專利名稱：一種測定虎杖中白藜蘆醇含量的高效液相色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種虎杖中白藜蘆醇含量的高效液相色譜測定方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(Resveratrol)是植物體內(nèi)產(chǎn)生的天然二苯乙烯類多酚物質(zhì)(結(jié)構(gòu)式見附圖1)，分子式為C14H12O3，化學(xué)名為3，4'，5_三羥基芪，白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，又稱為芪三酚。白藜蘆醇存在于虎杖、葡萄等植物中，虎杖中白藜蘆醇的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葡萄等其他植物。隨著對(duì)白藜蘆醇研究的深入，其廣泛的藥理作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，如抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老及免疫調(diào)節(jié)等，他還能減輕多種因素造成的組織器官損傷及保護(hù)肝細(xì)胞的作用。白藜蘆醇在心血管系統(tǒng)方面的作用包括抗氧化、清除自由基作用、抑制血小板聚集、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化及預(yù)防癌癥等多種藥理作用。美國農(nóng)業(yè)部的研究結(jié)果表明，白藜蘆醇對(duì)激素依賴性腫瘤有明顯的預(yù)防作用，還可對(duì)骨質(zhì)疏松、痤瘡及老年癡呆癥有預(yù)防作用，對(duì)人體內(nèi)部一種單體抗衰老酶起作用，進(jìn)而發(fā)揮預(yù)防各種年齡相關(guān)疾病、延長預(yù)期壽命的潛在作用。

20世紀(jì)90年代以來，國外對(duì)葡萄酒中白藜蘆醇的保健作用、檢測方法進(jìn)行了大量研究，國內(nèi)尚未見到對(duì)虎杖中白藜蘆醇含量測定的報(bào)道，而在本發(fā)明的樣品濃度與峰面積線性關(guān)系中，白藜蘆醇的濃度范圍最小可至IOii g/ml，最大可達(dá)IOOOii g/ml，線性關(guān)系中濃度范圍較大；本發(fā)明還具有分離效果好，測定準(zhǔn)確，靈敏度高，分析簡便快速等技術(shù)特點(diǎn)，可見，目前建立穩(wěn)定的HPLC檢測虎杖中白藜蘆醇含量的方法非常關(guān)鍵，具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、分離效果好、靈敏度高、精密度和準(zhǔn)確性更高的白藜蘆醇含量檢測方法。為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:本發(fā)明選用流動(dòng)相中甲醇的體積百分比由80%遞減至50%，優(yōu)選甲醇體積分?jǐn)?shù)為55% ;超純水的體積百分比由20%遞增至50%，優(yōu)選超純水的體積分?jǐn)?shù)為45%。本發(fā)明HPLC方法中，其特點(diǎn)在于選用上述的流動(dòng)相，按上述流動(dòng)相所得白藜蘆醇樣品圖譜有較好的峰形(圖譜見附圖2)和分離效果。本發(fā)明HPLC分析方法進(jìn)樣量為5 yl，利用標(biāo)準(zhǔn)品溶液多次進(jìn)樣來進(jìn)行進(jìn)樣精密度試驗(yàn)，進(jìn)樣次數(shù)為6次，RSD值為0.02%，進(jìn)樣精密度非常好。


圖1為白藜蘆醇結(jié)構(gòu)式圖2為本發(fā)明白藜蘆醇HPLC檢測圖譜圖3為白藜蘆醇標(biāo)樣濃度與峰面積線性關(guān)系圖4為白藜蘆醇室內(nèi)放置不同時(shí)間吸光度的變化
圖5為白藜蘆醇在不同溫度下吸光度變化
具體實(shí)施例方式在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明的詳細(xì)分析方法，但本發(fā)明并不局限于下述詳細(xì)分析方法。實(shí)施例1白藜蘆醇含量測定的高效液相色譜方法-1色譜條件:采用美國Agilent-1260高效液相色譜儀，Chemstation Edition色譜
工作站色譜柱:ThermoBDS-C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m)流動(dòng)相:甲醇:水=55: 45 (體積比)
檢測溫度:30°C檢測器:紫外檢測器檢測波長:306nm真空泵:SHB_m循環(huán)水式真空泵電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司提供，規(guī)格為十萬分之一流動(dòng)相的制備:流動(dòng)相按照甲醇:水=55: 45 (體積比)混合，0.2 U m孔徑過濾器過濾，SCQ-250W超聲波超聲脫氣。采用外標(biāo)法，需要分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品溶液進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:精密稱取50mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量流動(dòng)相超聲5seC0nds使樣品完全溶解后再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度線，作為儲(chǔ)備液，再精密量取儲(chǔ)備液1ml，置于IOml的棕色容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。待測樣品制備:精密稱取與標(biāo)準(zhǔn)品同等重量的待測樣品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量流動(dòng)相超聲5seC0nds使樣品完全溶解后再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度線。再精密量取1ml，溶液置于IOml的棕色容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。根據(jù)含量計(jì)算公式:
內(nèi)藜蘆醇含量(％、=待測!樣品峰面f只X彳寺測樣品'濃度 ° ~標(biāo)準(zhǔn)品峰面積X標(biāo)準(zhǔn)品濃度帶入數(shù)據(jù)即可得到白藜蘆醇含量。以上標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品均配制3份，絕對(duì)誤差不超過0.2%。實(shí)施例2白藜蘆醇含量測定的高效液相色譜方法-2色譜條件:采用美國LabAlliance高效液相色譜儀，EZChrom Elite Client色譜工作站色譜柱:SMT-SAM-C18(250mm X 4.6mm，5 y m)流動(dòng)相:甲醇:水=55: 45 (體積比)檢測溫度:30°C檢測器:SPECTRASTSTEM, UV6000LP 紫外檢測器
