豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬三種疫病的檢測(cè)試劑顯示的器具，特別是涉及一種豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫快速診斷試紙條，試紙條含支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，反應(yīng)試劑載體吸附層粘貼于支撐層上，從樣品測(cè)試端依次為纖維層，上述三種疫病抗原金標(biāo)單抗或多抗纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層；分別用上述三種疫病抗原配對(duì)單抗或多抗或單抗溶液在纖維層上噴檢測(cè)印跡“｜｜｜”、“///”、或“＼＼＼”，分別用羊（兔）抗小鼠或豬IgG的多抗或用SPA溶液在纖維素膜層上噴對(duì)照印跡“｜”、“/”或“＼”。該試紙條特異、敏感、直觀、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，能在畜禽飼養(yǎng)、肉類加工和檢疫等相關(guān)部門推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明是一種涉及豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫檢測(cè)試劑顯示器具，特別是涉及一種可同時(shí)檢測(cè)豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫的三聯(lián)檢測(cè)試紙條。
[0002]二、技術(shù)背景
豬肺疫又稱豬巴氏桿菌病、鎖喉風(fēng)，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性傳染病。主要特征為敗血癥，咽喉及其周圍組織急性炎性腫，或表現(xiàn)為肺、胸膜的纖維蛋白滲出性炎癥。急性的常呈敗血癥病變，死亡率高，慢性的多與豬氣喘病、豬瘟等混合感染或繼發(fā)。本病是危害養(yǎng)豬業(yè)的常見(jiàn)傳染病，分布很廣，常繼發(fā)于其他傳染病，造成嚴(yán)重的經(jīng)經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性的呼吸道疾病。臨床上以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為特征。本病分布于世界許多國(guó)家和地區(qū)，是一種世界性疾病，目前呈上升的流行趨勢(shì)，給規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004]豬氣喘病又稱豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體引起的一種慢性、接觸性傳染病，是一種重要的免疫抑制性疾病，也是豬呼吸道疾病綜合征的重要病原之一。該病長(zhǎng)期危害養(yǎng)豬業(yè)，并廣泛分布于世界各國(guó)。臨床上以咳嗽和氣喘為主要癥狀，以融合性支氣管肺炎為主要病變特征。主要危害是引起豬的生長(zhǎng)受阻和飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，高的發(fā)病率使其嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。本病一旦傳入豬群，很難清除。因此，對(duì)該病流行病學(xué)的認(rèn)識(shí)以及診斷技術(shù)的研究和應(yīng)用具有十分重要的意義。
[0005]豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫是一類嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的呼吸道疾病，上述疾病疫苗預(yù)防效果不佳，隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，其治療效果也不斷下降。臨床癥狀相似，鑒別診斷困難，給此類疾病的控制帶來(lái)了難度?？焖勹b別檢測(cè)可為發(fā)病豬群的治療和病原體的清除提供科學(xué)依據(jù)，是控制和消滅上述疾病的有效方法。目前對(duì)上述疾病的診斷方法主要有以下幾種。
[0006](I)病原體的分離培養(yǎng)與鑒定:豬肺炎支原體的分離培養(yǎng)十分困難，且生長(zhǎng)緩慢，往往需要IOd左右才能觀察到細(xì)小的菌落。豬肺炎支原體的菌落很小，典型的菌落為圓形，邊緣整齊，灰白色，半透明，中間凸起呈乳頭狀，表面常有許多小的顆粒，菌落大小在100?300nm之間。在做液體培養(yǎng)時(shí)，可通過(guò)酚紅指示劑能否使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化而判斷有無(wú)菌體的生長(zhǎng)，或?qū)⒁后w培養(yǎng)物作涂片，進(jìn)行姬姆薩染色或瑞特氏染色，鏡檢觀察。若有豬肺炎支原體感染，可見(jiàn)環(huán)狀、電燈泡狀等菌體結(jié)構(gòu)。
[0007]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離培養(yǎng)，從新鮮的支氣管、鼻腔分泌物或肺部病變分離病原體，無(wú)菌取病料接種于含5%綿羊血的瓊脂平板上，并劃十字線接種，在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，見(jiàn)有I?1.5_圓形、中間凸起、邊緣整齊、灰白色半透明菌落，菌落周圍出現(xiàn)清晰的完全溶血環(huán)。對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行鏡檢，菌體呈革蘭氏陰性，球桿狀或細(xì)小桿菌，有時(shí)形成絲狀，多形性，不形成芽孢，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，有莢膜。
[0008]豬肺疫巴士桿菌分離培養(yǎng)，采取病料接種于麥康凱瓊脂和血液瓊脂平板，置于37°C恒溫箱中，進(jìn)行分離培養(yǎng)。在血液瓊脂平板上生長(zhǎng)，培養(yǎng)24h后，可長(zhǎng)成淡灰白色，圓形、濕潤(rùn)、不溶血的露珠樣小菌落。涂片染色鏡檢，為革蘭氏陰性、兩極濃染的小球桿菌。
