基于Au NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于Au?NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建及其在腺苷檢測中的應(yīng)用，屬于適配體傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。該檢測系統(tǒng)包含腺苷適配體、與適配體部分雜交的探針DNA、Au?NPs標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA和組裝在金片表面的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA。當(dāng)沒有腺苷時(shí)，Au?NPs標(biāo)記DNA保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)而不能與金片表面的發(fā)夾DNA雜交，無法將Au?NPs捕獲到金片表面。當(dāng)存在腺苷時(shí)，腺苷與其適配體結(jié)合，探針DNA則從適配體/探針DNA雙鏈中釋放出來而與Au?NPs標(biāo)記的發(fā)夾DNA雜交使其開環(huán)，開環(huán)后的AuNPs標(biāo)記DNA與金片表面的DNA雜交將Au?NPs捕獲到金片上，替換出來的探針DNA引發(fā)下一輪DNA鏈替換反應(yīng)，如此循環(huán)，單個(gè)腺苷分子可引發(fā)大量Au?NPs組裝到金片上，獲得增強(qiáng)的SPR信號(hào)，用于對腺苷的高靈敏檢測。
【專利說明】基于Au NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于Au NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建及其在腺苷檢測中的應(yīng)用，屬于適配體傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]適配體是指經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)體外篩選合成得到的一小段單鏈寡核昔酸序列，對目標(biāo)分子具有高度親和性和特異性的識(shí)別能力。與抗體為識(shí)別元件相比，適配體具有配體廣泛、易合成、易標(biāo)記、化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)分子的識(shí)別與檢測。迄今為止，已有各種以核酸適配體為識(shí)別元素的比色傳感器、熒光傳感器、電化學(xué)傳感器、發(fā)光傳感器、石英晶體微天平傳感器、表面等離子體共振(SPR)傳感器的報(bào)道。其中，基于SPR檢測法的適配體傳感器因無需標(biāo)記、高靈敏及實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)勢而具有良好的應(yīng)用前景。大部分SPR適配體傳感器采用夾心檢驗(yàn)法、目標(biāo)引發(fā)構(gòu)像改變或目標(biāo)引發(fā)鏈替換與競爭相結(jié)合等原理實(shí)現(xiàn)對生物分子的檢測。盡管這些傳感器對目標(biāo)分子的檢測具有較高的選擇性和靈敏度，但它們大多按1:1的信號(hào):目標(biāo)物比例輸出信號(hào)，無法實(shí)現(xiàn)低濃度物質(zhì)特別是小分子和核酸等的高靈敏檢測。因此，發(fā)展高靈敏的SPR傳感技術(shù)用于檢測低濃度生物分子具有重要意義。
[0003]近年來，核酸分子擴(kuò)增技術(shù)被廣泛用于提高適配體傳感器的檢測靈敏度，如，靶誘導(dǎo)替換聚合、滾環(huán)放大、聚合酶鏈反應(yīng)、基于核酸內(nèi)切酶的信號(hào)放大反應(yīng)等。這些方法雖然提高了檢測靈敏度，但它們往往需要用到蛋白酶，不僅增加了分析成本，還需要精確控制蛋白酶的反應(yīng)條件，大大限制了應(yīng)用。發(fā)展無酶放大方法用于生物分子的高靈敏檢測尤為重要?