一種大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條，涉及生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，包括有支撐被襯，該支撐被襯上依次粘貼有包被膜、標(biāo)記墊和樣品墊，在所述支撐被襯的手持端粘貼有吸水墊；所述標(biāo)記墊包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體，所述包被膜上前部設(shè)有檢測(cè)線，所述包被膜上后部設(shè)有質(zhì)控線，所述檢測(cè)線包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體，所述質(zhì)控線包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗體，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試紙條操作簡(jiǎn)便，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員和專業(yè)設(shè)備儀器，能滿足不同層次人員和部門(mén)的需要，尤其是基層單位的需要，并且具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物監(jiān)測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種用于快速檢測(cè)大片形吸蟲(chóng)病的免疫層析快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大片形吸蟲(chóng)(Fasciola gigantica)是一種寄生于人畜的重要寄生蟲(chóng),在家畜中主要危害牛羊，感染牛后能引起急性或慢性的肝炎和膽管炎，導(dǎo)致全身性的中毒現(xiàn)象和營(yíng)養(yǎng)障礙，使牛免役力降低，肉奶產(chǎn)量減少，品質(zhì)下降，嚴(yán)重感染時(shí)，還可引起大批死亡，給畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)都帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失；大片形吸蟲(chóng)感染也可以引起人的嚴(yán)重寄生蟲(chóng)病，如2011年我國(guó)云南賓川爆發(fā)人群大片形吸蟲(chóng)病，由于缺乏有效的診斷檢測(cè)方法，造成重大疫情，共有20多人感染發(fā)病。因此，對(duì)該病的防治要依賴有效的檢測(cè)診斷方法。目前該病常用的檢測(cè)、診斷方法主要有:(I)傳統(tǒng)的糞便蟲(chóng)卵檢查法，該法簡(jiǎn)便、不需要昂貴儀器設(shè)備，但檢出率低，且不能進(jìn)行早期診斷；(2)分子生物學(xué)檢測(cè)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)法，該法靈敏度高，但需要特殊昂貴的儀器，操作復(fù)雜、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；(3)免疫學(xué)檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的大片形吸蟲(chóng)病的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法多為檢測(cè)抗體的方法，但該法不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，因此不能對(duì)疫病做出準(zhǔn)確的診斷，同時(shí)該法還需要借助特殊的儀器如酶標(biāo)儀才能進(jìn)行檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供一種大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條及其制備方法，它可以解決現(xiàn)有的用于檢測(cè)和診斷大片形吸蟲(chóng)病的設(shè)備價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜的問(wèn)題。
[0004]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條的技術(shù)方案是:包括有支撐被襯，該支撐被襯上依次粘貼有包被膜、標(biāo)記墊和樣品墊，在所述支撐被襯的手持端粘貼有吸水墊；所述標(biāo)記墊包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES (分泌排泄)抗原的7D1單克隆抗體，所述包被膜上前部設(shè)有檢測(cè)線，所述包被膜上后部設(shè)有質(zhì)控線，所述檢測(cè)線包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體，所述質(zhì)控線包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗體。7D1單克隆抗體和7D4單克隆抗體的制備方法見(jiàn):《抗大片吸蟲(chóng)分泌排泄抗原單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性鑒定》，南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2012年43卷第9期。
