一種檢測(cè)環(huán)境中鉛離子的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)鉛離子的方法，該方法將序列表中序列1、2分別用緩沖溶液稀釋后，混合雜交后形成核酸酶溶液，序列1和序列2的摩爾比為1:1～3:1；將預(yù)處理后的待測(cè)樣品加入到核酸酶溶液中，靜置使核酸酶與鉛離子完全反應(yīng)，之后加入序列3，序列3與2摩爾比1:1～3:1；再靜置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液；B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的緩沖水溶液；再將A溶液和B溶液按照體積比為1:2～2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；根據(jù)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度得到待測(cè)樣品的鉛離子濃度。本發(fā)明用于檢測(cè)鉛離子含量，具有靈敏度高，選擇性好，且具有很好的重復(fù)性，操作簡(jiǎn)單易行，可直接應(yīng)用于環(huán)境中鉛離子的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)環(huán)境中鉛離子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于金屬離子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種鉛離子的檢測(cè)方法，尤其適用于檢測(cè)環(huán)境中的鉛離子的濃度。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，檢測(cè)鉛離子的方法有多種，常用的有微分電位溶出分析法、石墨爐原子吸收光譜法、氫化物發(fā)生原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、雙硫腙比色法等。微分電位溶出分析法方法簡(jiǎn)便，靈敏度較高，但容易受到有機(jī)物的干擾；石墨爐原子吸收光譜法準(zhǔn)確度和精密度好，基底干擾效應(yīng)小，但檢測(cè)較為耗時(shí)；氫化物發(fā)生原子熒光光譜法特異性較好，但熒光轉(zhuǎn)換效率較低，散射光影響較大，且需專(zhuān)業(yè)人員操作；電感耦合等離子體質(zhì)譜法靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，是公認(rèn)的最好方法，但其存在基體干擾問(wèn)題，且儀器和檢測(cè)成本高昂；雙硫腙比色法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性好，但操作繁瑣，靈敏度相對(duì)較低。因此研究高靈敏度高特異性的鉛檢測(cè)方法十分必要。
[0003]‘8-17’核酸酶在1997年首先由Santoro and Joyce報(bào)道,它具有一個(gè)鉛離子高特異性的切位點(diǎn)，這引起了研究人員的極大興趣將之用于鉛離子的檢測(cè)。目前，已有人利用‘8-17’DNA酶基于色度法、熒光法以及電化學(xué)方法完成了對(duì)鉛離子的檢測(cè)。然而，色度法分離樣品時(shí)前處理步驟繁瑣且難以達(dá)到微量檢測(cè)水平；熒光法盡管靈敏度較高但準(zhǔn)確性差；而低特異性及低靈敏度也一直是電化學(xué)方法檢測(cè)的難題。
[0004]化學(xué)發(fā)光法無(wú)需要外來(lái)光源的激發(fā)，具有背景干擾小、靈敏度高、易于檢測(cè)、免標(biāo)記熒光基團(tuán)或電活性分子等優(yōu)點(diǎn)，因此在生化分析中得到廣泛應(yīng)用。特別是借助于過(guò)氧化氫酶催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光，已在金屬離子的檢測(cè)領(lǐng)域得到有效應(yīng)用。上世紀(jì)90年代，Sen等首次報(bào)道了一種具有類(lèi)似過(guò)氧化氫酶催化活性的氯化血紅素/G-四鏈體結(jié)構(gòu)，此后，隨后眾多研究者都利用這種具有催化魯米諾發(fā)光的無(wú)酶體系來(lái)檢測(cè)金屬離子，包括結(jié)合‘8-17’核酸酶用于鉛離子的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單易行、靈敏度高和選擇性好的檢測(cè)鉛離子的方法。
[0006]本發(fā)明提供的一種檢測(cè)鉛離子的方法，包括下述步驟:
[0007]第I步配制A溶液和B溶液:
[0008]將序列表中序列I和序列2分別用緩沖溶液稀釋后，再混合雜交后形成核酸酶溶液，序列I和序列2的摩爾比為1:1?3:1 ;將預(yù)處理后的待測(cè)樣品加入到核酸酶溶液中，核酸酶溶液中核酸酶的濃度為0.1 μ mol/L?I μ mol/L ;靜置使核酸酶與鉛離子完全反應(yīng)，之后加入序列3，序列3與序列2摩爾比1:1?3:1 ;再靜置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液，最終A溶液中，氯化血晶素的濃度為0.02 μ mol/L?0.2 μ mol/L ；