[0009](2)血清學(xué)檢測(cè):血清學(xué)檢測(cè)是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，它是通過(guò)檢測(cè)血清中抗體水平來(lái)判斷豬是否患有上述疾病，主要包括間接血凝試驗(yàn)(IHA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、免疫熒光試驗(yàn)(IF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以及放射免疫酶試驗(yàn)(RIDEA)。
[0010](3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù):PCR技術(shù)具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于許多疾病的病原體鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。上述疾病的病原體檢測(cè)均可使用PCR技術(shù)，PCR檢測(cè)病原體與ELISA檢測(cè)相比，其檢出率明顯高于ELISA的檢測(cè)率。
[0011]病原體培養(yǎng)與鑒定、血清學(xué)檢測(cè)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室操作，操作繁瑣，檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力；而且需要昂貴的儀器設(shè)備，如PCR儀、酶標(biāo)儀和CO2培養(yǎng)箱等，對(duì)非專業(yè)人員而言，上述檢測(cè)方法很難完成。雖然上述方法特異敏感，但每次只能檢測(cè)一種豬病，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)或診斷。本發(fā)明，研究一種簡(jiǎn)便快速、實(shí)時(shí)在線，同時(shí)檢測(cè)三種豬病的三聯(lián)檢測(cè)試紙，對(duì)控制和消滅此類疾病意義重大。
[0012]三、
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)豬病病原存在的缺點(diǎn)，提供一種特異、敏感、簡(jiǎn)便快速的呼吸道疾病檢測(cè)方法，研制出一次可同時(shí)檢測(cè)三種豬細(xì)菌性呼吸道疾病的三聯(lián)檢測(cè)試紙。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案是:提供一種豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡；金標(biāo)抗體纖維層吸附有納米級(jí)金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的三種單克隆抗體，檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的配對(duì)單抗印制，對(duì)照印跡用羊抗或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體；或金標(biāo)抗體纖維層吸附有納米級(jí)金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的多克隆抗體，檢測(cè)印跡分別用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的單抗制備，對(duì)照印跡用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗豬IgG多抗制備。
[0014]檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的配對(duì)單抗制備即用上述三種病原體特異抗原的配對(duì)單抗溶液分別制備；檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的多克隆抗體制備即為用上述三種病原體的多克隆抗體分別制備。
[0015]支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠片條或硬紙條制成；測(cè)試端樣品吸附纖維層用玻璃棉制成；金標(biāo)抗體纖維層用玻璃棉和金標(biāo)抗體制成，金標(biāo)抗體可以是單抗或多克隆抗體。
[0016]纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成。
[0017]吸水材料層用吸水紙制成。
[0018]檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜線式，纖維素膜層上含有三條檢測(cè)印跡和一條對(duì)照印跡，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為“ I I I I ”、“////”、“\\ \\”中的任一種。
[0019]試紙條吸附層上面含有一層保護(hù)層，保護(hù)層附著在吸附層上，在測(cè)試端樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在測(cè)試端樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測(cè)試端樣品吸附纖維層一側(cè)處約0.5cm處。
[0020]根據(jù)需要，選擇上述金標(biāo)抗體纖維層、檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡排列形式中一種形式。[0021 ] 本發(fā)明的積極有益效果:
1.檢測(cè)特異性強(qiáng)、敏感性高:本發(fā)明檢測(cè)試紙條以納米級(jí)金顆粒標(biāo)記高親和力特異性單克隆抗體或特異性多克隆抗體為基礎(chǔ)而制成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，金顆粒不影響單克隆抗體或多克隆抗體的特異性和結(jié)合力，并且具有較高的標(biāo)記率。本發(fā)明檢測(cè)試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測(cè)到納克級(jí)病原體蛋白。
