專利名稱：用于檢測磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磺胺二甲基嘧啶是通過人工合成的氨苯磺胺衍生物，主要用于預(yù)防和治療細菌感染性疾病?；前范谆奏つ芤种聘锾m氏陽性菌及一些陰性菌，可以治療多種細菌感染，在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于治療由敏感細菌感染的各種畜禽疾病。由于磺胺二甲基嘧啶在體內(nèi)的作用和代謝時間較長，通過任何途徑攝入的磺胺都有可能在人體內(nèi)蓄積。蓄積濃度超過一定值時，就會對人體造成損害。短時間大劑量或長時間小劑量的刺激可分別引起急性或慢性中毒，影響機體的泌尿、免疫系統(tǒng)，破壞肌肉、腎臟和甲狀腺等組織，如誘發(fā)人的甲狀腺癌等。另外，人體內(nèi)長期存在磺胺會導(dǎo)致許多細菌對磺胺類藥物產(chǎn)生抗藥性。因此，國際食品法典委員會(CAC)和許多國家規(guī)定，食品中磺胺類總量的最大殘留限量(MRL)為0.lmg/kg。恩諾沙星，是氟喹酮類抗菌藥，因其抗菌廣譜、抗菌作用強、口服吸收好、體內(nèi)分布廣，現(xiàn)已成為畜禽業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最重要的抗菌類藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促生長。本品為廣譜殺菌藥，對支原體有特效。對大腸桿菌、克雷白桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、綠膿桿菌、嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、金葡菌、鏈球菌等都有殺菌效用。恩諾沙星可作為動物用藥品，在動物體內(nèi)的半衰期長，有良好的組織分布性，屬于廣效性抑菌劑，對于革蘭氏陽性菌、陰性菌及霉?jié){體具有抑菌作用，曾被使用于養(yǎng)殖魚類之弧菌癥及大腸桿菌癥疾病之控制。由于其耐藥性和潛在的致癌性，歐盟及我國均制定了在組織中的最聞殘留限量(100 μ g/kg)。目前，檢測磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星的化學(xué)方法有高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，但由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。目前尚未有商品化的用于同時檢測磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，具體可包括抗體1、抗體2、包被原1、包被原2、酶標(biāo)記物I和酶標(biāo)記物2 ;所述抗體I為抗磺胺二甲基嘧啶的抗體，所述抗體2為抗恩諾沙星的抗體，所述包被原I為磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述包被原2為恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述酶標(biāo)記物I為抗所述抗體I的酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)記物2為抗所述抗體2的酶標(biāo)二抗。
在本發(fā)明中，所述磺胺二甲基嘧啶半抗原具體為磺胺二甲基嘧啶；所述恩諾沙星半抗原具體為恩諾沙星。所述酶聯(lián)免疫試劑盒還包括如下中的至少一種:磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液、恩諾沙星標(biāo)準溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、包被緩沖液、封閉液和樣品稀釋液。在本發(fā)明的一個實施例中，所述酶聯(lián)免疫試劑盒具體由所述抗體1、所述抗體2、所述包被原1、所述包被原2、所述酶標(biāo)記物1、所述酶標(biāo)記物2、所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液、所述恩諾沙星標(biāo)準溶液、所述底物顯色液、所述終止液、所述洗滌液、所述包被緩沖液、所述封閉液和所述樣品稀釋液組成。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述抗磺胺二甲基嘧啶的抗體可為抗磺胺二甲基嘧啶的單克隆抗體，也可為抗磺胺二甲基嘧啶的多克隆抗體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述抗磺胺二甲基喃唳的抗體為抗磺胺二甲基喃唳的單克隆抗體，具體由磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs CGMCC N0.3393產(chǎn)生。所述抗恩諾沙星的抗體可為抗恩諾沙星的多克隆抗體，也可為抗恩諾沙星的單克隆抗體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述抗恩諾沙星的抗體為抗恩諾沙星的多克隆抗體，具體是用恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原免疫脊椎動物(如新西蘭大白兔)得到的。