖維層用吸附氟羅沙星的金標抗體玻璃纖維棉制成。
[0010]所述偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白。
[0011]所述檢測印跡和對照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、“丁 丁”字型排列印跡、“丄丄”字型排列印跡、“ h卜，，字型排列印跡或“~1 H，，字型排列印跡。
[0012]在吸附纖維層、金標抗體纖維層和吸水材料層上覆蓋有保護膜，在吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向吸附纖維層一側(cè)0.3-0.6cm處印制有樣品標記線。
[0013]所述快速檢測氟羅沙星免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟:
(O氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物的制備
將5.3 mg氟羅沙星、3.1 mg DCC和1.7 mg NHS先后溶于1.0 mL DMF溶液中，室溫避光攪拌4 h，充分反應后得到A液；稱取9.5 mg BSA溶于2 mL PBS緩沖液中，得到B液；室溫磁力攪拌下將A液逐滴加入B液中，40C反應9 h，用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，I&藏于_20°C,備用；
(2)抗氟羅沙星單克隆抗體的制備；
(3)氟羅沙星金標抗體的制備；
(4)羊抗小鼠IgG抗體的制備；
用所得的氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物在纖維素膜層上制成檢測印跡，用羊抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制備對照印跡；氟羅沙星金標抗體用于制備金標抗體纖維層，然后依次將支撐層、吸附層和保護層組裝成免疫層析試紙。
[0014]本發(fā)明的免疫層析試紙具有以下優(yōu)點:
Φ特異性強，靈敏度高。本發(fā)明免疫層析試紙以膠體金標記高親和力的單克隆抗體
為基礎(chǔ)制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標記對單克隆抗體的特異性及親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，免疫層析試紙具有較強的特異性和較高的靈敏度，可檢測到15 ng/g的微量氟羅沙星。本發(fā)明在保障食品安全、保護消費者健康方面具有極其重要的意義。
[0015]if;簡便、快速。使用本發(fā)明免疫層析試紙，無需其它任何試劑和儀器，可現(xiàn)場操
作。只需將免疫層析試紙插入被檢樣品中10?20秒鐘，取出后5分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果O
[0016]S結(jié)果顯示形象、直觀、準確。免疫層析試紙以顯示棕紅色“ I ”(或“十”、“τ”、
“丄”、“”)印跡作為檢測結(jié)果陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“ I ”
印跡，表示被檢樣品中含有氟羅沙星，顯示兩條棕紅色“ I I ”印跡，表示被檢樣品中不含氟羅沙星。結(jié)果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。
[0017]Φ節(jié)省費用。使用快速檢測免疫層析試紙，無需另配儀器設(shè)備和其它試劑，可隨時隨地進行檢測，費用低廉，能節(jié)省大量貴重儀器和設(shè)備費用。
[0018]:言；適用范圍廣，便于推廣應用。操作簡便，能滿足不同層次人員的需要，該免疫層析試紙具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟效益以及社會效益。
[0019]⑥存儲方便，保質(zhì)期長。免疫層析試紙存儲方便，且其對存儲溫度要求不高，在4-8°C下有效期可保持一年，室溫下有效保質(zhì)期可達到六個月。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021]圖2為圖1試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖中，I為支撐層，2為吸附纖維層，3為金標抗體纖維層，4為纖維素膜層，5為吸水材料層，6為檢測印跡，7為對照印跡，8-1為測試端保護膜，8-2為手柄端保護膜，9為樣品標記線。
【具體實施方式】
[0023]實施例一:快速檢測微量氟羅沙星的免疫層析試紙及制備方法，參見圖1、圖2。圖中支撐層I用塑膠薄片條制成，吸附纖維層2用玻璃纖維棉制成，金標抗體纖維層3上吸附有抗氟羅沙星的單克隆抗體，纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜，吸水材料層5用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層從右至左依次粘貼固定在支撐層I上，彼此交界處纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層4上設(shè)有檢測印跡6和對照印跡7，檢測印跡用偶聯(lián)氟羅沙星的牛血清白蛋白(BSA)溶液印制而成，對照印跡用羊抗小鼠IgG抗體溶液印制，兩條印跡平行排列形成印跡帶“ I I ”。8-1為覆蓋在吸附纖維層2和金標抗體纖維層3上面的測試端保護膜(白色)，8-2為覆蓋在吸水材料層5上面的手柄端保護膜(如黃色)，9為樣品標記線，即在吸附纖維層2與金標抗體纖維層3交界處，對應的白色保護膜偏向吸附纖維層2 —側(cè)約0.5cm處印制的標記線，在樣品標記線右側(cè)的保護膜上印有箭頭及max字樣。