[0009]所述B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的緩沖水溶液，B溶液中，魯米諾的濃度為0.0lmmol/L?0.15mmol/L,雙氧水的濃度為0.0SmmoI /I,?0.75mmol/L,對(duì)鵬苯酌.的濃度為 0.0SmmoI /I,?0.7SmmoI /I,；
[0010]第2步將A溶液和B溶液按照體積比為1:2?2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；
[0011]第3步根據(jù)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度得到待測(cè)樣品的鉛離子濃度。
[0012]作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述緩沖溶液為濃度10?lOOmmol/L的HEPES溶液，濃度為 10 ?200mmol/L 的 Tris-HCl,濃度為 10 ?200mmol/L 的 Tris-Acetate,或者濃度為10?lOOmmol/L的PBS溶液，緩沖液的pH值范圍在7.0?10 ;稀釋后序列I和序列2的摩爾濃度均為0.1 μ mol/L?I μ mol/L。
[0013]作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述待測(cè)樣品的預(yù)處理過(guò)程為:
[0014]向待測(cè)樣品中加入過(guò)量的濃硝酸溶液，攪拌加熱至90° C以上但是不沸騰，保溫讓待測(cè)樣品全部被濃硝酸氧化溶解，得到硝酸酸化的溶液；然后，讓所述溶液冷卻至60° C以下，再將過(guò)量的雙氧水緩慢加入其中，攪拌加熱至90° C以上但是出現(xiàn)沸騰，直至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生；再將所得溶液冷卻至60° C以下，加入過(guò)量的鹽酸溶液，攪拌加熱不出現(xiàn)沸騰，保溫IOmin?Ih ;冷卻至室溫后，將所得溶液過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮，然后用緩沖溶液定容，得到預(yù)處理之后的待測(cè)樣品。
[0015]作為上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述待測(cè)樣品的預(yù)處理過(guò)程為:第3步是將得到的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，所對(duì)應(yīng)的鉛離子濃度作為待測(cè)樣品的鉛離子濃度。
[0016]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過(guò)程為:
[0017](al)配制鉛離子溶液的濃度梯度，包括N個(gè)濃度，N≥11 ；
[0018](a2)按照第2步相同的方式配制N份A溶液和N份B溶液:
[0019](a3)將N份A溶液分別和N份B溶液分別按照體積比為1:2?2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；
[0020](a4)以化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及鉛離子濃度分別作為縱橫坐標(biāo)，利用N個(gè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及其所對(duì)應(yīng)的鉛離子濃度繪制曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一種檢測(cè)環(huán)境中鉛離子的方法，利用鉛離子能特異性切割核酸酶之后，能夠形成具有類(lèi)似過(guò)氧化氫酶活性的四鏈體結(jié)構(gòu)，催化魯米諾氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。該方法操作簡(jiǎn)單易行，具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，所設(shè)計(jì)的核酸酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)限可達(dá)0.79nmol/L，具有很好的重現(xiàn)性，可直接應(yīng)用于環(huán)境中鉛離子的檢測(cè)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為所設(shè)計(jì)的‘8-17’核酸酶的序列。
[0023]圖2為鉛離子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)原理圖。