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液和所述恩諾沙星標(biāo)準溶液可以是一定濃度范圍內(nèi)的多種濃度的標(biāo)準溶液，例如可以在O 100 μ g/L之間，如濃度分另1J 為 0.01 μ g/L、0.05 μ g/L、0.1 μ g/L、0.3 μ g/L、0.9 μ g/L、2.7 μ g/L、8.1 μ g/L、24.3 μ g/L 和 72.9 μ g/L。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述載體蛋白可為人血清白蛋白(HSA)、卵清白蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鼠血清蛋白(MSA)、甲狀腺蛋白(BCG)或兔血清蛋白(RSA)。在本發(fā)明中，與所述磺胺二甲基嘧啶半抗原偶聯(lián)的載體蛋白具體為人血清白蛋白(HSA)，與所述恩諾沙星半抗原偶聯(lián)的載體蛋白具體為卵清白蛋白(0VA)。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶，也可為堿性磷酸酯酶；辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與二抗進行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由A液和B液組成，所述A液可為過氧化脲溶液或過氧化氫溶液(具體如體積百分含量為2%的過氧化脲溶液)，所述B液可為四甲基聯(lián)苯胺溶液或鄰苯二胺溶液(如體積百分含量為I %的四甲基聯(lián)苯胺溶液)；所述終止液可為硫酸溶液，其濃度可為I 2mol/L (如2M)。當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基苯磷酸酯緩沖液(具體如濃度為0.lmg/mL的對硝基苯磷酸酯溶液)。顯色液和終止液也可以是本領(lǐng)域常用的其它底物顯色液和終止液。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述洗滌液為pH7.4、含有吐溫20的0.02M的磷酸鹽緩沖液；所述吐溫20在所述洗滌液中的體積含量為0.05%。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述包被緩沖液可為碳酸鹽緩沖液，具體如為pH9.6、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；所述0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下=Na2CO3L 59g/L和NaHC032.93g/L。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述封閉液為磷酸鹽緩沖液；在本發(fā)明的一個實施例中，所述封閉液具體為pH7.4，含小牛血清、蔗糖和酪蛋白的磷酸鹽緩沖液；所述小牛血清在所述封閉液中的體積含量為0.5%，所述蔗糖在所述封閉液中的含量為每IOOml所述封閉液中含有5g所述蔗糖，所述酪蛋白在所述封閉液中的含量為每IOOml所述封閉液中含有Ig所述酪蛋白。當(dāng)然所述包被緩沖液和所述封閉液也可以是本領(lǐng)域常用的其它包被緩沖液和封閉液。在所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述樣品稀釋液具體為0.02M的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.4)。以上所有的所述0.02Μ的磷酸鹽緩沖液的溶劑均為水，溶質(zhì)及其濃度均如下:NaCl 16.00g/L、KCl 0.40g/L、Na2HPO4 2.30g/L 和 KH2PO4 0.40g/L。本發(fā)明的另一個目的是提供所述酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法。本發(fā)明所提供的所述酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法具體包括如下(I)或(2)的步驟:(I)將所述抗體1、所述抗體2、所述包被原1、所述包被原2、所述酶標(biāo)記物I和所述酶標(biāo)記物2分別單獨包裝的步驟；(2 )將所述抗體1、所述抗體2、所述包被原1、所述包被原2、所述酶標(biāo)記物1、所述酶標(biāo)記物2、所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液、所述恩諾沙星標(biāo)準溶液、所述底物顯色液、所述終止液、所述洗滌液、所述包被緩沖液和所述封閉液分別單獨包裝的步驟。本發(fā)明的還一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的方法。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的方法，具體是利用所述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星。在所述方法中，所述酶聯(lián)免疫試劑盒中的包被原為所述包被原I和所述包被原2的混合物；所述酶聯(lián)免疫試劑盒中的抗體為所述抗體I和所述抗體2的混合物；所述酶聯(lián)免疫試劑盒中的酶標(biāo)記物為所述酶標(biāo)記物I和所述酶標(biāo)記物2的混合物。更加具體的，所述方法用于定量檢測時，可包括如下步驟:(I)待測樣品的前處理:所述待測樣品為牛奶樣品；用樣品稀釋液(0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液)對所述牛奶樣品按照體積比1:10 (1+9)稀釋，例如100 μ L牛奶樣品加入900 μ L的樣品稀釋液，獲得處理后樣品。