[0024]待測樣品溶液的制備及檢測步驟:
檢測雞肌肉:將樣品切成塊，搗碎，4000r/min離心5min，吸取上層汁液作為待測樣品；操作方法:將免疫層析試紙測試端插入待測樣品中，插入深度不超過標記線，約10?20秒鐘取出免疫層析試紙，水平放置，5分鐘內(nèi)觀察并判定檢測結(jié)果。
[0025]結(jié)果判定:(a)陽性如果在纖維素膜層上顯示一條棕紅色印跡帶“ I ”，表示檢測結(jié)果為陽性，說明待測樣品含有氟羅沙星；(b)陰性如果在纖維素膜層上顯示兩條棕紅色印跡帶“I I ”，檢測結(jié)果為陰性，說明待測樣品中不含氟羅沙星；(C)失效如果在纖維素膜層上沒有棕紅色帶顯示，則表明免疫層析試紙已失效。
[0026]本發(fā)明的敏感性和檢測限檢測:配制共8個濃度為0、5、10、15、20、40、80和leopg/L的氟羅沙星標準溶液，按照檢測試紙操作要求進行檢測，每個濃度設(shè)6個重復，根據(jù)試驗結(jié)果判斷檢測試紙的敏感性和檢測限。試驗結(jié)果表明，本試紙檢測限為15ng/g。
[0027]要制成快速檢測微量氟羅沙星免疫層析試紙，首先制備偶聯(lián)氟羅沙星載體蛋白和氟羅沙星金標抗體，從而制備檢測印跡和金標抗體纖維層；其次制備羊抗小鼠IgG抗體，用于制備對照印跡。
[0028](I)氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物抗原的制備
采用DCC法，將氟羅沙星與載體蛋白進行偶聯(lián)，制備人工合成抗原，其具體步驟為:準確稱取5.3 mg氟羅沙星、3.1 mg DCC (N，N’- 二環(huán)己基碳二亞胺)和1.7 mg NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，先后溶于1.0 mL DMF溶液中，室溫避光攪拌4 h，進行充分的化學反應，反應液為A液；稱取9.5 mg BSA溶于2 mL PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，4°C反應9 h后用PBS透析3天，換液3次/天,透析完成后,4000rpm離心5min,取上清液，得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，貯藏于_20°C，備用；
(2)抗氟羅沙星單克隆抗體的制備
單抗制備:用制備的氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物以3(-g-5(-g/只的用量免疫6-8周齡Balb/C小鼠3-4次，每次免疫間隔時間3-5周，確定抗體效價符合要求后進行超強免疫，并在融合之前檢測其抑制價，之后3-4天將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽性血清；脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5-IOmin消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼龍紗布過濾，IOOOrpm離心lOmin，收集脾細胞。將I X IO8的脾細胞與NSO骨髓瘤細胞按10:1的比例混合，IOOOrpm離心IOmin棄上清，將細胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入0.7-1.0mL的50%PEG4000, Imin內(nèi)加完，前30秒加0.1-0.3mL，中間15秒加0.2-
0.4mL，最后15秒加完；然后緩緩加入無血清1640培養(yǎng)基15mL，以終止PEG的作用，37°C水浴5-10 min, IOOOrpm離心IOmin棄上清,將細胞沉淀物重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細胞培養(yǎng)板中(8-10塊)，ΙΟΟμ?-200μ?7孔，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10-14天，用間接ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3-6次有限稀釋克隆化(直到細胞克隆為單克隆，檢測各個克隆孔效價、抑制價基本一致)，而后擴大培養(yǎng)，建立雜交瘤細胞株。所制備的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體可特異地與氟羅沙星反應，親和力常數(shù)達到IOic1-1O12,輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgGpIgG2a> IgG2b> IgG3,針對氣羅沙星特異抗原決定旗的單克隆抗體,用于制備金標抗體玻璃纖維棉。
[0029](3)氟羅沙星金標抗體和金標抗體玻璃纖維棉的制備
采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液。在沸騰的200mL 0.01-0.02%氯金酸溶液中加入新鮮配制的I %檸檬酸鈉 8mL，獲得直徑約15nm的膠體金溶液，用0.lmol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值至8.5-9.5，置于2-8°C保存?zhèn)溆谩Ｒ?:2000的標記比將待標記的氟羅沙星單克隆抗體加入PH8.5-9.5的金溶膠中，標記IOmin后，加入20%的PEG10000至終濃度為0.05%, 4°C、1500-3000rpm離心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000rpm離心lh，棄上清，獲初步純化的金標抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進行分離純化，獲得氟羅沙星膠體金標記抗體。將1:100-500稀釋的膠體金標記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，4°C低溫真空干燥，制備氟羅沙星金標抗體玻璃纖維棉。