檢測波長:306nm真空泵:SHB_m循環(huán)水式真空泵電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司提供，規(guī)格為十萬分之一流動(dòng)相的制備:流動(dòng)相按照甲醇:水=60: 40 (體積比)混合，0.2um孔徑過濾器過濾，SCQ-250W超聲波超聲脫氣。采用外標(biāo)法，需要分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品溶液進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:精密稱取50mg標(biāo)準(zhǔn)品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超聲5seC0nds使樣品完全溶解后再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度線，作為儲(chǔ)備液，再精密量取儲(chǔ)備液1ml，置于IOml的棕色容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。待測樣品制備:精密稱取與標(biāo)準(zhǔn)品同等重量的待測樣品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超聲5seC0nds使樣品完全溶解后再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度線。再精密量取1ml，溶液置于IOml棕色的容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。根據(jù)含量計(jì)算公式:
白薬蘆醇含量=待測樣品峰面積X待測樣品濃度 ° 標(biāo)準(zhǔn)品峰面積X標(biāo)準(zhǔn)品濃度帶入數(shù)據(jù)即可得到白藜蘆醇含量。以上標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣 品均配制3份，絕對(duì)誤差不超過0.2%。實(shí)施例3白藜蘆醇含量測定的高效液相色譜方法-3色譜條件:采用美國Agilent-1260高效液相色譜儀，Chemstation Edition色譜
工作站色譜柱:ThermoBDS-C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m)流動(dòng)相:甲醇:水=55: 45 (體積比)檢測溫度:30°C檢測器:紫外檢測器檢測波長:306nm真空泵:SHB_m循環(huán)水式真空泵電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司提供，規(guī)格為十萬分之一流動(dòng)相的制備:流動(dòng)相按照乙腈:水=52: 48 (體積比)混合，0.2um孔徑過濾器過濾，SCQ-250W超聲波超聲脫氣。采用外標(biāo)法，需要分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品溶液進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備:精密稱取50mg標(biāo)準(zhǔn)品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超聲5seC0nds使樣品完全溶解后再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度線，作為儲(chǔ)備液，再精密量取儲(chǔ)備液1ml，置于IOml棕色的容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。待測樣品制備:精密稱取與標(biāo)準(zhǔn)品同等重量的待測樣品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超聲5seC0nds使樣品完全溶解后再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度線。再精密量取1ml，溶液置于IOml棕色的容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度。根據(jù)含量計(jì)算公式:
權(quán)利要求
1.一種虎杖中白藜蘆醇含量測定的高效液相色譜(HPLC)方法，其特征在于流動(dòng)相為甲醇與水的混合溶液，其中選擇甲醇的體積分?jǐn)?shù)分別為80^^65%和50%，水的體積分?jǐn)?shù)分別為20^^35%和50%，最后優(yōu)選出峰時(shí)間和峰型最好的甲醇體積分?jǐn)?shù)55%，水體積分?jǐn)?shù)45%作為系統(tǒng)檢測的流動(dòng)相。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充物的反相色譜柱。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，使用紫外檢測器，檢測波長為306nm，柱溫30°C，流速為0.8ml/min,進(jìn)樣體積為5 y I。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于配制的樣品溶液濃度為lmg/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于本HPLC法采用外標(biāo)法進(jìn)行白藜蘆醇的含量測定，濃度與峰面 積線性關(guān)系中濃度范圍為6 ii g 200ii g/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種虎杖中自藜蘆醇含量的高效液相色譜測定方法，色譜柱Thermo BDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇∶水＝55∶45(體積比)；檢測溫度30℃；進(jìn)樣量5μl；流速0.8ml/min；檢測器紫外檢測器；檢測波長306nm。白藜蘆醇在10μg/ml～200μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r＝1。高效液相色譜法檢測白藜蘆醇含量的方法，具有分離效果好，精確度好，靈敏度高，分析簡便快速等技術(shù)特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/26GK103235070SQ20131017597
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月14日
發(fā)明者彭學(xué)東, 張梅, 趙金召, 楊艷麗 申請(qǐng)人:張家港威勝生物醫(yī)藥有限公司