[0005]上述技術(shù)方案中，更具體的方案可以是:所述樣品墊由玻璃纖維膜制成，所述標(biāo)記墊由聚酯纖維膜制成，所述包被膜為硝酸纖維素膜，所述吸水墊為粗纖維吸水紙，所述支撐被襯為聚氯乙烯板。
[0006]進(jìn)一步的:所述標(biāo)記墊包被的7D1單克隆抗體為膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體。
[0007]本發(fā)明的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條的制備方法為A、包被膜(4)的制備:
a.用硝酸纖維素膜制成包被膜(4)，并在包被膜(4)上同一面靠近標(biāo)記墊(3)端設(shè)置有檢測(cè)線(T)，另一端設(shè)置有質(zhì)控線(C)；
b.將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至包被濃度為0.15 mg/mL -0.50mg/mL,按包被量為每墊0.5 μ L -5 μ L得到檢測(cè)包被液，并將其包被在檢測(cè)線(T)上，該檢測(cè)線(T)能夠識(shí)別大片吸蟲(chóng)ES抗原；
c.將兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.10 mg/mL -0.50 mg/mL的濃度，按包被量為每墊0.5 μ L -5 μ L得到質(zhì)控包被液，并將其包被在質(zhì)控線(C)上，干燥，密封保存即得包被膜⑷；
B、標(biāo)記墊(3)的制備:
a.對(duì)抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗體標(biāo)記；
b.將膠體金和單克隆抗標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊5 μ L-25 μ L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被，然后將標(biāo)記墊干燥、密封保存即得標(biāo)記墊
(3)；
所述抗大片形吸蟲(chóng)的ES抗原的7D1單克隆抗體能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原；
C、樣品墊(2)的制備:用玻璃纖維膜制成樣品墊(2)；
D、將包被膜(4)、標(biāo)記墊(3)、樣品墊(2)依次從下往上搭接好后粘貼在支撐襯板(I)上，最后將吸水墊(5)搭接包被膜(4)上，即得到大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條。
膠體金的制備和單克隆抗標(biāo)記方法參考文獻(xiàn):《水牛伊氏錐蟲(chóng)病免疫膠體金試紙條的研制及初步應(yīng)用》，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)2011年42卷第7期。
[0008]進(jìn)一步的:D步驟中將標(biāo)記墊烘干的溫度為36° C_38° C，E步驟中干燥的溫度為36。C-38。Co
[0009]進(jìn)一步的:B步驟中將兔子進(jìn)行小鼠免疫球蛋白抗體的免疫方法是，把質(zhì)量濃度為lmg/mL的小鼠免疫球蛋白與弗氏完全佐劑按1:0.5-1.5比例混勻，按0.5ml_2.0ml /只兔子的劑量對(duì)兔子進(jìn)行腳掌皮下注射免疫；6_8天后，用質(zhì)量濃度為2mg/ml的小鼠IgG與弗氏不完全佐劑按1:0.5-1.5比例混勻，以0.5ml-2.0ml/只兔子的劑量對(duì)上述兔子進(jìn)行胭淋巴結(jié)注射二次免疫；9-11天后，按二次免疫的方法加強(qiáng)免疫一次。
[0010]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果:
1、由于本試紙條含有兩種大片形吸蟲(chóng)ES抗原識(shí)別抗體，即7D1單克隆抗體和7D4單克隆抗體，而且這兩種單克隆抗體是我們從制備的多個(gè)單克隆抗體中篩選鑒定出來(lái)的，因而使用本發(fā)明所述試劑條檢測(cè)大片吸蟲(chóng)特異性效果更好。
[0011]2、使用本試紙條進(jìn)行大片形吸蟲(chóng)感染的檢測(cè)，無(wú)需特殊檢測(cè)儀器設(shè)備，具有檢測(cè)費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)。
[0012]3、使用本試紙條進(jìn)行大片形吸蟲(chóng)感染的檢測(cè)，無(wú)需專業(yè)技術(shù)人員操作也可以完成測(cè)試，具有使用范圍廣，尤其適合廣大基層單位現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)使用。
[0013]4、與常用的間接酶聯(lián)免疫吸附法相比，使用本試紙條進(jìn)行大片形吸蟲(chóng)感染的檢測(cè)，能直接作出是否感染大片形吸蟲(chóng)的判斷，還可用于臨床大片吸蟲(chóng)治療效果的評(píng)價(jià)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是本發(fā)明的檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。I為支撐被襯，1-1為支撐被襯的手持端，2為樣品墊,3為標(biāo)記墊,4為包被膜,5為吸水墊，T為檢測(cè)線，C為質(zhì)控線?！揪唧w實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例是為了更好的理解本發(fā)明，不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制:
如圖1所示的本檢測(cè)試紙條，它包括有支撐被襯1，該支撐被襯上依次粘貼有包被膜4、標(biāo)記墊3和樣品墊2，在支撐被襯I的手持端1-1粘貼有吸水墊5 ;所述標(biāo)記墊3包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體，所述包被膜(4)上前部設(shè)有檢測(cè)線T，所述包被膜4上后部設(shè)有質(zhì)控線C，所述檢測(cè)線T包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體，質(zhì)控線C包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗體。
[0016]所述的玻璃纖維膜、聚酯纖維膜、硝酸纖維素膜(NC膜)、粗纖維吸水紙和聚氯乙烯板購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。
[0017]實(shí)施例1-4中涉及的材料來(lái)源和制備方法如下:
A、按常規(guī)方法制備抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原單克隆抗體，所述抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體和抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體本質(zhì)上為蛋白質(zhì),能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原。該常規(guī)方法來(lái)至公開(kāi)文獻(xiàn):《抗大片吸蟲(chóng)分泌排泄抗原單克隆抗體的制備及生物學(xué)活性的鑒定》，南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2012年43卷第9期；
B、兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的制備:把質(zhì)量濃度為lmg/mL的小鼠免疫球蛋白與弗氏完全佐劑1:1混勻，按Iml/只兔子的劑量對(duì)兔子進(jìn)行腳掌皮下注射免疫；7天后，用質(zhì)量濃度為2mg/ml的小鼠IgG與弗氏不完全佐劑1:1混勻，以0.5 mL/只兔子的劑量對(duì)上述兔子進(jìn)行胭淋巴結(jié)注射二次免疫；10天后，按二次免疫的方法加強(qiáng)免疫一次，免疫后，定期耳靜脈采血測(cè)定血清效價(jià)，血清效價(jià)到達(dá)后，心臟采血，分離血清；采用常規(guī)的辛酸一飽和硫酸銨法初步純化純后，再用portion G蛋白柱進(jìn)一步純化；當(dāng)用常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗效價(jià)為1:104，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定兔抗小鼠免疫球蛋白二抗?jié)舛葹?.22 mg/ml時(shí)，兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的制備完成，4°C冰箱保存待用；
C、按常規(guī)方法進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗標(biāo)記，常規(guī)方法參照文獻(xiàn):《水牛伊氏錐蟲(chóng)病免疫膠體金試紙條的研制與應(yīng)用》，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)2011年42卷第7期；
D、將上述C步驟制得的膠體金和標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊12.L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被，然后將標(biāo)記墊37°C烘干、密封保存；
E、將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至包被濃度為0.26 mg/mL，按包被量為每墊1.5 y L包被至包被膜的檢測(cè)線；兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.30 mg/mL的濃度，按包被量為每墊1.5 ii L包被至包被膜的C線，37°C干燥，密封保存；
F、將樣品墊、標(biāo)記墊、包被膜、吸水墊依次搭接粘貼在支撐襯板上，即得到本大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條。
[0018]上述步驟中，BCA法蛋白濃度試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物公司；
弗氏完全佐劑:Sigma公司；
弗氏不完全佐劑:Sigma公司；
Protein G蛋白柱:上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；
硫酸銨:國(guó)藥公司；
辛酸:Sigma公司產(chǎn)品； 其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 稀釋液配制(PH 7.2 0.0lmol/L PB緩沖溶液)；
稱取 Na2HP0412H20 0.2579g, NaH2P042H20 0.0437g 加雙蒸水至 IOOmL 調(diào)整 PH 值至
7.2，0.22 μ m微孔濾膜過(guò)濾，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]實(shí)施例1:
將按上述方法制備的膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊12.5μ L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被，然后將標(biāo)記墊37°C烘干、密封保存。
[0020]將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至0.26 mg/mL的濃度，按1.5 μ L的量包被至包被膜的檢測(cè)線T ;兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.30 mg/mL的濃度，按
1.5 μ L的量包被至包被膜的質(zhì)控線C，37°C干燥，密封保存
將樣品墊2、標(biāo)記墊3、包被膜4、吸水墊5依次搭接粘貼在PVC材料制成的支撐襯板上，大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條即制備完成。
[0021]本發(fā)明所述大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條，檢測(cè)標(biāo)本為糞液、血清、膽汁、乳液，使用本發(fā)明試紙條進(jìn)行大片形吸蟲(chóng)檢測(cè)時(shí)，取液體樣本液60-80 μ L直接滴加到樣品墊2上，樣本液中的靶標(biāo)物質(zhì)即大片形吸蟲(chóng)ES抗原，在纖維層毛細(xì)作用下沿著試紙條從沾液端向支撐被襯的手持端1-1移動(dòng)，待其移動(dòng)經(jīng)過(guò)標(biāo)記墊3時(shí)，大片形吸蟲(chóng)ES抗原即與標(biāo)記墊3上包被的膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體結(jié)合,并繼續(xù)向包被膜纖維層移動(dòng)，當(dāng)這種抗原抗體結(jié)合物移動(dòng)經(jīng)過(guò)包被膜檢測(cè)線T時(shí)，與檢測(cè)線T上包被的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致膠體金在檢測(cè)線T上聚集，使檢測(cè)線T顯色，其余膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體繼續(xù)向前遷移，遷移到質(zhì)控線C時(shí)由于膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體能與質(zhì)控線C上包被的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體特異性結(jié)合，因此，膠體金在質(zhì)控線C上聚集，使質(zhì)控線C顯色，即檢測(cè)線T和質(zhì)控線C同時(shí)顯色，表明待檢樣本液為陽(yáng)性。如果待檢樣本液沒(méi)有大片形吸蟲(chóng)ES抗原，那么，待檢樣本液遷移至檢測(cè)線T時(shí)，待檢樣本液沒(méi)有與檢測(cè)線T上包被的膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體結(jié)合的成分，從而導(dǎo)致膠體金不會(huì)聚集在檢測(cè)線T上，因此檢測(cè)線T不會(huì)顯色，但是質(zhì)控線C上仍然顯色，即此時(shí)僅有質(zhì)控線C顯色，表明待檢樣本液為陰性。檢測(cè)結(jié)果可在5-10鐘內(nèi)做出判斷。
[0022]實(shí)施例2
對(duì)大片形吸蟲(chóng)ES抗原的檢測(cè)靈敏度的驗(yàn)證測(cè)定。按照實(shí)施例1所述的檢測(cè)大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條制備方法制備試紙條。大片形吸蟲(chóng)ES抗原純化后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗原濃度為 0.94gm/mL，將抗原按 1:200、1:400、1:800，1:1600、1:3200、1:6400、1:12800進(jìn)行倍比稀釋后用試紙條檢測(cè)，每個(gè)稀釋度使用三根試紙條檢測(cè)，并設(shè)平行對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1.表I 試紙條檢測(cè)靈敏度測(cè)試結(jié)果
抗原稀釋倍數(shù) 200 400 800 1600 3200 6400 12800 抗原濃度(μ g) 47.00 2.35 1.18 0.59 0.29— 一
T線 顯色 顯色 顯色 顯色 顯色 不顯色不顯色
C線 顯色 顯色 顯色 顯色 顯色 顯色 顯色
從表I的結(jié)果可以看出，所述試紙條能檢測(cè)到大片形吸蟲(chóng)ES抗原的稀釋比例為1:3200，即所述試紙條檢測(cè)大片吸蟲(chóng)ES抗原的最低檢測(cè)濃度為0.29 u g/ml，證明所述試紙條具有較高的加測(cè)靈敏度。
[0023]實(shí)施例3
對(duì)大片形吸蟲(chóng)ES抗原的特異性驗(yàn)證測(cè)定。按照實(shí)施例1所述的檢測(cè)大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條制備方法制備試紙條，用大片吸蟲(chóng)ES抗原，胰擴(kuò)盤(pán)吸蟲(chóng)抗原、前后盤(pán)吸蟲(chóng)抗原、弓形蟲(chóng)抗原、伊氏錐蟲(chóng)抗原做特異性試驗(yàn)，并做陰性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0024]表2 試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果