[0022]2.操作簡(jiǎn)便、快速:使用本發(fā)明試紙條檢測(cè)時(shí)無(wú)需附加任何其它儀器和試劑，只需將其測(cè)試端插入待檢的樣品液中30秒左右，然后在1-5分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0023]3.檢測(cè)結(jié)果直觀、準(zhǔn)確:本發(fā)明試紙條以是否顯示棕紅色的檢測(cè)線和對(duì)照線作為判定陽(yáng)性和陰性結(jié)果的依據(jù)，即只在纖維素膜的對(duì)照線印記處顯示一條棕紅色對(duì)照線C，而在檢測(cè)線印記處無(wú)棕紅色條帶顯示，表示被檢測(cè)的3種豬病均為陰性結(jié)果；在纖維素膜的對(duì)照線印記處顯示一條棕紅色對(duì)照線C，在檢測(cè)印跡處出現(xiàn)三條棕紅色條帶Tl、T2、T3 (Tl為豬氣喘病，Τ2為豬傳染性胸膜肺炎，Τ3為豬肺疫)，則表示被檢測(cè)的3種豬病均為陽(yáng)性結(jié)果；在纖維素膜上顯示一條棕紅色對(duì)照線和三條棕紅色檢測(cè)線中的任一條或任兩條，則表示在被檢測(cè)3種豬病中的任一種或兩種為陽(yáng)性結(jié)果。無(wú)論陽(yáng)性結(jié)果或陰性結(jié)果對(duì)照線C均應(yīng)顯示，當(dāng)對(duì)照線C不顯示時(shí)，說(shuō)明試紙條失效。
[0024]4.檢測(cè)費(fèi)用降低:使用本發(fā)明檢測(cè)試紙條，不需其它儀器及試劑，節(jié)省了儀器、設(shè)備和附加試劑費(fèi)用；一條試紙一次可以檢測(cè)3種豬病，非專業(yè)人員也可隨時(shí)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，無(wú)需支付專家診斷檢查費(fèi)及其相關(guān)費(fèi)用，可極大的降低檢測(cè)成本的投入，降低檢測(cè)費(fèi)用。
[0025]5.使用范圍廣:本發(fā)明檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)單，即“傻瓜式”操作，而且攜帶方便、易保存，可滿足不同單位和不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個(gè)體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和社會(huì)效益。
[0026]四、【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1 一種豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條的側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖 圖2 —種豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖 五、【具體實(shí)施方式】:
以下實(shí)施例僅為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條的制備，需要制備抗三種病原體特異抗原的單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測(cè)印跡和金標(biāo)抗體纖維層；同時(shí)需要制備羊或兔抗鼠IgG抗體，或羊或兔抗豬IgG抗體，用于制備對(duì)照印跡。
[0027]1.羊(兔)抗鼠或豬IgG抗體的制備:
以飽和硫酸銨法提取小鼠或豬血清中的IgG，取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內(nèi)2h，在4°C、10000r/min離心15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內(nèi)2h，在4°C、10000r/min條件下離心15min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過(guò)夜透析，換液2~3次，在4°C、10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。以50 μ g~100 μ g (IgG) /kg體重經(jīng)皮下或肌肉注射抗體陰性健康羊或家兔3~4次，末次免疫20天后，靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1:2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠或豬的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于制備本發(fā)明試紙條的對(duì)照印跡。
[0028]2.豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原單克隆抗體(Mi)的制備:
每只用50μ g~100μ g病原體特異抗原免疫Balb/c系小鼠三次，每次間隔15~30d ；第三次加強(qiáng)免疫后3~4d，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，用75%酒精浸泡5~lOmin，無(wú)菌取其脾臟，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min離心10min，收集脾細(xì)胞；將I X IO8個(gè)脾細(xì)胞與2~5 X IO7個(gè)NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心10min棄上清，將含有沉淀細(xì)胞的離心管置于37°C的水中，并緩緩加入0.7~Iml 40%~50% PEG4000 (pH 8.5~9.0)作用lmin，然后緩慢加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5~lOmin，1000r/min離心10min棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入