(2)用所述酶聯(lián)免疫試劑盒對步驟(I)的處理后樣品進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果:用所獲得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準溶液(標(biāo)準品濃度為O μ g/L)的吸光度值(Btl)再乘以100%，即百分吸光度值。計算公式為:百分吸光度值(%)= (B/B0) X100%分別以所述磺胺二甲嘧啶標(biāo)準溶液和所述恩諾沙星標(biāo)準溶液的濃度(μ g/L)為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖。用同樣的辦法計算步驟(I)的處理后樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個處理后樣品的濃度則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中所述磺胺二甲嘧啶和所述恩諾沙星的含量。也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需較短時間，1.5h內(nèi)即可以完成。本發(fā)明的還一個目的是提供一種雜交瘤細胞株。本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞株具體為磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.3393。由所述磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs CGMCC N0.3393產(chǎn)生的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明方法簡便、易行，免疫效果良好。本發(fā)明提供酶聯(lián)免疫檢測模式，可以定性或定量檢測牛奶中磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星的殘留，樣品前處理過程簡單。另外，本發(fā)明所用試劑采用獨立包裝，檢驗方法簡便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，將在磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星的檢測中發(fā)揮重要作用。保藏說明參椐的生物材料(株):SAs科學(xué)描述:磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期:2009年11月3日保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.339

圖1為磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星的標(biāo)準曲線圖。其中，SM2是采用辣根過氧化酶顯色測定的結(jié)果的標(biāo)準曲線，ENR是堿性磷酸酶測定的結(jié)果的標(biāo)準曲線。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。磺胺二甲基卩密唳標(biāo)準品:德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，產(chǎn)品目錄號C16990580 ；恩諾沙星標(biāo)準品:德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，產(chǎn)品目錄號C13170000 ；磺胺二甲基嘧啶類似物(磺胺間甲氧嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺喹惡琳、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺地索辛、磺胺甲氧噠嗪、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺硝苯、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺甲噻二唑和磺胺苯酰)的標(biāo)準品、恩諾沙星類似物(噁喹酸、依諾沙星、氟甲喹、洛美沙星、達氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、氧氟沙星、麻保沙星和司帕沙星)的標(biāo)準品:德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；Balb/c小鼠:北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司新西蘭大白兔:北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑:美國Sigma公司，產(chǎn)品目錄號分別為F-5881和F-5506。SP2/0骨髓瘤細胞:北京欣興唐生物科技有限公司。