；陔s交和鏈替換的無酶放大技術(shù)(如雜交鏈擴(kuò)增反應(yīng)、熵驅(qū)動(dòng)催化、目標(biāo)催化發(fā)夾組裝)，由于模式固有、易于擴(kuò)展、無需使用蛋白酶等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，迄今尚未見基于無酶放大技術(shù)的SPR適配體傳感器用于小分子高靈敏檢測的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種基于Au NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建及其在腺苷檢測中的應(yīng)用，它具有檢測靈敏和選擇性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，在包含腺苷適配體、與適配體部分雜交的探針DNA(c-DNAl)、Au NPs標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA (Au-H-DNAl)、預(yù)組裝在SPR金片上的巰基化發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA (H-DNA2)的實(shí)驗(yàn)體系中，當(dāng)沒有目標(biāo)分子腺苷存在時(shí)，Au-H-DNAl上的H-DNAl保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)而不能與預(yù)組裝在金片表面的發(fā)夾結(jié)構(gòu)H-DNA2雜交，無法將Au NPs捕獲到金片表面。然而，當(dāng)存在目標(biāo)分子腺苷時(shí)，腺苷與適配體特異性結(jié)合促使適配體發(fā)生折疊而構(gòu)象改變，使得c-DNAl從適配體/c-DNAl雙鏈中釋放出來與Au-H-DNAl雜交使其開環(huán)，開環(huán)后的Au-H-DNAl與預(yù)組裝在金片表面的H-DNA2雜交將Au NPs捕獲到金片上，同時(shí)替換出c-DNAl，替換出來的c-DNAl則引發(fā)下一輪DNA鏈替換循環(huán)。通過如此DNA鏈替換循環(huán)，單個(gè)腺苷分子則可引發(fā)大量Au-H-DNAl組裝在SPR金片上。Au NPs對SPR信號(hào)的放大效應(yīng)，使得SPR測量信號(hào)大大增強(qiáng)，對腺苷的檢測限低至PM級別。同時(shí)，適配體的高特異性，使得傳感器具有良好的抗干擾能力。本發(fā)明基于Au NPs對SPR信號(hào)耦合放大效應(yīng)和目標(biāo)物引發(fā)DNA鏈替換循環(huán)雙重放大策略構(gòu)建的SPR適配體傳感器，為低濃度生物小分子的高靈敏和選擇性檢測提供了普適性平臺(tái)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0006]為成功構(gòu)建所述的適配體傳感器，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
基于Au NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建包括以下步驟:
(1)AuNPs的制備:將50 mL的質(zhì)量百分比為0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圓底燒瓶中，加熱至沸騰后，在機(jī)械攪拌下迅速加入I mL的質(zhì)量百分濃度為5%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌并保持沸騰，溶液顏色由黃色變成深酒紅色時(shí)停止加熱，攪拌下自然冷卻至室溫，即獲得平均粒徑為13 nm的穩(wěn)定且單分散的Au NPs，于4 ° C保存?zhèn)溆茫?br> (2)Au NPs-H-DNAl的制備:巰基化H-DNAl用100 μ L新配制的I mM 二硫蘇糖醇溶液活化過柱后，與I mL步驟(I)制備的Au NPs溶液混合，在搖床上振蕩孵育12 h，將產(chǎn)物分散于磷酸鹽(PBS)緩沖溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下離心10 min，棄去上清液，離心后的紅色油狀沉淀用PBS緩沖溶液清洗并離心3次，除去沒有與Au NPs反應(yīng)的H-DNAl ;將獲得的Au NPs-H-DNAl重懸于PBS緩沖溶液中，4 ° C下保存?zhèn)溆茫?br> (3)SPR適配體傳感界面的構(gòu)建:將金片在體積比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2min，用二次水沖洗干凈，浸入10 mM的巰基己醇溶液中2 h，用二次水沖洗并用氮?dú)獯蹈珊螅b入SPR檢測池；注入50 μ LU.2 μΜ的巰基化發(fā)夾結(jié)構(gòu)H-DNA2溶液反應(yīng)2 h，制得預(yù)組裝了 H-DNA2的傳感界面；
上述步驟中，步驟(2)中，所述的二硫蘇糖醇溶液用濃度為170 mM、pH為8.0的磷酸鹽緩沖溶液配制。所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mM，pH為7.4，含0.1 M NaCl。步驟(3)中，所述的巰基己醇溶液用無水乙醇配制。所述的巰基化發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA溶液用濃度為10mM、pH為7.4且含0.1 M NaCl的磷酸鹽緩沖溶液配制。
