專利名稱：利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水環(huán)境污染物生物毒性檢測技術領域，尤其是一種利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法。
背景技術：
莠去津(atrazine，阿特拉津)是一種化學除草劑，化學名稱為2_氯_4_乙氨基-6-異丙氨基-1，3，5-三嗪，1952年由Geigy化學公司開發(fā)，1958年申請瑞士專利，1958年申請了瑞士專利，1959年正式投入生產(chǎn)。由于成本低、除草效果好而很快得到廣泛應用。莠去津是選擇性內吸傳導型苗前、苗后除草劑，適用于玉米、高粱、果園和林地等，可防除I年生禾本科雜草和闊葉雜草，對某些多年生雜草也有一定的抑制作用。但莠去津極性大，易溶解于水，很容易進入地下水層，對地下水資源具有潛在的威脅。一些歐共體國家已經(jīng)禁止其使用，而在使用量最大的美國，EPA也已經(jīng)將其列入控制使用類農藥。近年來又發(fā)現(xiàn)莠去津有內分泌干擾作用，目前已認定屬于內分泌干擾劑物質。我國生產(chǎn)和使用莠去津的歷史較短，但已有較大的污染事故發(fā)生，應引起足夠的重視。莠去津在土壤中不易降解，土壤中殘留的莠去津還具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至較深土層，或是隨地表徑流進入河流、湖泊，對地下水和地表水造成污染。莠去津造成的水污染情況日益嚴重，對莠去津的檢測手段主要集中在HPLC高效液相色譜法和氣相色譜法，但這兩種方法只能測定莠去津的含量，用濃度表示出來，不能直觀反映其在生物體上的毒性表現(xiàn)?，F(xiàn)在生物監(jiān)測方法發(fā)展較快，因為其能直接反映污染物對生物體生理特征的影響變化，直接反應污染物的毒性。目前發(fā)光細菌法是比較成熟的生物毒性檢測方法，莠去津對發(fā)光細菌的毒性作用通過發(fā)光細菌的發(fā)光強度的變化來反映，從而確定莠去津毒性，但是發(fā)光細菌法也存在發(fā)光細菌不穩(wěn)定和方法成本高等問題。藻類由于生長周期短，對毒物敏感，也被廣泛用于該方面的研究。銅綠微囊藻屬藍藻，在水環(huán)境中非常常見，在實驗室易培養(yǎng)，生長周期短。研究表明利用銅綠微囊藻葉綠素熒光檢測莠去津生物毒性可行，建立該新方法可快速測定莠去津的生物毒性。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，能夠簡便、快速的測定莠去津的生物毒性，成本低廉，綠色環(huán)保。為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案如下。利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其步驟包括:A、銅綠微囊藻的培養(yǎng):將銅綠微囊藻培養(yǎng)至對數(shù)期，備用；B、銅綠微囊藻藻液的制備:用滅菌的蒸餾水對生長至對數(shù)期的銅綠微囊藻進行稀釋，使其在680nm處的OD值為0.3-0.5，用于進行莠去津生物毒性測定；C、銅綠微囊藻葉綠素熒光對莠去津生物毒性的響應時間的確定:取一定濃度的莠去津溶液ImL加入到銅綠微囊藻制備液中，定容至IOOmL,震蕩使其充分混合,每3min取一次藻液至IOmm光程的熒光比色皿中，放入熒光光譜儀中測定銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度，繪制銅綠微囊藻葉綠素熒光強度隨時間變化的關系曲線，確定銅綠微囊藻葉綠素熒光對莠去津生物毒性的最佳響應時間；D、利用銅綠微囊藻葉綠素熒光測定莠去津生物毒性的標準曲線的繪制:取系列濃度的莠去津標準液加入銅綠微囊藻制備液中，充分混合至步驟C確定的“最佳響應時間”后，用熒光光譜儀測定銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度；每一濃度設置三個平行樣，用滅菌的蒸餾水替代樣品設置一組空白樣；按公式I計算光合抑制率，
權利要求