下述實施例中所涉及的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測原理為間接競爭法:當(dāng)在微孔條上預(yù)包被磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星半抗原-載體蛋白偶聯(lián)抗原后，加入待測樣品溶液或磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星標(biāo)準品溶液后，再加入磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星特異性抗體溶液，待測樣品中殘留的藥物(磺胺二甲基嘧啶或恩諾沙星)或磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星標(biāo)準品與酶標(biāo)板上包被的偶聯(lián)抗原競爭特異性抗體，加入酶標(biāo)二抗進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與樣本中藥物(磺胺二甲基嘧啶或恩諾沙星)的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中藥物(磺胺二甲基嘧啶或恩諾沙星)的含量。同時也可以根據(jù)酶標(biāo)板上顏色深淺，與系列濃度的標(biāo)準品溶液顏色進行比較，從而粗略的判斷待測樣品中藥物(磺胺二甲基嘧啶或恩諾沙星)的濃度范圍。實施例1、檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其應(yīng)用一、檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒包括:(I)預(yù)包被酶標(biāo)板:包被有包被原(磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物，及恩諾沙星與載體蛋白的偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板；(2) 一抗:抗磺胺二甲基嘧啶的抗體工作液，以及抗恩諾沙星的抗體工作液，即將抗磺胺二甲基喃唳的抗體和抗恩諾沙星的抗體分別用抗體稀釋液(含有0.05%的TritonX-100和0.02%的Proclin300的0.02M磷酸鹽緩沖液)稀釋至其蛋白濃度為0.1 μ g/mL。(3)酶標(biāo)二抗:用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液，以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液，即將堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗分別用酶標(biāo)抗體稀釋液(含有0.02%的Proclin300和5%的胎牛血清的0.02M磷酸鹽緩沖液)稀釋至其蛋白濃度為0.06 μ g/mL。(4)磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液，以及恩諾沙星標(biāo)準溶液:用0.02M磷酸鹽緩沖液分別將磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準品和恩諾沙星標(biāo)準品各稀釋成標(biāo)準溶液10瓶，濃度分別為O μ g/L、0.01 μ g/L、0.05 μ g/L、0.1 μ g/L、0.3 μ g/L、0.9 μ g/L、2.7 μ g/L、8.1 μ g/L、24.3 μ g/L和 72.9 μ g/L ；(5)堿性磷酸酶底物顯色液:0.lmg/mL的對硝基苯磷酸酯(PNPP)溶液。(6)辣根過氧化物酶底物顯色液:由A液和B液組成，A液為2% (體積百分含量)過氧化脲水溶液，B液為1% (體積百分含量)四甲基聯(lián)苯胺水溶液；(7) HRP顯色終止液:2mol/L硫酸；(2mol/L硫酸是對應(yīng)HRP的終止液，對應(yīng)堿性磷酸酶不需要終止液)(8)洗滌液:ρΗ7.4、含有0.05% (體積百分含量)吐溫20的0.02Μ磷酸鹽緩沖液；(9)樣品稀釋液:0.02Μ的磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.4)。以上0.02Μ的磷酸鹽緩沖液的溶劑均為水，溶質(zhì)及其濃度均如下:NaCl 16.0Og/L、KCl 0.40g/L、Na2HPO4 2.30g/L 和 KH2PO40.40g/L。其中，預(yù)包被酶標(biāo)板、一抗、酶標(biāo)二抗的制備方法具體如下:(一)預(yù)包被酶標(biāo)板的制備
1、磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備采用重氮化法制備磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物，具體如下:(l)104mg磺胺二甲基嘧啶(SM2),加入8mL0.25mol Γ1的硫酸中，置于4°C冰箱，形成溶液I ;(2) 200mg的人血清白蛋白(HSA)溶于8mL的Na2CO3水溶液(pH=10)中，置于4°C冰箱，形成溶液II ；(3 ) 38mg NaNO2，加入 2mL 純水，形成 NaNO2 水溶液；(4)將NaNO2水溶液緩慢加入到溶液I中，在此過程中，將SM2置于碎冰中，大概15min，形成 SM2-NaNO2 ；(5)將SM2-NaNO2緩慢加入到溶液II中，并搖動，此時有紅色生成；6min后，進行磁力攪拌(室溫慢速攪拌)，繼續(xù)緩慢加入SM2-NaNO2 ;在攪拌過程中，檢測pH值，使之保持在9-10之間(用IM NaOH調(diào)節(jié))，最終溶液變成暗紅色液體；室溫繼續(xù)攪拌4h ;將反應(yīng)后的溶液裝入透析袋中，生理鹽水透析，每隔12小時更換一次透析液，連續(xù)透析三天，得到磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物(SM2-HASX2、恩諾沙星與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備采用活化酯法制備恩諾沙星與載體蛋白的偶聯(lián)物，具體如下:(l)15mg恩諾沙星(ENR)溶解于5mL N，N 二甲基甲酰胺(DMF)中，超聲使之完全溶解，并在預(yù)冷的乙醇中冷卻，得到ENR溶液；(2) 20mg碳化 二亞胺(EDC)和20mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入到上述ENR溶液中，室溫反應(yīng)過夜；(3) 15mg卵清白蛋白(OVA)溶解于5mL碳酸溶液中(pH8.0),逐滴加入到上述步驟
(2)所得溶液中，繼續(xù)攪拌4h ;然后將反應(yīng)液裝入透析袋，在4°C用生理鹽水溶液透析48小時，換水6次。將透析液在無菌條件下通過0.2 μ m的濾膜，得到純化的恩諾沙星與載體蛋白的偶聯(lián)物(ENR-0VA)，分裝于安培瓶中，-20°C保存。3、包被酶標(biāo)板包被緩沖液:0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下=Na2CO3L 59g/L 和 NaHC032.93g/L。洗滌液:含有0.05% (體積百分含量)吐溫20的0.02M磷酸鹽緩沖液，pH7.4。封閉液:含有0.5% (體積百分含量)小牛血清、5% (5g/100ml)的蔗糖、I %(lg/100ml)酪蛋白的0.02M的磷酸鹽緩沖液，pH7.4。其中，0.02M的磷酸鹽緩沖液的溶劑均為水，溶質(zhì)及其濃度均如下:NaCl 16.00g/L、KCl 0.40g/L、Na2HP042.30g/L 和 KH2PO4
0.40g/L。用包被緩沖液分別將步驟I和步驟2制備得到的偶聯(lián)物SM2-HAS和ENR-OVA稀釋成I μ g/mL,每孔各加入100 μ L, 37°C溫育2h或4°C過夜，傾去包被緩沖液,將酶標(biāo)板用洗滌液后洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。(二)一抗的制備1、磺胺二甲基嘧啶特異性抗體(單抗)的制備( I)磺胺二甲基嘧啶免疫原的制備
制備過程同上述磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備過程，最終獲得的純化后的SM2-HAS即為磺胺二甲基嘧啶免疫原。(2)動物免疫將步驟(I)獲得的磺胺二甲基嘧啶免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為75 μ g/只/次。免疫方式為背部皮下多點注射；免疫時間間隔為15天；免疫次數(shù)為7-8次。(3)細胞融合與克隆化末次免疫后10天，取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到一株穩(wěn)定分泌磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體的雜交瘤細胞株一磺胺類單克隆雜交瘤細胞株，命名為SAs。該雜交瘤細胞株已于2009年11月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCN0.3393。其中，間接ELISA法操作步驟具體如下:I)包被:在96孔酶標(biāo)板中加入100 μ L的I μ g/mL的SM2-HAS溶液(用配方同上的包被稀釋液進行稀釋)，同時設(shè)置不包被抗原的對照，4°C包被過夜，用PBS緩沖液洗滌3次。2)封閉:加入150 μ L/孔的封閉液(配方同上所述)，在37°C孵育2h，棄封閉液，洗滌3次，拍干。置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?)加待測樣品:吸取細胞上清100μ 1，加入對應(yīng)的酶標(biāo)板中，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。同時設(shè)置未經(jīng)免疫的小鼠細胞上清的對照；以PBS代替待檢測樣品的對照(陰性對照孔)。4)加酶標(biāo)二抗:取HRP標(biāo)羊抗小鼠IgG抗體(Jackson Immunosearch公司，產(chǎn)品目錄:號115-475-003)，按體積比1:5000倍稀釋后，100 μ I/孔，37°C孵育30min，洗滌4次，拍干。5)顯色:將辣根過氧化物酶底物顯色液按100 μ I/孔加入(Α液和B液各50 μ 1，混勻后使用)，37°C顯色15-30min。6)終止:加入終止液(2M H2SO4) 50 μ I/孔。7)讀數(shù):以450nm單波長測定各孔OD值，以與陰性對照孔(以PBS代替待測樣品的對照)OD值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為陽性的臨界點。ELISA結(jié)果判定方法:若P/N>2.1，則判別為陽性細胞；若1〈P/N〈2.1，則加大包被濃度后再次檢測，P/N>2.1的仍判為陽性。(4)細胞凍存和復(fù)蘇將步驟(3)獲得的磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs CGMCC N0.3393用凍存液制成I X IO6個/mL的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。