專利名稱：抗Cyfip蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗Cyfip蛋白的單克隆抗體,產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脆性X染色體綜合癥是人類常見(jiàn)的遺傳性智力發(fā)育遲滯疾病，在男性人群中的發(fā)病率為 1/3000 4000，女性人群中約為 1/6000 1/8000 (Hantash et al.,2010)。研究認(rèn)為，脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein, FMRP)缺失是導(dǎo)致該疾病癥候群的主要原因(P印rah，2012 ;Santoro et al.，2012)。FMRP主要在神經(jīng)系統(tǒng)富集，已有的研究結(jié)果提示FMRP通過(guò)識(shí)別結(jié)合特殊的RNA結(jié)構(gòu)，調(diào)控其靶mRNA的運(yùn)輸、翻譯和/或穩(wěn)定，從而在神經(jīng)突觸發(fā)揮功能(Schaeffer et al.，2001)。然而，到目前為止，F(xiàn)MRP究竟通過(guò)什么分子機(jī)制造成脆性X染色體綜合癥的一系列病理變化仍然不清楚。Schenck等人2001年的研究中報(bào)道了一個(gè)在胞質(zhì)內(nèi)與FMRP互作的蛋白Cyfip(cytoplasmic FMRP interacting protein) (Schenck et al., 2001) 根據(jù)對(duì)已知序列的分析,Cyfip屬于一個(gè)保守的蛋白家族。人類有兩個(gè)同源蛋白，分別稱為Cyfipl和Cyfip2,它們同小鼠中相應(yīng)的同源蛋白具有98.7%的序列一致性和99.9%的相似性。在果蠅和線蟲(chóng)中各有一個(gè)Cyfip同源蛋白，與人類的蛋白序列比對(duì)分別具有67%和51%的一致性。目前對(duì)Cyfip功能的認(rèn)識(shí)還十分有限。在對(duì)多發(fā)性硬化病人的研究中發(fā)現(xiàn)，Cyfip2在T細(xì)胞中過(guò)高表達(dá)導(dǎo)致T細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減弱，推測(cè)這與多發(fā)性硬化病理過(guò)程中神經(jīng)炎性、脫髓鞘、軸突缺失等病理變化密切相關(guān)(Mayne et al.,2004)。在果蠅和線蟲(chóng)的研究中也發(fā)現(xiàn)Cyfip缺失會(huì)造成神經(jīng)軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向障礙(Bogdan et al., 2004 ；Kawano et al., 2005 ；Schenck etal., 2003) ο 另一方面，Cyf ip 還能特異性的與 Rho GTPase Racl 結(jié)合(Kobayashi et al.,1998)，提示Cyfip可能 還參與了 Rho GTPase信號(hào)途徑，而這一途徑中也有數(shù)個(gè)成員與人類智力低下疾病密切相關(guān)(Vaillend et al.,2008)。由此可見(jiàn)，Cyfip對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能起著非常重要的作用。然而，Cyfip究竟如何發(fā)揮功能，它如何參與FMRP介導(dǎo)的局部翻譯調(diào)控途徑和GTPase介導(dǎo)的細(xì)胞骨架調(diào)控途徑，以及這兩條途徑之間如何相互作用調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能仍然不清楚。所以，Cyfip為研究神經(jīng)發(fā)育和功能的調(diào)控提供了新的切入點(diǎn)。同時(shí)，作為一個(gè)進(jìn)化上十分保守的蛋白，對(duì)Cyfip功能的研究也為了解人類智力低下疾病的病因病理提供了線索。為了研究Cyfip的功能，Schenck等以及Bogdan等分別獨(dú)立制備了針對(duì)果蠅Cyfip蛋白的兔源多克隆抗體，這兩個(gè)多抗能夠識(shí)別果蠅胚胎的內(nèi)源Cyfip蛋白(Bogdanet al., 2004 ；Schenck et al.,2003)。然而,眾所周知，與單克隆抗體相比多克隆抗體還是有一些局限性。首先，多抗是多種種類和亞類的免疫球蛋白的混合物，所以即便是使用相同抗原制備的不同批次的多抗也不能保證其一致性；而單抗只有一種免疫球蛋白亞類，是純度很高的均一抗體，每個(gè)抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基酸順序都相同，單抗一旦制備成功就可以永續(xù)生產(chǎn)完全一致的抗體。其次，多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差，較易引起交叉反應(yīng)；而單抗針對(duì)抗原的單一的決定簇，所以特異性強(qiáng)，敏感性高，一般不發(fā)生交叉反應(yīng)。加之考慮到免疫沉淀、免疫熒光、細(xì)胞免疫化學(xué)以及免疫組化等試驗(yàn)對(duì)抗體的應(yīng)用要求，制備針對(duì)Cyfip蛋白的單克隆抗體是目前研究Cyfip功能的首要任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種雜交瘤細(xì)胞，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.7409。