96孔培養(yǎng)板(100μΙ~200μ1/孔)，置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7~IOd后，以548~1(^ g/ml的純化的病原體特異抗原包被96孔酶標(biāo)板，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)雜交瘤的培養(yǎng)上清，挑取強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞克隆(OD45tl ^ 0.5)，進(jìn)行連續(xù)三次的有限稀釋法克隆化，獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，其染色體數(shù)為92~98，其分泌的單克隆抗體(M1，M2或M3)，能夠特異識(shí)別三種不同的病原體，而不與其它豬的病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)109~1(1，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgG1' IgG2a, IgG2b, IgG3 ;獲得的配對(duì)單克隆抗體，用于制金標(biāo)單抗體玻璃棉或檢測(cè)印跡。 [0029]3.金標(biāo)單抗玻璃棉的制備:
利用檸檬酸鈉還原法制備納米級(jí)金顆粒:即在50~100mL沸騰的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4ml的0.5~2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的納米級(jí)金顆粒。以0.lmol/L的K2CO3調(diào)金顆粒溶液的pH至8.5~9.5，以1:1000~1300的標(biāo)記比將待標(biāo)記的單克隆抗體(Ml，M2或M3)加入pH8.5~9.5的金溶膠中，標(biāo)記IOmin后，加20%PEG10000至最終濃度為0.05%, 4°C、1500~3000r/min離心20min，除去未結(jié)合的金顆粒顆粒,4°C、15000r/min離心lh,棄上清,獲金標(biāo)抗體混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析,分離純化金標(biāo)抗體，分別獲得Ml、M2、M3的金標(biāo)抗體。將1:100~500稀釋的三種金標(biāo)抗體，吸附于精制玻璃棉中，4°C低溫真空干燥，制備金標(biāo)單克隆抗體玻璃棉。
[0030]4.病原體特異抗原多克隆抗體(Ci)的制備:
病原體特異抗原多克隆抗體(Ci)的制備。分別采用國(guó)家批準(zhǔn)的上述三種豬病的滅活疫苗、弱毒疫苗或標(biāo)準(zhǔn)抗原，多次免疫接種抗體陰性健康豬。末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1:2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與小鼠血清IgG的提取相同，不再重述)。
[0031]金標(biāo)多抗和金標(biāo)多抗玻璃棉的制備，與金標(biāo)單抗玻璃棉的制備方法相同，不再重述。
[0032]詳見(jiàn)【具體實(shí)施方式】中的內(nèi)容3。[0033]5.本發(fā)明檢測(cè)試紙條檢測(cè)原理
當(dāng)本發(fā)明檢測(cè)試紙條測(cè)試端插入待檢樣品溶液后，待檢溶液通過(guò)虹吸帶動(dòng)待檢病原體進(jìn)入金標(biāo)抗體纖維層，并與其中的金標(biāo)抗體(Mi或Ci ) 一起沿硝酸纖維素膜向手柄端擴(kuò)散，最終滲入手柄端吸水材料層，擴(kuò)散過(guò)程中金標(biāo)抗體能夠與相應(yīng)的待檢病原體結(jié)合，結(jié)合的金標(biāo)抗體的病原體能夠被纖維素膜上檢測(cè)印跡的配對(duì)單抗或多抗攔截，當(dāng)樣品液中含有被檢病原體時(shí)，則出現(xiàn)I?3條棕紅色的檢測(cè)線；羊或兔抗鼠或抗豬IgG則可與相應(yīng)的金標(biāo)單抗或多抗結(jié)合，出現(xiàn)I條棕紅色對(duì)照線。當(dāng)待檢樣品液中沒(méi)有上述病原體時(shí)，試紙條只顯示出一條棕紅色對(duì)照線；當(dāng)纖維素膜上沒(méi)有對(duì)照線顯示時(shí)，則表明試紙條已失效。
[0034]6.本發(fā)明檢測(cè)試紙條的檢測(cè)操作方法
(I)檢測(cè)樣品的處理:取病豬病變組織，1:1?5加入生理鹽水并用剪刀剪碎，浸出液為待檢樣品，病豬全血或血清加入生理鹽水1:1?5稀釋后為待檢樣品。
[0035](2)檢測(cè)操作:將本發(fā)明檢測(cè)試紙條樣品端插入待檢樣品液中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線9，約30秒后取出試紙條，水平放置約I?5分鐘，同時(shí)觀察結(jié)果。
[0036](3)結(jié)果判定:如果在檢測(cè)試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對(duì)照線C，表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明在被檢樣品中不含上述3種病原體；如果檢測(cè)試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)對(duì)照線C，檢測(cè)印跡處出現(xiàn)Tl或T2或T3檢測(cè)線，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即在待檢樣品中含有豬氣喘病病原體或豬傳染性胸膜肺炎病原體或豬肺疫病原體；如果檢測(cè)印跡處Tl或T2或T3同時(shí)出現(xiàn)，表示在待檢樣品中存在上述3種病原體；如果纖維素膜上沒(méi)有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效。
[0037]實(shí)施例一:豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條
參見(jiàn)圖1和圖2，圖中I為支撐層，用硬質(zhì)塑膠薄片條制成，2為測(cè)試端的樣品吸附纖維層，用玻璃棉制成，3為金標(biāo)抗體纖維層，吸附有納米級(jí)金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的三種單克隆抗體的玻璃棉，根據(jù)上述【具體實(shí)施方式】3中所述的制備方法制備其金標(biāo)單抗玻璃棉，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜制成，5為吸水材料層，用吸水紙制成，將編號(hào)2、3、4、5各層從左端測(cè)試端至右粘貼在硬質(zhì)塑膠薄片條I上，彼此之間交界處互相交叉重疊。在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的配對(duì)單抗溶液印制的檢測(cè)印跡Tl、T2、T3，7為用羊或兔抗鼠IgG溶液印制的對(duì)照印跡C，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜線式，兩種印跡帶排列形成的組合形式為“ I I I I”、“/ / / /”、“\ \ \ \”中的任一種。8 -1為覆蓋在測(cè)試端樣品吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3上面的白色保護(hù)膜，在2和3交界處對(duì)應(yīng)保護(hù)膜8-1位置上偏向于樣品吸附纖維層2 —側(cè)0.5cm處印有標(biāo)記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5 (手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護(hù)膜8-2。