(5)磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體的制備與純化制備方法可為如下兩種:A增量培養(yǎng)法將磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs CGMCC N0.3393置于DEME培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天，收集細胞上清。B腹水制備將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4mL/只，7天后腹腔注射雜磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs CGMCC N0.3393細胞5X IO5個/只，7天后采集腹水。收集細胞上清或腹水，采用間接ELISA法測定其效價(測定方法同上所述，測定效價時以P/N>2.1的細胞上清或腹水最大稀釋倍數(shù)表示)，結(jié)果表明細胞上清的效價為1:10000,腹水的效價為1:50000。接著，用辛酸-飽和硫酸銨法對其進行純化，純化后放入-20°C環(huán)境保存。2、抗恩諾沙星的抗體(多抗)的制備(I)恩諾沙星免疫原的制備制備過程同上述恩諾沙星與載體蛋白的偶聯(lián)物的制備過程，最終獲得的純化后的ENR-OVA即為恩諾沙星免疫原。(2)動物免疫用步驟(I)獲得的恩諾沙星免疫原免疫新西蘭大白兔，免疫劑量為1.5mg/kg體重/次，免疫方式為頸背部皮下多點注射。首免時將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，每間隔3 4周取相同劑量免疫原加等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化后加強免疫一次，采用此方式共加免3次后，間隔3 4周再取相同劑量免疫原不加佐劑進行末次免疫。末次免疫10天后心臟采血，采用間接ELISA法測定血清抗體效價(測定方法同上所述)，結(jié)果表明血清效價為1:10000。接著，用硫酸銨分級沉淀得到純化的恩諾沙星多克隆抗體。(三)酶標(biāo)二抗的制備1、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗的制備羊抗鼠二抗的獲得:采用無病原體山羊作為免疫動物，將作為免疫原的鼠源性抗體(北京維德維康生物技術(shù)有限公司)按照免疫劑量為lmg/kg進行免疫，首免時將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，每間隔3 4周取相同劑量免疫原加等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化后加強免疫一次，采用此方式共加免3次后，間隔3 4周再取相同劑量免疫原不加佐劑進行末次免疫。末次免疫10天后心臟采血，采用間接ELISA法測定血清抗體效價(測定方法同上所述，包被原為非免疫用鼠源抗體)，用硫酸銨分級沉淀得到純化的山羊抗小鼠抗體。羊抗鼠二抗與堿性磷酸酶的偶聯(lián):將IOmg的堿性磷酸酶(Sigma公司，產(chǎn)品目錄號SIGMA-P7640)溶解在2mL的pH為5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(30.5ml的0.2M醋酸+19.5ml的0.2M醋酸鈉，使用前用水稀釋200倍使用)中，向該溶液中加入1.0%的戊二醛水溶液0.1mL ;按照酶:抗體的質(zhì)量比為1:2的比例加入待標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫攪拌反應(yīng)4小時。按照NaBH4:堿性磷酸酶質(zhì)量比為1:10的比例加入NaBH4，室溫攪拌反應(yīng)4小時。純化保存所得堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗的制備羊抗兔二抗:制備方法同步驟I中羊抗鼠二抗的制備，區(qū)別在于采用兔源性抗體(北京維德維康生物技術(shù)有限公司)作為免疫原。采用改良的過碘酸鈉法將羊抗兔二抗與辣根過氧化物酶(HRP)進行偶聯(lián)，具體如下:8mg辣根過氧化物酶(Sigma公司，產(chǎn)品目錄號:SU3472)溶解于2mL蒸懼水中。加入現(xiàn)配制的100mmol/L NaIO4水溶液0.4mL,室溫攪拌反應(yīng)20min。用lmmol/L pH=5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(30.5ml的0.2M醋酸+19.5ml的0.2M醋酸鈉，使用前用水稀釋200倍使用)于4°C透析過夜，除去多余的NaIO4,同時使自身偶聯(lián)的酶還原。加入磷酸鹽緩沖液(pH8.6、
