專利名稱：煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙草中農(nóng)藥殘留的檢測領(lǐng)域，具體涉及為煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法。
背景技術(shù)：
天然化合物蛇床子素(osthol)，是從蛇床、歐前胡等傳統(tǒng)中草藥中提取的香豆素類化合物，化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司在21世紀初研發(fā)的殺菌、殺蟲劑。主要用于防治蔬菜中各種白粉病、霜霉病、小菜蛾、菜青蟲、蚜蟲等常年危害嚴重的病蟲害，具有高活性、微毒性、低殘留等特點。隨著這一產(chǎn)品在煙草上的大好使用前景，建立快速、準確的測定煙草中蛇床子素的分析方法十分必要。目前關(guān)于蛇床子素化合物的分析方法報道較多，但主要為中藥的常規(guī)質(zhì)量控制及生物試樣的檢測，對其在農(nóng)產(chǎn)品上的殘留分析方法研究較少，只有陳浩等采用高效液相色譜-紫外檢測器法對土壤和黃瓜中蛇床子素的殘留進行了研究。有關(guān)蛇床子素的主要檢測方法有液相色譜-紫外檢測器法、氣相色譜-火焰離子化檢測器法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。由于蛇床子素結(jié)構(gòu)的共軛雙鍵較多，最大吸收波長達到322 nm，在該波長下分析檢測，干擾成分相對較少，靈敏度較高，使得高效液相色譜-紫外檢測器法是檢測蛇床子素的主流方法。本發(fā)明提供了一種用甲醇水溶液提取，通過液液萃取和固相萃取凈化后，高效液相色譜-紫外檢測器法檢測煙葉中的生物源新農(nóng)藥-蛇床子素的測定方法，具有良好的檢測效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用甲醇水溶液提取，通過液液萃取和固相萃取凈化后，高效液相色譜-紫外檢測器法檢測煙葉中的生物源新農(nóng)藥-蛇床子素的測定方法，首次建立了生物源新農(nóng)藥-蛇床子素在煙葉中的殘留檢測方法，本方法具有操作簡便，提取效率高；所建立的色譜檢測方法線性范圍寬，重復(fù)性好，檢測限低等優(yōu)點。本發(fā)明采用的技術(shù)方案:
本發(fā)明煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，包括以下步驟:
(1)稱取研磨的鮮煙葉，用甲醇水溶液超聲提取后抽濾，用二氯甲烷萃取，合并濃縮；
(2)濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化；
(3)用高效液相色譜儀測定煙葉中的蛇床子素殘留量。所述的甲醇水溶液為甲醇與水的體積比為1:1。所述的濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化具體步驟為:將N-丙基乙二胺固相萃取柱用二氯甲烷預(yù)處理活化后，將濃縮液轉(zhuǎn)移至柱中，用二氯甲烷洗脫分析物，將洗脫液在40 °C下濃縮至近干，氮氣吹干，再將殘留物用正己烷溶解后轉(zhuǎn)移至用正己烷活化的氟羅里硅土固相萃取柱中，加入正己烷淋洗萃取柱，棄去淋洗液后用正己烷與丙酮的混合溶液對分析物進行洗脫，收集洗脫液后氮氣吹干，用體積比為1:1的甲醇水溶液溶解，過0.45 um微孔有機濾膜。正己烷與丙酮的混合溶液為丙酮與正己烷體積比為6:4。高效液相色譜儀的檢測器為紫外二極管陣列檢測器。高效液相色譜儀的色譜條件為:Zorbax SB-C18色譜柱；柱溫25°C ;流速I mL/min;進樣量:20 u L ;檢測波長:322 nm，參比波長為400 nm ;流動相為A=甲醇，B=水；時間程序:開始50%B到10 min時減少至20% B，并保持到15 min,到17 min時又升至50%B，并保持到18 min結(jié)束。本發(fā)明達到的有益效果:
(I)首次建立蛇床子素在煙葉中的殘留檢測方法
相對于現(xiàn)有的檢測方法，該方法更合適分析復(fù)雜基質(zhì)中蛇床子素中的含量，本發(fā)明用甲醇水溶液提取，通過液液萃取和固相萃取凈化后獲得雜質(zhì)含量較少的提取成分，用高效液相色譜-紫外檢測器檢測具有較簡單的色譜圖。(2)檢測靈敏度高，線性范圍寬