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由雜交瘤細(xì)胞CGMCC N0.7409分泌得到的單克隆抗體。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供所述單克隆抗體在檢測(cè)或標(biāo)記Cyfip蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)或標(biāo)記Cyfip蛋白的產(chǎn)品中的應(yīng)用。具體的,所述Cyfip蛋白為果蠅內(nèi)源Cyfip蛋白。本發(fā)明制備了針對(duì)果蠅Cyfip蛋白N端1-300氨基酸的鼠源單克隆抗體。單抗制備過(guò)程如圖1所示，簡(jiǎn)而言之:設(shè)計(jì)免疫原序列并使用免疫原免疫動(dòng)物(Balb/c小鼠)，取尾血檢測(cè)后選擇滴度高的小鼠進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞融合，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株并克隆化，驗(yàn)證后收集純化單克隆抗體并凍存細(xì)胞株。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)初篩復(fù)篩后得到6個(gè)陽(yáng)性單克隆抗體(如圖2所示)，其中2F5單抗具有較高的靈敏度(如圖4所示)。蛋白免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)6個(gè)單抗都能識(shí)別體外重組的Cyfip抗原(如圖3所示)。挑選2F5單抗進(jìn)一步純化，純化后的單抗在Western Blot檢測(cè)正常果蠅大腦提取物中識(shí)別單一目的條帶，而在Cyfip缺失的突變體果蠅中不能檢測(cè)出條帶(如圖5所示)。免疫組化染色實(shí)驗(yàn)顯示，在神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)表達(dá)Cyfip的果蠅中，2F5單抗能夠清晰的標(biāo)記大腦腹側(cè)神經(jīng)節(jié)中規(guī)則排列的神經(jīng)元胞體(如圖6中右側(cè)圖片所示)。綜上所述，本發(fā)明制備的鼠源單克隆抗體2F5能夠特異地檢測(cè)和標(biāo)記果蠅內(nèi)源的Cyfip蛋白。


圖1為單克隆抗體制備的流程圖。圖2為6個(gè)抗Cyfip蛋白單克隆抗體的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相應(yīng)的OD值，其中*表示超出測(cè)量上限。圖3為6個(gè)抗Cyfip蛋白單克隆抗體識(shí)別體外重組Cyfip蛋白的Western Blot檢測(cè)結(jié)果圖4為抗Cyfip蛋白單克隆抗體2F5的靈敏度檢測(cè)及相應(yīng)OD值，其中*表示超出測(cè)量上限。圖5為抗Cyfip蛋白單克隆抗體2F5識(shí)別野生型和cyfip基因缺失突變體果蠅大腦蛋白中Cyfip蛋白的Western Blot結(jié)果,其中WT表示野生型果蠅,cyffip表示cyfip基因缺失突變體果蠅cyfip851。圖6為抗Cyfip蛋白單克隆抗體2F5識(shí)別野生型和在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過(guò)量表達(dá)Cyfip蛋白的果蠅大腦腹側(cè) 神經(jīng)節(jié)中Cyfip蛋白的免疫熒光標(biāo)記結(jié)果，其中WT表示野生型果蠅，cyfipN0E表示在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過(guò)量表達(dá)Cyfip蛋白的果蠅。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、分泌抗Cyfip蛋白單克隆抗體的雜交瘤的制備單克隆抗體制備的流程圖如圖1所示，具體步驟如下所述:1.免疫小鼠小鼠的選擇:選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠齡在8 12周。免疫原的制 備:以Cyfip蛋白N端第1_300氨基酸殘基和組氨酸標(biāo)簽的體外重組蛋白作為免疫原。Cyfip蛋白N端第1-300氨基酸殘基的具體氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。重組Cyfip蛋白的具體制備方法如下:人工合成SEQ ID N0.2所示基因。將SEQ ID N0.2所示基因插入表達(dá)載體pET30a的EcoR I和Xhol酶切位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體，記作重組表達(dá)載體CYl-His。將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌BL-21，得到重組菌。重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，鎳柱親和層析純化得到重組蛋白。用免疫原多次免疫上述Balb/c健康雌性小鼠，采小鼠尾靜脈血清測(cè)效價(jià)，選取血清效價(jià)高的陽(yáng)性小鼠用于細(xì)胞融合。2.細(xì)胞融合免疫小鼠處死，取脾臟制備脾細(xì)胞懸液，稀釋計(jì)數(shù)待用。