抗原大片形吸蟲(chóng)ES抗原胰擴(kuò)盤(pán)吸蟲(chóng)抗原前后盤(pán)吸蟲(chóng)抗原弓形
蟲(chóng)抗原伊氏錐蟲(chóng)抗原
檢測(cè)線T 顯色不顯色不顯色不顯色不顯色 質(zhì)控線C 顯色顯色顯色顯色顯色
從表2的結(jié)果可以看出，只有在檢測(cè)大片性吸蟲(chóng)ES抗原時(shí)，試紙條上的檢測(cè)線T和質(zhì)控線C才同時(shí)顯色為，而檢測(cè)其他抗原時(shí)只有質(zhì)控線C顯色。
[0025]證明用所述的檢測(cè)大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗原，旋毛蟲(chóng)抗原，巴貝斯焦蟲(chóng)抗原，衣原體抗原時(shí)，不與這些抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明所述的檢測(cè)大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條具有良好的檢測(cè)特異性。
[0026]實(shí)施例4
臨床樣本大片形吸蟲(chóng)ES抗原的檢測(cè)。按照實(shí)施例1所述的檢測(cè)大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條制備方法制備試紙條。在廣西南寧地區(qū)采集新鮮水牛糞樣做為檢測(cè)樣本。樣本處理方法:新鮮糞與滅菌雙蒸水比1:1(5§+51111)，加入雙蒸水后搖勻，30001r/min離心，取上清于_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，各樣本取60-80 u L樣本液直接滴加到各試紙條樣品墊3上，5-10min后觀察結(jié)果，檢測(cè)線T、質(zhì)控線C均顯色，表示陽(yáng)性；只有質(zhì)控線C顯色，表示陰性；若只有檢測(cè)線T顯色或沒(méi)有顯示條帶，為無(wú)效結(jié)果。共檢測(cè)了 334頭份樣本，在對(duì)照成立的前提下，結(jié)果試紙條檢出陽(yáng)性129份，臨床樣本陽(yáng)性率為 38.62%。
[0027]實(shí)施例5
步驟一、制備兔抗小鼠免疫球蛋白抗體:把質(zhì)量濃度為lmg/mL的小鼠免疫球蛋白與弗氏完全佐劑按1:0.5-1.5比例混勻，按0.5ml-2.0ml /只兔子的劑量對(duì)兔子進(jìn)行腳掌皮下注射免疫；6_8天后，用質(zhì)量濃度為2mg/ml的小鼠IgG與弗氏不完全佐劑按1:0.5-1.5比例混勻，以0.5ml-2.0ml/只兔子的劑量對(duì)上述兔子進(jìn)行胭淋巴結(jié)注射二次免疫；9_11天后，按二次免疫的方法加強(qiáng)免疫一次，免疫后，定期耳靜脈采血測(cè)定血清效價(jià)，血清效價(jià)到達(dá)后，心臟米血，分尚血清；米用常規(guī)的羊酸一飽和硫酸銨法初步純化純后，再用portionG蛋白柱進(jìn)一步純化；當(dāng)用常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗效價(jià)為1:104，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定兔抗小鼠免疫球蛋白二抗?jié)舛葹?.22 mg/ml時(shí)，兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的制備完成，在4°C的條件下保存待用。
[0028]步驟二、然后將兔抗小鼠免疫球蛋白抗體包被在質(zhì)控線C上，將抗大片形吸蟲(chóng)ES(分泌排泄)抗原的7D4單克朗抗體包被在檢測(cè)線T上；將質(zhì)控線C和檢測(cè)線T分別包被在包被膜4的兩端，質(zhì)控線C和檢測(cè)線T均能識(shí)別大片吸蟲(chóng)ES抗原；
步驟三、以常規(guī)的方法進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗標(biāo)記； 步驟四、將膠體金和單克隆抗標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊5 μ L-25 μ L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被,然后將標(biāo)記墊干燥、密封保存,所述抗大片形吸蟲(chóng)的ES抗原的7D1單克隆抗體能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原；
步驟五、將玻璃纖維膜制成的樣品墊2、聚酯纖維膜制成的標(biāo)記墊3、硝酸纖維膜制成的包被膜4、粗纖維吸水紙制成的吸水墊5依次搭接粘貼在支撐襯板I上，即得到本大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條。
[0029]實(shí)施例6
步驟Α、包被膜4的制備:
a.用硝酸纖維素膜制成包被膜4，并在包被膜4上同一面靠近標(biāo)記墊3端設(shè)置有檢測(cè)線T，另一端設(shè)置有質(zhì)控線C ;
b.將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至包被濃度為0.15 mg/mL,按包被量為每墊0.5 μ L得到檢測(cè)包被液，并將其包被在檢測(cè)線T上，該檢測(cè)線T能夠識(shí)別大片吸蟲(chóng)ES抗原；