[0030](4)氟羅沙星免疫層析試紙的檢測反應原理
當氟羅沙星免疫層析試紙的測試端插入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測氟羅沙星及金標抗體玻璃纖維棉中的金標抗體一起向纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴散過程中，待測氟羅沙星可與金標抗體纖維層中的金標抗體相結(jié)合，進而封閉金標抗體上氟羅沙星的抗原結(jié)合點，阻止金標抗體與纖維素膜上偶聯(lián)氟羅沙星載體蛋白的檢測印跡結(jié)合，免疫層析試紙上無法顯示檢測印跡，而羊抗小鼠IgG抗體則可與金標抗體結(jié)合，形成棕紅色對照印跡帶“ I ”，即一條棕紅色帶“ I ”印跡為陽性表示。反之樣品溶液中若無氟羅沙星，則不能阻止金標抗體與纖維素膜上偶聯(lián)氟羅沙星載體蛋白的檢測印跡結(jié)合，免疫層析試紙顯示棕紅色檢測印跡帶“ I ”;同樣羊抗抗小鼠IgG抗體也能與金標抗體結(jié)合，顯示棕紅色對照印跡帶“ I ”，形成兩條棕紅色帶“ I I ”為陰性表示。如果纖維素膜上沒有棕紅色帶顯示，則表明免疫層析試紙已失效。
[0031]實施例二:免疫層析試紙和實施例一基本相同，不同之處在于:吸附纖維層用尼龍膜制成，纖維素膜層采用純纖維素膜，檢測印跡帶和隱形對照印跡帶均為“十”，覆蓋在吸水材料層上面的手柄端保護膜為蘭色。
待測樣品為雞肝，可將樣品切成塊，搗碎，然后進行離心，4000r/min離心5min，吸取上層汁液作為待測樣品；
結(jié)果判定:(a)陽性如果在纖維素膜上顯示有一條棕紅色印跡帶“十”，表示檢測結(jié)果為陽性，說明在待測樣品中含有氟羅沙星；(b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條棕紅色印跡帶“十”，表示檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中不含氟羅沙星；(c)失效如果在纖維素膜上沒有棕紅色帶顯示，則表明免疫層析試紙已失效。
[0032]實施例三:免疫層析試紙和實施例一基本相同，不同之處在于:吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)制成，偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(OVA)，隱形對照印跡帶用羊抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上印跡制成，纖維素膜層采用羧化纖維素膜，覆蓋在吸水材料層上面的手柄端保護膜為綠色，檢測印跡和對照印跡帶均為“T”。
[0033]結(jié)果判定:(a)陽性如果在纖維素膜上顯示有一條棕紅色印跡帶“τ”，表示檢測結(jié)果為陽性，說明在待測樣品中含有氟羅沙星；(b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條棕紅色印跡帶“T”，表示檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中不含氟羅沙星；(C)失效如果在纖維素膜上沒有棕紅色帶顯示，則表明免疫層析試紙已失效。檢測樣品和制備、操作方法同實施例一。
[0034]實施例四:免疫層析試紙和實施例一基本相同，不同之處在于:吸附纖維層用聚酯膜制成，纖維素膜層采用羧化纖維素膜，偶聯(lián)氟羅沙星載體蛋白溶液為血藍蛋白(KLH)。檢測印跡和隱形對照印跡均為“I”。制備、操作方法和結(jié)果判定方法同實施例一。
[0035]實施例五:免疫層析試紙結(jié)構(gòu)和實施例一基本相同，不同之處在于:隱形對照印跡帶用羊抗鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上印跡制成，吸附纖維層用尼龍膜制成。檢測印跡帶和隱形對照印跡帶均為“ P’。制備、檢測樣品、結(jié)果判定和操作方法同實施例一。
[0036]實施例六:和實施例一基本相同，不同之處在于:氟羅沙星金標抗體纖維層吸附有抗氟羅沙星單克隆抗體，檢測樣品為雞肝。檢測印跡帶和隱形對照印跡帶均為”。
[0037]實施例七:和實施例一基本相同，不同之處在于:氟羅沙星金標抗體纖維層吸附有抗氟羅沙星多克隆抗體，檢測樣品為雞肝。
[0038]實施例八:和實施例一基本相同，不同之處在于:偶聯(lián)氟羅沙星載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(0VA)，檢測樣品、結(jié)果判定和操作方法同實施例一。