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的(活細(xì)胞數(shù)> 95% )骨髓瘤細(xì)胞，稀釋計(jì)數(shù)待用。脾細(xì)胞與骨髓瘤按比例混合，加入助融劑攪拌細(xì)胞。終止融合后，細(xì)胞重懸，培養(yǎng)觀察。HAT培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞，在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞為發(fā)生了細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞。3.篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞融合后當(dāng)雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)到一定大小，收集上清，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法和Western Blot方法檢測(cè)抗體識(shí)別體外重組Cyfip蛋白的活性，從而得到分泌識(shí)別重組Cyfip蛋白的抗體的雜交瘤細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。WesternBlot方法檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果共篩選到6個(gè)分泌抗重組Cyfip蛋白的抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中，2F5雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗的免疫性和特異性較強(qiáng)。將2F5雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行保藏，保藏中心的名稱是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年4月3日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7409，分類命名為小鼠雜交瘤細(xì)胞。實(shí)施例2、單抗的制備及性能檢測(cè)一、單抗的制備1.老鼠致敏液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6 8周，注射體積500ul/只。10天后可制備腹水。2.注射細(xì)胞收集雜交瘤細(xì)胞并用1640或PBS洗細(xì)胞兩遍，取100到150萬(wàn)細(xì)胞注射于老鼠腹腔，一周后可見(jiàn)老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大
3.腹水采集注射細(xì)胞一周后用無(wú)菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡。采集到的腹水用PiOtein-G免疫親和層析方法進(jìn)行純化得到單克隆抗體。二、單抗的靈敏度檢測(cè)使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法對(duì)單抗的靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。1.抗原包被Cyfip重組蛋白(即實(shí)施例1制備的免疫原)用包被液稀釋后按100、30、10、3ng/孔的梯度加入聚苯乙烯酶聯(lián)檢測(cè)板相應(yīng)孔中，4°C包被過(guò)夜后，洗液洗滌3次。2.封閉每孔加200 μ I封閉液，37°C兩小時(shí)(或4°C過(guò)夜)后，洗滌3次，拍干。3.ELISA 檢測(cè)Cyfip單抗稀釋1000倍后100 μ I/孔加入包被好的酶標(biāo)板，取小鼠心血同比稀釋作為陽(yáng)性對(duì)照，以5% miIk-PBS為陰性對(duì)照，37°C孵育30min，洗滌3次，拍干。羊抗鼠IgG (H+L)酶標(biāo)二抗37°C孵育30min，洗滌3次，拍干。加入等體積顯色液A液、B液37°C顯色15min，反應(yīng)結(jié)束后加入終止液。4.讀數(shù)以450nm單波長(zhǎng) 測(cè)定各孔OD值，以與陰性對(duì)照孔OD值的比值大于2.1為限，作為判斷為陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，本發(fā)明單抗的最低檢測(cè)限至少可達(dá)到0.03μ g/ml。三、單抗的特異性檢測(cè)1.蛋白樣品制備分別解剖野生型果蠅和突變體果蠅幼蟲(chóng)大腦，加入裂解液研磨勻漿，分裝保存?zhèn)溆?。突變體果蜆幼蟲(chóng)為cyfip85.1,記載在文獻(xiàn)“CYFIP/Sra-lcontrols neuronalconnectivity in Drosophila andlinks the RaclGTPase pathway to the Fragile Xprotein.(Schenck et al.，2003) ”中。現(xiàn)有技術(shù)中記載:野生型果蠅幼蟲(chóng)大腦中含有Cyfip蛋白，突變體果蠅幼蟲(chóng)大腦中不含有Cyfip蛋白。2.跑膠配制分離膠、濃縮膠，制膠板。蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性，加入膠孔，置于電泳槽中恒定電壓電泳分離。