[0024]圖3為實(shí)例I中化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與鉛離子濃度的關(guān)系圖，其中，A為關(guān)系圖，B為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖4為天然湖水中鉛離子濃度的檢測(cè)結(jié)果。
[0026]圖5為基于核酸酶的鉛離子檢測(cè)的特異性
[0027]圖6為基于核酸酶的鉛離子檢測(cè)重現(xiàn)性。[0028]圖7為序列表中三個(gè)序列。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步說(shuō)明。在此需要說(shuō)明的是，對(duì)于這些實(shí)施方式的說(shuō)明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0030]‘8-17，核酸酶在 1997 年首先由 Santoro 和 Joyce (Santoro S.ff., Joyce G.F.; 一種通用的RNA切點(diǎn)核酸酶；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)報(bào)道，陸藝等人(李靜，陸藝；一種高靈敏度高選擇性檢測(cè)鉛離子的核酸酶生物傳感器J.AM.Chem.Soc.)證實(shí)了其具有一個(gè)鉛離子高特異性的切位點(diǎn)。在此研究中，本發(fā)明選取了此核酸酶的酶鏈序列和基鏈序列。具體合成設(shè)計(jì)了以下三段序列:
[0031]第一段序列為核酸酶的酶鏈序列，含有33個(gè)堿基(如SEQ ID N0.1所示，即CCACTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG AGT)。第一段序列稱(chēng)之為序列I。第二段序列為核酸酶的基鏈序列，含有25個(gè)堿基(如SEQ ID N0.2所示，即ACT CAC TAT rA GGA AGA GTGGGT GGG)，5’端與酶鏈互補(bǔ)，3’端比酶序列略長(zhǎng)，含有很多G堿基，且含有一個(gè)核糖核苷酸A，它是酶活性的關(guān)鍵。第二段序列稱(chēng)之為序列2。
[0032]第三段序列含有15個(gè)堿基(如SEQ ID N0.3所示，即GGG TGG GTC TCT TCC)，3’端與基鏈序列部分互補(bǔ)，5’含有很多G堿基，能與基鏈3’端形成具有過(guò)氧化氫酶活性的四鏈體結(jié)構(gòu)。第三段序列稱(chēng)之為序列3。
[0033]序列1、2、3均為一段脫氧核糖核苷酸序列，用于作為與鉛離子反應(yīng)的反應(yīng)物。
[0034]本發(fā)明實(shí)例提供的可用于環(huán)境中鉛離子高靈敏度特異性檢測(cè)方法，其步驟為:
[0035]第I步對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理:
[0036]向待測(cè)樣品中加入過(guò)量的濃硝酸溶液，攪拌加熱至90° C以上但是不沸騰，保溫讓待測(cè)樣品全部被濃硝酸氧化溶解，得到硝酸酸化的溶液。然后，讓所述溶液冷卻至60° C以下，再將過(guò)量的雙氧水緩慢加入其中，攪拌加熱至90° C以上但是出現(xiàn)沸騰，直至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生。再將所得溶液冷卻至60° C以下，加入過(guò)量的鹽酸溶液，攪拌加熱不出現(xiàn)沸騰，保溫IOmin?lh。冷卻至室溫后，將所得溶液過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮，然后用緩沖溶液定容
[0037]緩沖溶液可以選用是濃度為10?lOOmmol/L的HEPES溶液或濃度為10?200mmol/L的Tris-HCl或者濃度為10?200mmol/L的Tris-Acetate或者濃度為10?IOOmmoI/L的PBS溶液，緩沖液的pH值范圍在7.0?10，得到預(yù)處理之后的待測(cè)樣品。
[0038]本發(fā)明檢測(cè)的對(duì)象是環(huán)境中的鉛離子，尤其氣態(tài)或液態(tài)物中的鉛離子，如湖水，河水，自來(lái)水，飲用水，生活污水等。
[0039]第2步配制A溶液和B溶液:
[0040]將序列I和序列2分別用緩沖溶液稀釋后，再混合雜交后形成核酸酶溶液；將預(yù)處理后的待測(cè)樣品加入到核酸酶溶液中，核酸酶溶液中核酸酶的濃度為0.1 μ mol/L?I μ mol/L ;靜置使核酸酶與鉛離子完全反應(yīng)，之后加入序列3，序列3與序列2摩爾比1:1?3:1 ;再靜置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液，最終A溶液中，氯化血晶素的濃度為0.02 μ mol/L ?0.2 μ mol/L ；