[0007]基于Au NPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器的應(yīng)用，是指它在腺苷檢測中的應(yīng)用:20 μ LU.0 μ M的腺苷適配體和相同比例的探針DNA在37 ° C孵育2 h，形成適配體/c-DNAl雙鏈；加入20 μ L不同濃度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h，腺苷與其適配體特異性結(jié)合而將探針DNA從適配體/c-DNAl雙鏈中釋放出來；取25 μ L上述溶液加入到25 μ L Au NPs-H-DNAl溶液中，將該混合溶液注入到SPR檢測池中使其與預(yù)組裝于傳感界面的H-DNA2反應(yīng)I h ;用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)溶液排出并注入50 μ L 二次水進(jìn)行清洗；隨著腺苷濃度的增大，捕獲到傳感界面的Au NPs逐漸增多，SPR響應(yīng)信號(hào)迅速增強(qiáng)，SPR角度變化與腺苷濃度在0.5-50 ρΜ范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.21 PM，可用于對腺苷的超靈敏和超低濃度檢測。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明結(jié)合Au NPs對SPR信號(hào)的耦合放大效應(yīng)和目標(biāo)引發(fā)DNA鏈替換放大技術(shù)，發(fā)展了一種無酶SPR適配體傳感器，用于對腺苷的高靈敏和選擇性檢測。優(yōu)點(diǎn)如下:(1)采用目標(biāo)引發(fā)DNA鏈替換循環(huán)放大技術(shù)，通過多次循環(huán)放大，單個(gè)腺苷分子可以引發(fā)大量Au NPs組裝到SPR傳感界面上；(2)Au NPs具有高分子質(zhì)量和高介電常數(shù)，而且，SPR金膜與Au NPs還具有電場耦合諧振作用，這些都使得Au NPs能夠極大地提高SPR響應(yīng)信號(hào)，進(jìn)而提高檢測靈敏度；(3)利用本發(fā)明的雙重放大方法，可實(shí)現(xiàn)ρΜ級腺苷的檢測，比基于單重放大如Au NPs放大或DNA鏈替換循環(huán)放大效應(yīng)構(gòu)建的傳感器對腺苷的檢測限低3個(gè)數(shù)量級；(4)適配體對其目標(biāo)物的高特異性，使得本發(fā)明構(gòu)建的傳感器對腺苷具有良好的選擇性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是SPR適配體傳感器構(gòu)建及其對腺苷檢測的原理圖。
[0010]圖2是(a)Au NPs和(b) Au-H-DNAl的紫外-可見吸收光譜圖。
[0011]圖3 是(a)裸電極，(b)MCH, (c)H_DNA2 和(d)Au-H-DNAl/H_DNA2 修飾電極的(A)循環(huán)伏安曲線和(B)交流阻抗曲線。內(nèi)插圖為等效電路圖；RS，Zw, Rrt和Cdl分別為溶液電阻，Warburg電阻，電子轉(zhuǎn)移阻抗和雙層電容。
[0012]圖4是(A)鏈替換循環(huán)時(shí)間，(B)H-DNA2濃度，(C)H-DNAl濃度對SPR傳感器性能的影響。
[0013]圖5是不同方式檢測50 PM腺苷的SPR響應(yīng)曲線:(a)鏈替換循環(huán)放大，(b) AuNPs放大，(C)Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大。
[0014]圖6是(A)裸金片，(B)Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大檢測50 ρΜ腺苷后的金片和(C) Au NPs放大檢測50 ρΜ腺苷后的金片表面的SEM圖。
[0015]圖7是(A)Au NPs與鏈替換循環(huán)雙放大檢測腺苷的SPR曲線:a-1分別為0，0.5，1，5，10，30，40，50和100 ρΜ的腺苷。(B)腺苷檢測校正曲線:(a) Au NPs與鏈替換循環(huán)雙放大，(b) Au NPs放大和(c)鏈替換循環(huán)放大。
[0016]圖8是基于Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大檢測方式構(gòu)建的傳感器對腺苷、尿苷、鳥苷和胞苷的SPR響應(yīng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，本發(fā)明并不限于此；