c.將兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.10 mg/mL的濃度，按包被量為每墊0.5 μ L得到質(zhì)控包被液，并將其包被在質(zhì)控線C上，干燥，密封保存即得包被膜4 ；
步驟B、標(biāo)記墊3的制備:
a.對(duì)抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗體標(biāo)記；
b.將膠體金和單克隆抗標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊5μ L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被，然后將標(biāo)記墊干燥、密封保存即得標(biāo)記墊3 ；
所述抗大片形吸蟲(chóng)的ES抗原的7D1單克隆抗體能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原；
步驟C、樣品墊2的制備:
用玻璃纖維膜制成樣品墊2 ；
步驟D、將各部件組合成為大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條:
將包被膜4、標(biāo)記墊3、樣品墊2依次從下往上搭接好后粘貼在支撐襯板I上，最后將吸水墊5搭接包被膜4上，即得到大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條。
[0030]實(shí)施例7
步驟Α、包被膜4的制備:
a.用硝酸纖維素膜制成包被膜4，并在包被膜4上同一面靠近標(biāo)記墊3端設(shè)置有檢測(cè)線T，另一端設(shè)置有質(zhì)控線C ;
b.將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至包被濃度為0.50 mg/mL,按包被量為每墊5 μ L得到檢測(cè)包被液，并將其包被在檢測(cè)線T上，該檢測(cè)線T能夠識(shí)別大片吸蟲(chóng)ES抗原；
c.將兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.50 mg/mL的濃度，按包被量為每墊5 μ L得到質(zhì)控包被液，并將其包被在質(zhì)控線C上，干燥，密封保存即得包被膜4 ；
步驟B、標(biāo)記墊3的制備:
a.對(duì)抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗體標(biāo)記；
b.將膠體金和單克隆抗標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊5 μ L-25 μ L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被，然后將標(biāo)記墊干燥、密封保存即得標(biāo)記墊3 ；
所述抗大片形吸蟲(chóng)的ES抗原的7D1單克隆抗體能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原； 步驟C、樣品墊2的制備:
用玻璃纖維膜制成樣品墊2 ；
步驟D、將各部件組合成為大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條:
將包被膜4、標(biāo)記墊3、樣品墊2依次從下往上搭接好后粘貼在支撐襯板I上，最后將吸水墊5搭接包被膜4上，即得到大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條。
[0031]實(shí)施例8
步驟A、包被膜4的制備:
a.用硝酸纖維素膜制成包被膜4，并在包被膜4上同一面靠近標(biāo)記墊3端設(shè)置有檢測(cè)線T，另一端設(shè)置有質(zhì)控線C ;
b.將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至包被濃度為0.30 mg/mL,按包被量為每墊2.5 y L得到檢測(cè)包被液，并將其包被在檢測(cè)線T上，該檢測(cè)線T能夠識(shí)別大片吸蟲(chóng)ES抗原；
c.將兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.30mg/mL的濃度，按包被量為每墊2.5 ii L得到質(zhì)控包被液，并將其包被在質(zhì)控線C上，干燥，密封保存即得包被膜4 ；
步驟B、標(biāo)記墊3的制備:
a.對(duì)抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗體標(biāo)記；
b.將膠體金和單克隆抗標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊5 V- L-25 V- L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被，然后將標(biāo)記墊干燥、密封保存即得標(biāo)記墊3 ；
所述抗大片形吸蟲(chóng)的ES抗原的7D1單克隆抗體能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原；
步驟C、樣品墊2的制備:
用玻璃纖維膜制成樣品墊2 ；
步驟D、將各部件組合成為大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條:
將包被膜4、標(biāo)記墊3、樣品墊2依次從下往上搭接好后粘貼在支撐襯板I上，最后將吸水墊5搭接包被膜4上，即得到大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條。