[0041]序列I和序列2稀釋所使用的緩沖溶液及其濃度可以相同或不同，如緩沖溶液可以選用是濃度為10?100mmol/L的HEPES溶液或濃度為10?200mmol/L的Tris-HCl或者濃度為10?200mmol/L的Tris-Acetate或者濃度為10?100mmol/L的PBS溶液，緩沖液的pH值范圍在7.0?10 ;稀釋后序列I和序列2的摩爾濃度均為0.1 μ mol/L?I μ mol/L。序列I和序列2的摩爾比為1:1?3:1。
[0042]所述B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的緩沖水溶液，B溶液中，魯米諾的濃度為0.01mmol/L?0.1 Smmol /I,,雙氧水的濃度為0.0SmmoI /I,?0.75mmol/L,對(duì)鵬苯酌.的濃度為 0.0SmmoI /I,?0.7SmmoI /I,；
[0043]第3步將A溶液和B溶液按照體積比為1:2?2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；
[0044]第4步將得到的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，所對(duì)應(yīng)的鉛離子濃度作為待測(cè)樣品的鉛離子濃度。
[0045]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備過(guò)程為:
[0046](al)配制鉛離子溶液的濃度梯度，包括N個(gè)濃度，N 11 ；
[0047](a2 )配制A溶液和B溶液:
[0048]序列I和序列2混合雜交后形成核酸酶溶液，序列I和序列2的摩爾比為1:1?3:1，將N個(gè)濃度的所述鉛離子溶液分別加入到N份核酸酶溶液中，核酸酶溶液中核酸酶的濃度為0.1 μ mol/L?I μ mol/L,;靜置使核酸酶與鉛離子完全反應(yīng),之后分別加入序列3，序列3與序列2摩爾比1:1?3:1 ;再靜置，然后再分別加入氯化血晶素，得到N份A溶液，每份A溶液中，氯化血晶素的濃度均為0.02 μ mol/L?0.2 μ mol/L ；
[0049]所述B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的緩沖水溶液，魯米諾的濃度為0.01mmol/L?0.15mmol/L,雙氧水的濃度為0.05mmol/L?0.75mmol/L,對(duì)碘苯酌 的濃度為0.0SmmoI /I,?0.7SmmoI /I,；
[0050](a3)將N份A溶液分別和N份B溶液按照體積比為1:2?2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)各混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；
[0051](a4)以化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及鉛離子濃度分別作為縱橫坐標(biāo)，利用N個(gè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及其所對(duì)應(yīng)的鉛離子濃度繪制曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0052]將序列I和序列2混合形成核酸酶后，將待測(cè)樣品加入其中。若待測(cè)樣品中含有鉛離子，核酸酶會(huì)被切開(kāi)，加入序列3和氯化血晶素和后，得到A溶液，將其與B溶液混合，即可檢測(cè)到化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生。檢測(cè)到體系的化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)與鉛離子濃度呈良好的線性關(guān)系。
[0053]結(jié)合‘8-17’核酸酶和能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列建立了一種高靈敏度高特異性的鉛離子化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。
[0054]實(shí)例:
[0055]實(shí)施例1
[0056]第一步標(biāo)準(zhǔn)鉛離子溶液:
[0057]配制11份標(biāo)準(zhǔn)的鉛離子溶液梯度。濃度依次為0mol/L，50nmol/L, IOOnmoI/L, 500nmol/L, I μ mol/L, 2 μ mol/L, 5 μ mol/L, 10 μ mol/L, 20 μ mol/L, 50 μ mol/L 和100 μ mol/L。
[0058]第二步配制A溶液和B溶液:
[0059]將序列I和序列2用40mmol/L的HEPES緩沖溶液稀釋(含20mmol/LKNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X-100andl%DMS0, pH7.4)，混合雜交后形成核酸酶，得到核酸酶的濃度為0.5 μ mol/L。然后將配制好的11份標(biāo)準(zhǔn)的鉛離子溶液分別加入到相同體積的11份核酸酶溶液中，渦旋混合后室溫反應(yīng)3h。之后加入序列3，序列3與序列2摩爾比為1:1,渦旋后靜置Ih,將氯化血晶素加入其中，得到11份A溶液。各個(gè)A溶液中，氯化血晶素的最終濃度為0.1 μ mol/L,鉛離子的最終濃度依次為Omol/L, 5nmol/L, IOnmoI/L, 50nmol/L, 100nmol/L, 200nmol/L, 500nmol/L, I μ mol/L, 2 μ mol/L, 5 μ mol/L和 10 μ mol/L。
[0060]B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的25mmol/L的HEPES緩沖溶液(含20mmol/L KNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X_100andl%DMS0，ρΗ7.4)。B 溶液中，魯米諾的濃度為0.lmmol/L,雙氧水的濃度為0.5mmol/L,對(duì)碘苯酹的濃度為0.5mmol/L。
[0061]第三步將11份A溶液分別和11份B溶液按照體積比1:1緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
[0062]圖3A顯示隨著鉛離子濃度的增大，檢測(cè)到體系的化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)越強(qiáng)。且當(dāng)鉛離子濃度在511!1101/1?1411101/1時(shí)，鉛離子濃度與體系的化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)呈良好的線性關(guān)系。以此為依據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3B，插圖)。
[0063]實(shí)施例2
[0064]第一步待測(cè)天然湖水實(shí)際樣品:
[0065]取IOOml天然湖水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5ml,加入濃硝酸5ml,攪拌加熱至93° C(不出現(xiàn)沸騰)，保溫30min之后，冷卻至60° C以下，緩慢加入IOml體積百分比濃度為30%的雙氧水，攪拌加熱至93° C直至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生。再冷卻至60° C以下，加入5ml濃鹽酸，攪拌加熱15min之后，過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮，用25mmol/L的HEPES緩沖溶液(含20mmol/LKNO3, 200mmoI/LNaNO3, 0.025%Triton X-100andl%DMS0, pH7.4)定容至 10ml。所得溶液為待測(cè)實(shí)際樣品。
[0066]第二步配制A溶液和B溶液:
[0067]將序列I和序列2用40mmol/L的HEPES緩沖溶液稀釋(含20mmol/LKNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X-100andl%DMS0, pH7.4)，混合雜交后形成核酸酶。然后，加入待測(cè)實(shí)際樣品，渦旋混合后室溫反應(yīng)3h，使其與核酸酶溶液完全反應(yīng)。之后加入序列3，序列3與序列2的摩爾比為1:1，渦旋后靜置lh，將氯化血晶素加入其中，得到A溶液。最終，A溶液中含有氯化血晶素的濃度為0.1 μ mol/L。
[0068]B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的25mmol/L的HEPES緩沖溶液(含20mmol/L KNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X_100andl%DMS0，ρΗ7.4)。B 溶液中，魯米諾的濃度為0.lmmol/L,雙氧水的濃度為0.5mmol/L,對(duì)碘苯酹的濃度為0.5mmol/L。
[0069]第三步將A溶液和B溶液按照體積比1:1緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
[0070]圖4為A溶液和B溶液混合5次時(shí)，混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與時(shí)間和波長(zhǎng)的三維關(guān)系，表明我們建立的方法可以很好的用于實(shí)際樣品中鉛含量的分析檢測(cè)。
[0071]實(shí)施例3
[0072]第一步不同金屬離子的標(biāo)準(zhǔn)溶 液:
[0073]配制100 μ mol/L 的 Hg2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Fe3+, Al3+, Cu2+, Cr3+, Cd2+, Co2+ 標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制I μ mol/L的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0074]第二步配制A溶液和B溶液:
[0075]將序列I和序列2用40mmol/L的HEPES緩沖溶液稀釋(含20mmol/LKNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X-100andl%DMS0, pH7.4)，混合雜交后形成核酸酶，得到核酸酶的濃度為0.5 μ mol/L。然后將配制好的13份不同金屬的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到相同體積的13份核酸酶溶液中，渦旋混合后室溫反應(yīng)3h。之后加入序列3，序列3與序列2摩爾比為1:1，渦旋后靜置Ih,將氯化血晶素加入其中,得到13份A溶液。各個(gè)A溶液中，氯化血晶素的最終濃度為0.1 μ mol/L,鉛離子的最終濃度依次為0.lmol/L,其他金屬離子的最終濃度均為10 μ mol/L。
[0076]B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的25mmol/L的HEPES緩沖溶液(含20mmol/L KNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X_100andl%DMS0，ρΗ7.4)。B 溶液中，魯米諾的濃度為0.lmmol/L,雙氧水的濃度為0.5mmol/L,對(duì)碘苯酹的濃度為0.5mmol/L。
[0077]第三步將13份A溶液分別和13份B溶液按照體積比1:1緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
[0078]圖5為0.1 μ M鉛離子的A溶液和不同的金屬離子A溶液分別和B溶液混合反應(yīng)后，混合溶液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光在452nm的光強(qiáng)的比較?？梢园l(fā)現(xiàn)，混合溶液中即使存在100倍的其它離子(Hg2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，F(xiàn)e3+，Al3+，Cu2+，Cr3+，Cd2+，Co2+)時(shí)，所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度跟背景光強(qiáng)相差無(wú)幾；而相對(duì)它們1%的Pb2+就能產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光。這表明我們建立的方法具有很強(qiáng)的特異性，也暗示著其抗干擾能力較強(qiáng)。
[0079]實(shí)施例4
[0080]第一步標(biāo)準(zhǔn)鉛離子溶液:
[0081]配制3份標(biāo)準(zhǔn)的鉛離子溶液梯度。濃度依次為I μ mol/L。
[0082]第二步配制A溶液和B溶液:
[0083]將序列I和序列2用40mmol/L的HEPES緩沖溶液稀釋(含20mmol/LKNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X-100andl%DMS0, pH7.4)，混合雜交后形成核酸酶，得到核酸酶的濃度為0.5 μ mol/L。然后將配制好標(biāo)準(zhǔn)的鉛離子溶液加入到相同體積的核酸酶溶液中，渦旋混合后室溫反應(yīng)3h。之后加入序列3，序列3與序列2摩爾比為1:1，渦旋后靜置lh，將氯化血晶素加入其中，得到A溶液。A溶液中，氯化血晶素的最終濃度為
0.1 μ mol/L，鉛離子的最終濃度依次為0.1 μ mol/L。
[0084]B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的25mmol/L的HEPES緩沖溶液(含20mmol/L KNO3, 200mmol/L NaNO3, 0.025%Triton X_100andl%DMS0，ρΗ7.4)。B 溶液中，魯米諾的濃度為0.lmmol/L,雙氧水的濃度為0.5mmol/L,對(duì)碘苯酹的濃度為0.5mmol/L。
[0085]第三步將A溶液以及HEPES緩沖溶液輪流的和B溶液按照體積比1:1緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
[0086]圖6為A溶液和HEPES緩沖溶液交替和B溶液混合時(shí)，混合溶液的化學(xué)發(fā)光在452nm光強(qiáng)變化?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)A溶液泵入時(shí)，立刻能檢測(cè)到混合溶液的化學(xué)發(fā)光；而停止進(jìn)樣，改為泵入相同量的緩沖液時(shí)就檢測(cè)不到混合溶液的化學(xué)發(fā)光?？梢?jiàn)該方法具有良好的重現(xiàn)性。