實(shí)施例1
(1)AuNPs的制備:將50 mL的質(zhì)量百分比為0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圓底燒瓶中，加熱至沸騰后，在機(jī)械攪拌下迅速加入I mL的質(zhì)量百分濃度為5%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌并保持沸騰，溶液顏色由黃色變成深酒紅色時(shí)停止加熱，攪拌下自然冷卻至室溫，即獲得平均粒徑為13 nm的穩(wěn)定且單分散的Au NPs，于4 ° C保存?zhèn)溆茫?br> (2)AuNPs-H-DNAl的制備:巰基化H-DNAl用100 μ L新配制的I mM 二硫蘇糖醇溶液活化過柱后，與I mL步驟(I)制備的Au NPs溶液混合，在搖床上振蕩孵育12 h，將產(chǎn)物分散于PBS緩沖溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下離心10 min，棄去上清液，離心后的紅色油狀沉淀用PBS緩沖溶液清洗并離心3次，除去沒有與Au NPs反應(yīng)的H-DNAl ;將獲得的Au NPs-H-DNAl重懸于PBS緩沖溶液中，4 ° C下保存?zhèn)溆茫?br> 采用紫外-可見光譜對Au NPs標(biāo)記H-DNAl探針的制備進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2所示。曲線a中520 nm處的吸收峰表明合成的Au NPs粒徑約13 nm。當(dāng)將巰基化H-DNAl修飾于Au NPs表面后，520 nm處的吸收峰紅移至526 nm,表明巰基化的H-DNA1與Au NPs發(fā)生了相互作用，形成了 Au-H-DNAl探針，而且，形成的Au-H-DNAl在濃度為0.1 M的NaCl溶液中非常穩(wěn)定。[0018]實(shí)施例2
SPR適配體傳感器的制備過程
Cl)將金片在體積比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2 min，用二次水沖洗干凈，浸Λ10 mM的巰基己醇溶液中2 h，用二次水沖洗并用氮?dú)獯蹈珊?，裝入SPR檢測池。注入50μ LU.2 μ M的H-DNA2溶液反應(yīng)2 h，制得預(yù)組裝了 H-DNA2的傳感界面；
(2)將20 μ LU.0 μ M的腺苷適配體和相同比例的c-DNAl在37 ° C孵育2 h，加入20 μ L不同濃度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h ;取25 μ L上述溶液加入到25 μ L AuNPs-H-DNAl溶液中，將該混合溶液注入到SPR檢測池中使其與預(yù)組裝于傳感界面的H-DNA2反應(yīng)I h;用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)溶液排出并注入50 μ L 二次水進(jìn)行清洗；
采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)交流阻抗法對SPR傳感器的制備過程進(jìn)行表征。由圖3Α可見，裸金電極上呈現(xiàn)一對可逆的[Fe(CN)6]3_/4_的氧化還原峰(曲線a);當(dāng)在電極表面組裝一層MCH后，[Fe(CN) 6]3_/4_的氧化還原峰電流減小(曲線b);通過金-巰鍵將H-DNA2修飾于金電極表面后，峰電流進(jìn)一步減小(曲線c);當(dāng)50 ρΜ腺苷與腺苷適配體/c-DNA雙鏈反應(yīng)
2h后，加入Au NPs-H-DNAl并注入SPR檢測池孵育I h，[Fe (CN)6]3_/4_在電極表面的氧化還原電流進(jìn)一步減小(曲線d)，這是由于大量Au-H-DNAl被固定于SPR金片表面的H-DNA2捕獲，增加了電極表面的負(fù)電荷密度，阻礙了 [Fe(CN)6] 3 74向電極表面的電子轉(zhuǎn)移。圖3B為不同修飾電極的EIS表征，裸金電極的電子傳遞阻抗0?rt)僅為0.2 ΚΩ (曲線a);當(dāng)在電極表面組裝上MCH后式t增大為12 ΚΩ (曲線b);進(jìn)而通過金-巰鍵組裝上H-DNA2后，/Pet增大為16.8 ΚΩ (曲線c);當(dāng)50 PM腺苷存在時(shí)，DNA鏈替換循環(huán)被啟動(dòng)，使得大量AuNPs-H-DNAl開環(huán)并被捕獲到SPR金片表面，TPet顯著增大至24.4 ΚΩ (曲線d)。EIS與CV結(jié)果一致，表明傳感界面已按照預(yù)定方案成功構(gòu)建。
[0019]實(shí)施例3.