1.利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征步驟包括: A、銅綠微囊藻的培養(yǎng):將銅綠微囊藻培養(yǎng)至對數(shù)期，備用； B、銅綠微囊藻藻液的制備:用滅菌的蒸餾水對生長至對數(shù)期的銅綠微囊藻進行稀釋，使其在680nm處的OD值為0.3-0.5，用于進行莠去津生物毒性測定； C、銅綠微囊藻葉綠素熒光對莠去津生物毒性的響應時間的確定:取一定濃度的莠去津溶液ImL加入到銅綠微囊藻制備液中，定容至IOOmL,震蕩使其充分混合，每3min取一次藻液至IOmm光程的熒光比色皿中，放入熒光光譜儀中測定銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度，繪制銅綠微囊藻葉綠素熒光強度隨時間變化的關系曲線，確定銅綠微囊藻葉綠素熒光對莠去津生物毒性的最佳響應時間； D、利用銅綠微囊藻葉綠素熒光測定莠去津生物毒性的標準曲線的繪制: 取系列濃度的莠去津標準液加入銅綠微囊藻制備液中，充分混合至步驟C確定的“最佳響應時間”后，用熒光光譜儀測定銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度；每一濃度設置三個平行樣，用滅菌的蒸餾水替代樣品設置一組空白樣；按公式I計算光合抑制率，
2.根據(jù)權利要求1所述的利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步驟A中，采用BG-1l培養(yǎng)基進行銅綠微囊藻的培養(yǎng)，按比例配制培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基放入滅菌鍋于121°C下滅菌30min ;取出后放入超凈臺冷卻，于無菌條件下進行藻種接種；接種完成后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件是:光照度為2000-25001ux,溫度為25±1°C，濕度為75%RH，光暗周期為12h:12h，靜置培養(yǎng)；每日搖瓶2_3次，每次隨機調換三角瓶的位置，以免引起光照不均；將生長至對數(shù)期的藻按比例轉接到滅菌培養(yǎng)基中，如此反復轉接3次以上；然后對該藻進行擴大培養(yǎng)，生長至對數(shù)期，備用。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步驟B中，用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水稀釋生長至對數(shù)期的銅綠微囊藻，使其在680nm處的OD值為0.4，該稀釋后的藻液用于莠去津生物毒性的測定。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步驟B中使用722型可見分光光度計測定銅綠微囊藻的光密度OD值來確定藻液的濃度。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步驟C中確定銅綠微囊藻葉綠素熒光對莠去津生物毒性的最佳響應時間為15min。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步驟C、D中熒光光譜儀的工作參數(shù)為:狹縫為5nm，掃描速度2400nm/min，激發(fā)波長Ex=435nm,發(fā)射波長Em=680nm,步長5nm,電壓700V, Icm的標準四通石英比色皿。
7.根據(jù)權利要求1所述的利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步驟D中系列濃度的莠去津標準液的濃度依次為:0.002,0.008,0.016,0.032,0.048、.0.064mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用銅綠微囊藻測定莠去津生物毒性的方法，其步驟包括A、銅綠微囊藻的培養(yǎng)；B、銅綠微囊藻藻液的制備；C、銅綠微囊藻葉綠素熒光對莠去津生物毒性的響應時間的確定；D、利用銅綠微囊藻葉綠素熒光測定莠去津生物毒性的標準曲線的繪制取系列濃度莠去津標準液加入到銅綠微囊藻制備液中，充分混合至步驟C確定的“最佳響應時間”后，用熒光光譜儀測定銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度；每一濃度設置三個平行樣，用滅菌的蒸餾水替代樣品設置空白樣，計算光合抑制率，最后繪制“莠去津濃度與光合作用抑制率的劑量-效應關系曲線”，作為銅綠微囊藻葉綠素熒光法定量測定莠去津生物毒性的標準曲線。本發(fā)明能夠簡便、快速的測定莠去津的生物毒性，成本低廉，綠色環(huán)保。
文檔編號G01N21/64GK103196884SQ201310137009
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權日2013年4月19日
發(fā)明者崔建升, 徐小惠 申請人:河北科技大學