紫外檢測器采用波長較長的參比波長(400 nm)進行比對，提高了蛇床子素在紫外檢測器上的靈敏度，降低了檢測限。將一定濃度的標準品添加(0.05 mg/kg)到樣品中，經(jīng)過前處理和上機檢測分析，以S/N=3.14計算檢測限(L0D)，檢測限為0.016 mg/kg ；
將濃度梯度為 0.25 ug/mL, 0.5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 5.0 ug/mL 和 10.0 ug/mL 用高效液相色譜-紫外檢測器分析，以濃度為橫坐標，峰面積響應(yīng)值為縱坐標，進行線性回歸，蛇床子素的回歸方程為 Y=40.4827X-0.8418，R2=0.9998，表明線性關(guān)系較好，說明該方法具有檢測靈敏度高，線性范圍寬的優(yōu)點。(3)回收率高，精密度好
蛇床子素在鮮煙葉中的回收率在92.7%-96.7%之間，日內(nèi)變異系數(shù)為3.4%_5.1%，日間變異系數(shù)3.2%-6.4%，說明該方法回收率高，精密度好。


:附圖1為0.5 U g/mL蛇床子素標準溶液和煙草空白樣品添加0.1 mg/kg蛇床子素的色譜圖。
具體實施例方式實施例1
稱取研磨的鮮煙葉10 g于250 mL錐形瓶中，加入體積比為1:1 (V/V)的甲醇水溶液60 mL，混勻后，室溫超聲提取15 min，經(jīng)鋪有Celite 545的砂芯漏斗快速抽濾，殘渣再用20 mL提取液洗滌，將濾液轉(zhuǎn)移至250 mL的分液濾斗中，加入10 mL飽和食鹽水后，依次用50 mL、30 mL、20 mL 二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷過裝有無水硫酸鈉和脫脂棉的三角漏斗，于40 1:下濃縮至2 mL。將N-丙基乙二胺萃取柱(型號:Cleanert PSA 500MG，3ML)用5mL 二氯甲烷預(yù)處理活化后，將2 mL殘留物轉(zhuǎn)移至柱中，再用4 mL 二氯甲烷洗脫分析物，將6 mL洗脫液在40 °C下濃縮近干，氮氣吹干。將殘留物用2 mL正己烷溶解，將溶解物轉(zhuǎn)移至用5 mL正己烷活化的氟羅里硅土固相萃取柱中(型號:B0ND ELUT-FL 500MG，3ML)，再加A 6 mL正己燒淋洗雜質(zhì),最后用體積比為4:6 (V/V)的正己燒:丙酮10 mL對分析物進行洗脫，收集洗脫液后氮氣吹干，用I mL 1:1 (V/V)的甲醇水溶液溶解，過0.45 Pm微孔有機濾膜，將其轉(zhuǎn)移至2 mL色譜瓶中，待高效液相色譜儀檢測。高效液相色譜儀的檢測器為紫外二極管陣列檢測器。高效液相色譜儀的色譜條件:Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mmX 150 mm, 5 u m )；柱溫25°C ;流速I mL /min;進樣量20 U L ;檢測波長:322 nm，參比波長為400 nm ;流動相為A=甲醇，B=水；時間程序:開始時50%B到10 min時減少至20% B，并保持到15 min,到17 min時又升至50% B，并保持到18 min結(jié)束。在該色譜條件下，蛇床子素的保留時間為 12.05 min。實施例2
蛇床子素標準品用甲醇配制，濃度為200 U g/mL的儲存標準溶液。工作標準溶液用甲醇把儲存標準溶液稀釋為相應(yīng)的濃度。即配制成不同濃度的蛇床子素標準溶液，標準溶液的濃度梯度為:0.25 ug/mL, 0.5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 5.0 ug/mL 和 10.0 ug/mL。將蛇床子素標準品以0.05 mg/kg的濃度添加到樣品中，經(jīng)過前處理和上機檢測分析，以S/N=3.14計算檢測限(LOD)，檢測限為0.016 mg/kg ；