SPR適配體傳感器對腺苷的檢測
(I)鏈替換循環(huán)時(shí)間，H-DNA2濃度，H-DNAl濃度的優(yōu)化
圖4A為不同鏈替換循環(huán)反應(yīng)時(shí)間時(shí)傳感器對50 ρΜ和O ρΜ腺苷的SPR響應(yīng)。由圖可見，對50 ρΜ腺苷，隨著鏈替換循環(huán)反應(yīng)時(shí)間的延長，SPR響應(yīng)強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，I h后趨于穩(wěn)定；當(dāng)沒有腺苷存在時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，SPR響應(yīng)強(qiáng)度隨之稍有增強(qiáng)。因此，選擇鏈替換循環(huán)反應(yīng)為I h。圖4B為H-DNA2濃度對SPR傳感響應(yīng)的影響。當(dāng)H-DNA2濃度為1.2 μ M時(shí)，傳感器的信噪比最佳，進(jìn)一步增加H-DNA2濃度，SPR響應(yīng)稍有下降，這是由于盡管組裝在金片上的捕獲探針密度增加，但高密度的發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針增加了空間位阻而不利于H-DNA2與Au-H-DNAl的雜交。因此，實(shí)驗(yàn)選擇1.2 μ M為H-DNA2的最佳濃度。圖4C為H-DNAl濃度對SPR傳感響應(yīng)的影響。隨著H-DNAl濃度的增加(0.5-0.9 μ Μ)，傳感器的背景信號(hào)與其對50 ρΜ腺苷的SPR信號(hào)均增大，進(jìn)一步增加H-DNAl濃度，SPR信號(hào)下降，這是由于修飾在Au NPs上的H-DNAl過密，其空間位阻效應(yīng)抑制了雜交效率。因此，選擇H-DNAl的最佳濃度為0.9 μ Mo
[0020](2)為了驗(yàn)證Au NPs與鏈替換循環(huán)雙放大效應(yīng)對腺苷檢測的放大效果，對僅基于Au NPs或鏈替換循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建的傳感器對50 ρΜ腺苷的SPR響應(yīng)進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖5所示。由圖可見，鏈替換循環(huán)放大方式對50 ρΜ腺苷的SPR響應(yīng)只有14.1 m° (曲線a)，而Au NPs放大方式對50 ρΜ腺苷的SPR響應(yīng)為80.3 m0 (曲線b)，是基于鏈替換循環(huán)放大響應(yīng)的5.7倍；Au NPs與鏈替換循環(huán)雙放大方式對50 ρΜ腺苷的SPR響應(yīng)為996 m(曲線c)，是基于Au NPs放大響應(yīng)的12.5倍，表明Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大方式對腺苷檢測具有明顯的放大增強(qiáng)效果。這是由于鏈替換循環(huán)模式促使大量的Au-H-DNAl組裝到SPR金片表面，Au NPs與金膜間的電子耦合作用，使得SPR信號(hào)被高效放大。而在Au NPs放大方式中，一條短鏈DNA (C-DNA2)代替了發(fā)夾H-DNA2固定在SPR金片表面。C-DNA2含有12個(gè)堿基，能與Au-H-DNAl的臨近3’端的12個(gè)堿基雜交，但是，該雜交過程不能將c-DNAl鏈從Au-H-DNAI/c-DNAI雙鏈中釋放出來，因而不能引發(fā)DNA鏈替換循環(huán)，故Au-H-DNAl與C-DNA2按1:1的化學(xué)計(jì)量比雜交固定到SPR金片上，無法實(shí)現(xiàn)對SPR信號(hào)的進(jìn)一步放大；米用掃描電子顯微鏡對三種不同放大方式檢測50 ρΜ腺苷后的金片表面形貌進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖6所示。SPR金片表面較為光滑(圖6A)，當(dāng)采用Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大方式檢測50 PM腺苷后，大量Au NPs均勻地負(fù)載于金片表面(圖6B)，表明通過鏈替換循環(huán)模式促使溶液中大量的Au-H-DNAl與金片表面的H-DNA2發(fā)生雜交而捕獲到SPR金片上。當(dāng)采用Au NPs放大方式檢測50 ρΜ腺苷后，在金片表面只有少量的Au NPs (圖6C)，覆蓋率遠(yuǎn)低于圖6B,這是由于Au-H-DNAl與固定于金片表面的短鏈C-DNA2只能以1:1的形式雜交，限制了 Au-H-DNAl固定到金片上的量。
[0021](3)在優(yōu)化條件下，按照圖1所示對腺苷進(jìn)行了檢測，SPR曲線如圖7A所示。SPR角度變化(AAngle)隨著腺苷的濃度增加而增大，AAngle與腺苷濃度(C)在0.5-50 ρΜ范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Angle (m0)= 164.28 +16.31 C (R=0.9949)，檢測限為0.21 ρΜ。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，考察了僅基于Au NPs或鏈替換循環(huán)放大方式對腺苷的響應(yīng)，結(jié)果如圖7B所示。由圖可見，基于Au NPs或鏈替換循環(huán)放大方式對腺苷檢測的SPR響應(yīng)明顯低于Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大方式的SPR響應(yīng)，檢測限分別為0.52 nM和
1.13 nM。可見，Au NPs與鏈替換循環(huán)雙重放大方式可用于腺苷的高靈敏檢測。