3.轉(zhuǎn)膜PVDF膜置甲醇中浸泡飽和，濾紙、海綿置轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡。膠取出適當(dāng)裁修，置轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。按海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿的順序組裝，膠置于負(fù)極恒定電流轉(zhuǎn)膜。4.免疫雜交與顯色PBST緩沖液洗膜，5%脫脂牛奶封閉。取實(shí)驗(yàn)一用雜交瘤細(xì)胞2F5制得的單抗，單抗的起始濃度為5.007mg/ml，l: 500稀釋，室溫孵育2小時(shí)或4°C過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育I小時(shí)，發(fā)光工作液顯色，曝光。結(jié)果見(jiàn)圖5，2F5單抗在正常果蠅大腦提取物中識(shí)別單一目的條帶，而在Cyfip缺失的突變體果蠅中不能檢測(cè)出條帶。Western檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明制備的鼠源單克隆抗體2F5能夠特異地檢測(cè)果蠅內(nèi)源的Cyfip蛋白。四、單抗的應(yīng)用1.免疫組化染色樣品制備分別挑選野生型和突變體爬山試管壁的三齡果蠅幼蟲(chóng)，在解剖盤上置于HL3解剖液中解剖出大腦及腹側(cè)神經(jīng)節(jié)，4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，隨即用含0.3% Triton的PBST緩沖液清洗。過(guò)表達(dá)果蠅幼蟲(chóng)為cyfip.，記載在文獻(xiàn)“CYFIP/Sra-lcontrolsneuronal connectivity in Drosophila and links the Racl GTPase pathway to theFragile X protein.(Schenck et al.，2003)”中?，F(xiàn)有技術(shù)中記載:野生型果蠅幼蟲(chóng)大腦中含有Cyfip蛋白，過(guò)表達(dá)果蠅cyfipN°E在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過(guò)量表達(dá)Cyfip蛋白。2.染色2F5單抗室溫孵育3小時(shí)(或4°C過(guò)夜)，PBST緩沖液清洗，熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫2小時(shí)，PBST緩沖液清洗。3.封片觀察 染色完成的樣品置載玻片上，加封片劑封片，在共聚焦顯微鏡下觀察拍攝，結(jié)果見(jiàn)圖6。如圖6右側(cè)圖片所示，在神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)表達(dá)Cyfip蛋白的果蠅cyfipN°E中，2F5單抗能夠清晰的標(biāo)記大腦腹側(cè)神經(jīng)節(jié)中規(guī)則排列的神經(jīng)元胞體。盡管在圖6左側(cè)圖片顯示的野生型果蠅中并沒(méi)有觀察到類似的結(jié)果，這可能是由于免疫組化實(shí)驗(yàn)的靈敏度范圍有限造成的，要檢測(cè)到熒光信號(hào)需要一定量蛋白在觀察區(qū)域的富集，推測(cè)野生型果蠅大腦神經(jīng)元中的Cyfip蛋白量很少,2F5單抗識(shí)別并標(biāo)記Cyfip蛋白，但是很弱的突光信號(hào)不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)的檢出限；而當(dāng)在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過(guò)量表達(dá)Cyfip蛋白時(shí),2F5單抗標(biāo)記Cyfip蛋白并且信號(hào)強(qiáng)度足以能被檢測(cè)到。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.7409。
2.由雜交瘤細(xì)胞CGMCCN0.7409分泌得到的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在檢測(cè)或標(biāo)記Cyfip蛋白中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述單克隆 抗體在制備檢測(cè)或標(biāo)記Cyfip蛋白的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了鼠源抗Cyfip蛋白的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞，其保藏編號(hào)為CGMCC No.7409。Western檢測(cè)結(jié)果證明本發(fā)明制備的鼠源單克隆抗體2F5能夠特異地識(shí)別果蠅大腦中Cyfip蛋白，為深入研究Cyfip蛋白功能奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103224912SQ20131016697
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者趙璐, 張永清 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所