將濃度梯度為 0.25 ug/mL, 0.5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 5.0 ug/mL 和 10.0 ug/mL 用高效液相色譜-紫外檢測器分析，以濃度為橫坐標，峰面積響應(yīng)值為縱坐標，進行線性回歸，蛇床子素的回歸方程為Y=40.4827X-0.8418，R2=0.9998，表明線性關(guān)系較好，說明該方法具有檢測靈敏度高，線性范圍寬的優(yōu)點。實施例3
在新鮮煙葉中加入三個濃度梯度的蛇床子素標準溶液，放入4 C左右冰箱中靜置過夜，然后進行前處理，再用高效液相色譜檢測分析。并按照添加量和測定值計算其添加回收率。結(jié)果見表I，從表I可以看出，按照0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg進行添加時,蛇床子素的平均添加回收率在92.7%-96.7%范圍內(nèi)，日內(nèi)相對標準偏差為3.4%_5.1%，日間相對標準偏差為3.2%-6.4%，說明本方法回收率高，精密度較好。0.5 y g/mL蛇床子素標準溶液和煙草空白樣品添加0.1 mg/kg蛇床子素的色譜圖見附圖1所示。
權(quán)利要求
1.煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)稱取研磨的鮮煙葉，用甲醇水溶液超聲提取后抽濾，用二氯甲烷萃取，合并濃縮； (2)濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化； (3)用高效液相色譜儀測定煙葉中的蛇床子素殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述的甲醇水溶液為甲醇與水的體積比為1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙葉中蛇床子素農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于:所述的濃縮液依次用N-丙基乙二胺固相萃取柱和氟羅里硅土固相萃取柱凈化具體步驟為:將N-丙基乙二胺固相萃取柱用二氯甲烷預(yù)處理活化后，將濃縮液轉(zhuǎn)移至柱中，用二氯甲烷洗脫分析物，將洗脫液在40 °C下濃縮至近干，氮氣吹干，再將殘留物用正己烷溶解后轉(zhuǎn)移至用正己烷活化的氟羅里硅土固相萃取柱中，加入正己烷淋洗萃取柱，棄去淋洗液后用正己烷與丙酮的混合溶液對分析物進行洗脫，收集洗脫液后氮氣吹干，用體積比為1:1的甲醇水溶液溶解，過0.45 um微孔有機濾膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述的正己烷與丙酮的混合溶液為丙酮與正己烷體積比為6:4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述高效液相色譜儀的檢測器為紫外二極管陣列檢測器。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，其特征在于:所述高效液相色譜儀的色譜條件為:Zorbax SB-C18色譜柱；柱溫25°C ;流速I mL /min;進樣量:20 V- L ;檢測波長:322 nm,參比波長為400 nm ;流動相為A=甲醇,B=水；時間程序:開始50%B到10 min時減少至20% B，并保持到15 min,到17 min時又升至50% B，并保持到.18 min結(jié)束。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙葉中蛇床子素殘留量的測定方法，包括以下步驟稱取研磨的煙葉用甲醇水溶液超聲提取，液液萃取后得到濾液，用N-丙基乙二胺和氟羅里硅土固相萃取柱凈化，再用高效液相色譜儀-紫外檢測器測定鮮煙葉中蛇床子素殘留量的方法，本發(fā)明首次建立蛇床子素在鮮煙葉的殘留檢測方法，具有前處理簡單和干擾較少的優(yōu)點，還具有線性范圍寬、重復(fù)性好和檢測限低等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/88GK103163271SQ201310106689
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者蔡凱, 陳興江, 雷波, 向章敏, 潘文杰, 耿召良, 趙會納, 任竹 申請人:貴州省煙草科學(xué)研究院