[0022](4)以核苷家族的其它三種核苷(尿苷、鳥苷和胞苷)為干擾物,考察了傳感器對腺苷檢測的選擇性，結(jié)果如圖8所示。由圖可見，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，傳感器對50 ρΜ腺苷的SPR響應(yīng)最大，而對50 PM尿苷、鳥苷和胞苷幾乎沒有響應(yīng)，表明本發(fā)明構(gòu)建的傳感器對腺苷檢測具有良好的選擇性。
【權(quán)利要求】
1.基于AuNPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建，其特征在于所述構(gòu)建包括以下步驟: .(1)AuNPs的制備:將50 mL的質(zhì)量百分比為0.01%的HAuCl4溶液加入到100 mL圓底燒瓶中，加熱至沸騰后，在機(jī)械攪拌下迅速加入I mL的質(zhì)量百分濃度為5%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌并保持沸騰，溶液顏色由黃色變成深酒紅色時(shí)停止加熱，攪拌下自然冷卻至室溫，即獲得平均粒徑為13 nm的穩(wěn)定且單分散的Au NPs，于4 ° C保存?zhèn)溆茫? .(2)AuNPs標(biāo)記發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的制備:巰基化DNA用100 μ L新配制的I mM 二硫蘇糖醇溶液活化過柱后，與I mL步驟(I)制備的Au NPs溶液混合，在搖床上振蕩孵育12 h，將產(chǎn)物分散于磷酸鹽緩沖溶液中，25 ° C放置40 h;在14000 rpm下離心10 min，棄去上清液，離心后的紅色油狀沉淀用磷酸鹽緩沖溶液清洗并離心3次，除去沒有與Au NPs反應(yīng)的DNA ;將獲得的Au NPs標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，4 ° C下保存?zhèn)溆茫?.(3)SPR適配體傳感界面的構(gòu)建:將金片在體積比7:3的H2SO4 = H2O2混合溶液中浸泡2min，用二次水沖洗干凈，浸入10 mM的巰基己醇溶液中2 h，用二次水沖洗并用氮?dú)獯蹈珊?，裝入SPR檢測池；注入50 μ LU.2 μ M的巰基化發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA溶液反應(yīng)2 h，制得預(yù)組裝了巰基化發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的傳感界面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于AuNPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建，其特征在于步驟(2)中，所述的二硫蘇糖醇溶液用濃度為170 mM、pH為8.0的磷酸鹽緩沖溶液配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于AuNPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建，其特征在于步驟(2)中，所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mM，pH為7.4，含0.1 M NaCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于AuNPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建，其特征在于步驟(3)中，所述的巰基己醇溶液用無水乙醇配制。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于AuNPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器構(gòu)建，其特征在于步驟(3)中，所述的巰基化發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA溶液用濃度為10 mM、pH為7.4且含0.1M NaCl的磷酸鹽緩沖溶液配制。
6.基于AuNPs和DNA循環(huán)雙放大技術(shù)的適配體傳感器的應(yīng)用，是指它在腺苷檢測中的應(yīng)用:其特征在于，20 μ LU.0 μ M的腺苷適配體和相同比例的探針DNA在37 ° C孵育2h，形成適配體/探針DNA雙鏈；加入20 μ L不同濃度的腺苷溶液，在37 ° C孵育2 h，腺苷與其適配體特異性結(jié)合而將探針DNA從適配體/探針DNA雙鏈中釋放出來；取25 μ L上述溶液加入到25 μ L Au NPs標(biāo)記發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA溶液中，將該混合溶液注入到SPR檢測池中使其與預(yù)組裝于傳感界面的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA反應(yīng)I h ;用蠕動(dòng)泵將反應(yīng)溶液排出并注入50μ L 二次水進(jìn)行清洗；隨著腺苷濃度的增大，捕獲到傳感界面的Au NPs逐漸增多，SPR響應(yīng)信號(hào)迅速增強(qiáng)，SPR角度變化與腺苷濃度在0.5-50 PM范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為0.21 PM，可用于對腺苷的超靈敏和超低濃度檢測。
【文檔編號(hào)】G01N21/55GK103439296SQ201310329115
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】邱建丁, 姚桂紅, 梁汝萍 申請人:南昌大學(xué)