[0087]以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例和附圖所公開(kāi)的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開(kāi)的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)鉛離子的方法，包括下述步驟: 第I步配制A溶液和B溶液: 將序列表中序列I和序列2分別用緩沖溶液稀釋后，再混合雜交后形成核酸酶溶液，序列I和序列2的摩爾比為1:1?3:1 ;將預(yù)處理后的待測(cè)樣品加入到核酸酶溶液中，核酸酶溶液中核酸酶的濃度為0.1 μ mo I/L?I μ mol/L ;靜置使核酸酶與鉛離子完全反應(yīng),之后加入序列3，序列3與序列2摩爾比1:1?3:1 ;再靜置，然后再加入氯化血晶素，得到A溶液，最終A溶液中，氯化血晶素的濃度為0.02 μ mol/L?0.2 μ mol/L ； 所述B溶液是含有魯米諾，雙氧水和對(duì)碘苯酚的緩沖水溶液，B溶液中，魯米諾的濃度為0.0ImmoI /I,?0.1 Smmol /I,,雙氧水的濃度為0.0SmmoI /I,?0.75mmol/L,對(duì)鵬苯酌 的濃度為 0.0SmmoI /I,?0.7SmmoI /I,； 第2步將A溶液和B溶液按照體積比為1:2?2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度； 第3步根據(jù)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度得到待測(cè)樣品的鉛離子濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)鉛離子的方法，其特征在于，所述緩沖溶液為濃度10?IOOmmoI/L 的 HEPES 溶液，濃度為 10 ?200mmol/L 的 Tris-HCl，濃度為 10 ?200mmol/L 的Tris-Acetate，或者濃度為10?100mmol/L的PBS溶液，緩沖液的pH值范圍在7.0?10 ;稀釋后序列I和序列2的摩爾濃度均為0.1 μ mol/L?I μ mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)鉛離子的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的預(yù)處理過(guò)程為: 向待測(cè)樣品中加入過(guò)量的濃硝酸溶液，攪拌加熱至90° C以上但是不沸騰，保溫讓待測(cè)樣品全部被濃硝酸氧化溶解，得到硝酸酸化的溶液；然后，讓所述溶液冷卻至60° C以下，再將過(guò)量的雙氧水緩慢加入其中，攪拌加熱至90° C以上但是出現(xiàn)沸騰，直至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生；再將所得溶液冷卻至60° C以下，加入過(guò)量的鹽酸溶液，攪拌加熱不出現(xiàn)沸騰，保溫IOmin?Ih ;冷卻至室溫后，將所得溶液過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮，然后用緩沖溶液定容，得到預(yù)處理之后的待測(cè)樣品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)鉛離子的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的預(yù)處理過(guò)程為--第3步是將得到的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，所對(duì)應(yīng)的鉛離子濃度作為待測(cè)樣品的鉛離子濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)鉛離子的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過(guò)程為: (al)配制鉛離子溶液的濃度梯度，包括N個(gè)濃度，NS 11 ； (a2 )按照第2步相同的方式配制N份A溶液和N份B溶液: (a3)將N份A溶液分別和N份B溶液分別按照體積比為1:2?2:1的比例緩慢混合，混合反應(yīng)的同時(shí)檢測(cè)混合溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度； (a4)以化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及鉛離子濃度分別作為縱橫坐標(biāo)，利用N個(gè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及其所對(duì)應(yīng)的鉛離子濃度繪制曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103439318SQ201310295583
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】趙元弟, 周子明 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)