0.5mol/L)40y L和含有羊抗兔二抗IgG16mg的磷酸鹽緩沖液(ρΗ8.6、5mol/L)2.0mL，室溫攪拌反應(yīng)4h。加入現(xiàn)配制的NaBH4水溶液(lmol/L)0.lmL，在4°C反應(yīng)4h，以還原Schiff堿。純化保存所得辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗。二、利用步驟一的試劑盒檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星1、樣品前處理牛奶樣品:用樣品稀釋液(0.02M的磷酸鹽緩沖液)對牛奶樣品按照體積比1:10(1+9)進行稀釋；例如，100 μ L牛奶樣品加入900 μ L的樣品稀釋液。取50 μ L上樣。2、用步驟一的試劑盒進行檢測(I)向包被有磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白的偶聯(lián)物和恩諾沙星與載體蛋白的偶聯(lián)物混合物的預(yù)包被酶標(biāo)板的微孔中加入標(biāo)準品溶液(磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液或恩諾沙星標(biāo)準溶液)或處理后樣品溶液50 μ L，再加入兩種一抗(步驟一 (二)中制備的磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體和恩諾沙星多克隆抗體)工作液各50μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min ；(2)洗滌:倒出孔中液體，每孔加入250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次,用吸水紙拍干；(3)加入酶標(biāo)二抗(步驟一(三)中制備的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗)工作液100 μ L, 37°C恒溫箱中反應(yīng)30min ；(4)倒出孔中液體，重復(fù)如步驟(2)所述的洗滌步驟；(5)堿性磷酸酶顯色:每孔加入堿性磷酸酶底物顯色液100 μ L，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值(0D值)，檢測波長為405nm。(6)洗滌:倒出孔中液體，每孔加入250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次,用吸水紙拍干；(7)每孔加入HRP底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，其中A液和B液的體積比為1:1 (各50 μ L);輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液2mol/L硫酸50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值(0D值)，檢測波長為450nm。3、檢測結(jié)果分析所得的每個濃度的標(biāo)準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準品溶液(O μ g/L標(biāo)準品溶液)的吸光度平均值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。百分吸光度值(%)= (B/B0) X100%分別以所述磺胺二甲嘧啶標(biāo)準溶液和所述恩諾沙星標(biāo)準溶液的濃度(μ g/L)為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準曲線圖，如圖1所示。用同樣的辦法計算步驟I的處理后樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個處理后樣品的濃度則可從標(biāo)準曲線上讀出樣本中所述磺胺二甲嘧啶和所述恩諾沙星的含量。也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。還可以利用計算機專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需較短時間，1.5h內(nèi)即可以完成。
實施例2、實施例1制備的酶聯(lián)免疫試劑盒精密度、準確度、特異性及保存期實驗本實施例將對實施例1制備的酶聯(lián)免疫試劑盒進行精密度、準確度、特異性及保存期的檢測，其間所涉及的試劑盒的使用方法、結(jié)果分析等參見實施例1步驟二相關(guān)步驟。一、試劑盒精密度實驗1、標(biāo)準品精密度試驗從實施例1制備的酶聯(lián)免疫試劑盒中取三批進行精密度檢測，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定20μ g/L標(biāo)準溶液(磺胺二甲嘧啶標(biāo)準品和恩諾沙星標(biāo)準品的混合溶液，兩者濃度均為20μ g/L)的吸光度值，計算變異系數(shù)(CV%)，結(jié)果見表I。表I標(biāo)準品精密度試驗結(jié)果(CV%)
權(quán)利要求
1.一種檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括抗體1、抗體2、包被原1、包被原2、酶標(biāo)記物I和酶標(biāo)記物2 ;所述抗體I為抗磺胺二甲基嘧啶的抗體，所述抗體2為抗恩諾沙星的抗體，所述包被原I為磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述包被原2為恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述酶標(biāo)記物I為抗所述抗體I的酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)記物2為抗所述抗體2的酶標(biāo)二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述酶聯(lián)免疫試劑盒還包括如下中的至少一種:磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液、恩諾沙星標(biāo)準溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、包被緩沖液、封閉液和樣品稀釋液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述抗磺胺二甲基嘧啶的抗體為抗磺胺二甲基嘧啶的單克隆抗體，由磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs CGMCCN0.3393產(chǎn)生；或 所述抗恩諾沙星的抗體為抗恩諾沙星的多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述載體蛋白為人血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍蛋白、牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白或兔血清蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶；或 所述底物顯色液由A液和B液組成；所述A液為過氧化脲或過氧化氫，所述B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺；所述終止液為硫酸；或 所述底物顯色液為對硝基苯磷酸酯溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述洗滌液為PH7.4、含有吐溫20的0.02M的磷酸鹽緩沖液；所述吐溫20在所述洗滌液中的體積含量為0.05% ;或 所述包被緩沖液為pH9.6,0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液； 所述封閉液為PH7.4，含小牛血清、蔗糖和酪蛋白的磷酸鹽緩沖液；所述小牛血清在所述封閉液中的體積含量為0.5%，所述蔗糖在所述封閉液中的含量為每IOOml所述封閉液中含有5g所述疊氮化鈉，所述酪蛋白在所述封閉液中的含量為每IOOml所述封閉液中含有Ig所述釀蛋白； 所述樣品稀釋液為0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括如下(I)或(2)的步驟: (1)將所述抗體1、所述抗體2、所述包被原1、所述包被原2、所述酶標(biāo)記物I和所述酶標(biāo)記物2分別單獨包裝的步驟； (2)將所述抗體1、所述抗體2、所述包被原1、所述包被原2、所述酶標(biāo)記物1、所述酶標(biāo)記物2、所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準溶液、所述恩諾沙星標(biāo)準溶液、所述底物顯色液、所述終止液、所述洗滌液、所述包被緩沖液和所述封閉液分別單獨包裝的步驟。
8.檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的方法，是利用權(quán)利要求1-6中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述方法中，所述酶聯(lián)免疫試劑盒中的包被原為權(quán)利要求1-6中任一中所述的包被原I和所述包被原2的混合物；所述酶聯(lián)免疫試劑盒中的抗體為權(quán)利要求1-6中任一中所述的抗體I和所述抗體2的混合物；所述酶聯(lián)免疫試劑盒中的酶標(biāo)記物為權(quán)利要求1-6中任一中所述的酶標(biāo)記物I和所述酶標(biāo)記物2的混合物。
10.磺胺類單克隆抗體雜交瘤細胞株SAs，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.3393 ;或 由所述磺胺類單克隆抗體雜交瘤細 胞株SAs CGMCC N0.3393產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測磺胺二甲基嘧啶和/或恩諾沙星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供試劑盒包括抗體1、抗體2、包被原1、包被原2、酶標(biāo)記物1和酶標(biāo)記物2；所述抗體1為抗磺胺二甲基嘧啶的抗體，所述抗體2為抗恩諾沙星的抗體，所述包被原1為磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述包被原2為恩諾沙星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述酶標(biāo)記物1為抗所述抗體1的酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)記物2為抗所述抗體2的酶標(biāo)二抗。本發(fā)明所提供試劑盒可定性或定量檢測待測樣品中磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星殘留，樣品前處理過程簡單；本發(fā)明檢驗方法簡便易行，特異性高、靈敏度高、精確度高。
文檔編號G01N33/577GK103197069SQ20131007852
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月12日
發(fā)明者沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 蔣文曉, 史為民, 江海洋, 張素霞, 丁雙陽, 曹興元, 李建成 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)