[0032]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:包括有支撐被襯(I)，該支撐被襯上依次粘貼有包被膜(4)、標(biāo)記墊(3)和樣品墊(2)，在所述支撐被襯(I)的手持端(1-1)粘貼有吸水墊(5);所述標(biāo)記墊(3)包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體，所述包被膜(4)上前部設(shè)有檢測(cè)線(T)，所述包被膜(4)上后部設(shè)有質(zhì)控線(C)，所述檢測(cè)線(T)包被有抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體，所述質(zhì)控線(C)包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述樣品墊(2)由玻璃纖維膜制成，所述標(biāo)記墊(3)由聚酯纖維膜制成，所述包被膜(4)為硝酸纖維素膜，所述吸水墊(5)為粗纖維吸水紙，所述支撐被襯為聚氯乙烯板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條，其特征在于:所述標(biāo)記墊(3)包被的7D1單克隆抗體為膠體金標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1-3所述的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于其制備步驟如下: A、包被膜(4)的制備； a.由硝酸纖維素膜制成包被膜(4)上同一面的兩端分別設(shè)置有檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)； b.檢測(cè)線(T)設(shè)置在包被膜(4)的一端，檢測(cè)線(T)上包被有大片吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體，能夠識(shí)別大片吸蟲(chóng)ES抗原； c.質(zhì)控線(C)設(shè)置在包被膜(4)的另一端，質(zhì)控線(C)包被有兔抗小鼠免疫球蛋白抗體； d.將抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D4單克隆抗體稀釋至包被濃度為0.15 mg/mL -0.50mg/mL,按包被量為每墊0.5 ii L -5 ii L包被至包被膜的檢測(cè)線(T)上；兔抗小鼠免疫球蛋白抗體稀釋至0.10 mg/mL -0.50 mg/mL的濃度,按包被量為每墊0.5 y L -5 u L包被至包被膜的質(zhì)控線(C)上，干燥，密封保存； B、標(biāo)記墊(3)的制備； a.以常規(guī)的方法進(jìn)行膠體金的制備和單克隆抗標(biāo)記； b.將膠體金和單克隆抗標(biāo)記的抗大片形吸蟲(chóng)ES抗原的7D1單克隆抗體1:5稀釋后，以每墊L-25ii L的量噴點(diǎn)在標(biāo)記墊進(jìn)行包被,然后將標(biāo)記墊干燥、密封保存,所述抗大片形吸蟲(chóng)的ES抗原的7D1單克隆抗體能特異識(shí)別大片形吸蟲(chóng)ES抗原； C、樣品墊(2)的制備； 樣品墊(2)由玻璃纖維膜制成； D、將樣品墊(2)、標(biāo)記墊(3 )、包被膜(4 )、吸水墊(5 )依次搭接粘貼在支撐襯板(I)上，即得到本大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)紙條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于: D步驟中將標(biāo)記墊烘干的溫度為36° C-38° C，E步驟中干燥的溫度為36° C_38° C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4或5所述的大片形吸蟲(chóng)免疫層析快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于:兔抗小鼠免疫球蛋白抗體的制備方法是，把質(zhì)量濃度為lmg/mL的小鼠免疫球蛋白與弗氏完全佐劑按1:0.5-1.5比例混勻，按0.5ml-2.0ml /只兔子的劑量對(duì)兔子進(jìn)行腳掌皮下注射免疫；6_8天后，用質(zhì)量濃度為2mg/ml的小鼠IgG與弗氏不完全佐劑按1:0.5-1.5比例混勻，以0.5ml-2.0ml/只兔子的劑量對(duì)上述兔子進(jìn)行胭淋巴結(jié)注射二次免疫；9-11天后，按二次免疫的方法加強(qiáng)免疫一次，免疫后，定期耳靜脈采血測(cè)定血清效價(jià)，血清效價(jià)到達(dá)后，心臟采血，分離血清；采用常規(guī)的辛酸一飽和硫酸銨法初步純化純后，再用portion G蛋白柱進(jìn)一步純化；當(dāng)用常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定的兔抗小鼠免疫球蛋白二抗效價(jià)為1:104，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定兔抗小鼠免疫球蛋白二抗?jié)舛葹?.22 mg/ml時(shí)，兔抗小鼠免疫 球蛋白抗體的制備完成，在4°C的條件下保存待用。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103454418SQ201310252654
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月24日
【發(fā)明者】陳漢忠, 王華俊, 李義平 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)