[0038]待測(cè)樣品溶液的制備及檢測(cè)操作步驟，與【具體實(shí)施方式】6中的檢測(cè)操作方法相同，不再重述。
[0039]實(shí)施例二:豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫三聯(lián)檢測(cè)試紙條，與實(shí)施例一基本相同，不同之處在于:
金標(biāo)抗體纖維層3用吸附有金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫的三種多克隆抗體的玻璃棉制成，根據(jù)上述【具體實(shí)施方式】3中所述的制備方法制備其金標(biāo)多克隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的單抗溶液印制的檢測(cè)印跡Tl、T2、T3，7為用羊或兔抗豬的IgG溶液印制對(duì)照印跡C，兩種印跡帶排列形成的組合形式為“ I I I I ”、“/ / / /”、“\ \ \ \ ”中的任一種。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與【具體實(shí)施方式】6中的操作方法相同，不再重述。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫的三聯(lián)檢測(cè)試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上制備有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，其特征是金標(biāo)抗體纖維層吸附有納米級(jí)金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的三種單克隆抗體，檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的配對(duì)單抗或多克隆抗體印制，對(duì)照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)印制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是金標(biāo)抗體纖維層吸附有納米級(jí)金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的三種單克隆抗體的混合液，檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的配對(duì)單抗或多克隆抗體印制，對(duì)照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)印制，或金標(biāo)抗體纖維層吸附有納米級(jí)金顆粒標(biāo)記的抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的多克隆抗體，檢測(cè)印跡分別用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的單抗制備，對(duì)照印跡用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗豬IgG多抗制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙條，其特征是檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體特異抗原的配對(duì)單抗制備即用上述三種病原體特異抗原的配對(duì)單抗溶液分別制備；檢測(cè)印跡用抗豬氣喘病、豬傳染性胸膜肺炎及豬肺疫病原體的多克隆抗體制備即為用上述三種病原體的多克隆抗體分別制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠片條或硬紙條制成；測(cè)試端樣品吸附纖維層用玻璃棉制成；金標(biāo)抗體纖維層用玻璃棉和金標(biāo)抗體制成，金標(biāo)抗體可以是單抗或多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是吸水材料層用吸水紙制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為直線式、或斜線式，纖維素膜層上含有三條檢測(cè)印跡和一條對(duì)照印跡，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡的排列形式為“III 1”、“// //”、“\ \ \ \”中的任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是試紙條吸附層上面含有一層保護(hù)層，保護(hù)層附著在吸附層上，在測(cè)試端樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在測(cè)試端樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向測(cè)試端樣品吸附纖維層一側(cè)約0.5cm處。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103941014SQ201310083886
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月15日
【發(fā)明者】李學(xué)伍, 趙東, 鄧瑞廣, 王麗, 楊繼飛, 柴書軍, 邢廣旭, 張改平 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院