[0039]實施例九:和實施例一基本相同，不同之處在于:偶聯(lián)氟羅沙星載體蛋白溶液為血藍蛋白(KLH)，檢測樣品、結(jié)果判定和操作方法同實施例一。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測氟羅沙星的免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，其特征是:吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白印制的檢測印跡和用羊抗小鼠IgG抗體印制的對照印跡；所述金標抗體纖維層中的金標抗體為膠體金標記的抗氟羅沙星單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是:所述偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白是通過以下方法得到的: 將5.3 mg氟羅沙星、3.1 mg DCC和1.7 mg NHS先后溶于1.0 mL DMF溶液中，室溫避光攪拌4 h，充分反應后得到A液；稱取9.5 mg BSA溶于2 mL PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，40C反應9 h后用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，I&藏于_20°C,備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是:所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是:所述吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜、尼龍膜、玻璃纖維棉或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標抗體纖維層用吸附氟羅沙星的金標抗體玻璃纖維棉制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是:所述偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是:所述檢測印跡和對照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、“
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是:在吸附纖維層、金標抗體纖維層和吸水材料層上覆蓋有保護膜，在吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向吸附纖維層一側(cè)0.3-0.6cm處印制有樣品標記線。
8.權(quán)利要求1所述快速檢測氟羅沙星免疫層析試紙的制備方法，其特征是:該方法包括以下步驟: (1)氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物的制備 將5.3 mg氟羅沙星、3.1 mg DCC和1.7 mg NHS先后溶于1.0 mL DMF溶液中，室溫避光攪拌4 h，充分反應后得到A液；稱取9.5 mg BSA溶于2 mL PBS緩沖液中，得到B液；室溫磁力攪拌下將A液逐滴加入B液中，40C反應9 h，用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，I&藏于_20°C,備用； (2)抗氟羅沙星單克隆抗體的制備； (3)氟羅沙星金標抗體的制備； (4)羊抗小鼠IgG抗體的制備； 用所得的氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物在纖維素膜層上制成檢測印跡，用羊抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制備對照印跡；氟羅沙星金標抗體用于制備金標抗體纖維層，然后依次將支撐層、吸附層和保護層組裝成免疫層析試紙。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是:所述氟羅沙星金標抗體的制備方法如下: 沸騰的200mL 0.01?0.02%氯金酸溶液中加入新蘚配制的I %檸檬酸鈉8mL，獲得直徑15-20nm的膠體金溶液，用0.lmol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值至8.5?9.5，置2?8°C保存，備用；以1:2000的標記比將待標記的氟羅沙星單克隆抗體加入pH 8.5?9.5的金溶膠中，標記 IOmin 后，加入 20 % 的 PEG10000 至終濃度為 0.05 %，4°C、1500 ?3000rpm 離心 20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000rpm離心Ih,棄上清,獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進行分離純化，獲得膠體金標記的氟羅沙星抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是:所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；所述吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜、尼龍膜、玻璃纖維棉或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標抗體纖維層用吸附氟羅沙星的金標抗體玻璃纖維棉制成；偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白 。
【文檔編號】G01N33/531GK103439504SQ201310334327
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月3日
【發(fā)明者】胡驍飛, 張改平, 鄧瑞廣, 楊艷艷, 柴書軍 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學院