專利名稱：一種腺病毒芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腺病毒芯片及其用途，具體涉及一種人類全基因組腺病毒芯片及其用途。
背景技術(shù)：
在人類基因組全部測(cè)序完畢之后，下一步最重要的就是如何研究發(fā)現(xiàn)每一個(gè)基因的功能。只有知道了每個(gè)基因的功能，才能有效地治療人類的各種疾病。人類的每個(gè)基因都在身體內(nèi)行使一定的功能，疾病的廣生尤其是癌癥都是與基因有關(guān)系的。為了研究每個(gè)基因的功能，首先得有一個(gè)具體的cDNA基因克隆?；蚩寺【拖瘛扳n票”一樣在生物技術(shù)及生物制藥行業(yè)流通。因?yàn)楹芏嗉膊〉漠a(chǎn)生和發(fā)展都是很多基因共同作用的結(jié)果，將來(lái)的功能基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，新藥物的研發(fā)，都會(huì)依賴在高通量篩選中同時(shí)利用很多種基因克隆，尤其是以高密度芯片的方式。

反相轉(zhuǎn)染芯片技術(shù)利用人類的全長(zhǎng)基因是Ziauddin和Sabatini在2001年發(fā)明的。它在從基因組學(xué)到蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中起到了重要的橋梁作用。從一個(gè)基因芯片到一個(gè)以細(xì)胞為基礎(chǔ)的芯片技術(shù)上主要包括三個(gè)步驟:1)芯片的制造:芯片上的每一個(gè)樣點(diǎn)代表不同的表達(dá)人類基因的質(zhì)?？寺。?)然后加入轉(zhuǎn)染試劑到基因芯片上；3)加入附著性動(dòng)物細(xì)胞到芯片上培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞加入到基因芯片上之后，在轉(zhuǎn)染試劑的幫助下，附著的細(xì)胞吸取每個(gè)樣點(diǎn)上的質(zhì)粒克隆并得到轉(zhuǎn)染，同時(shí)每個(gè)樣點(diǎn)上的蛋白得到表達(dá)。這種技術(shù)可以同時(shí)用來(lái)研究成千上萬(wàn)種基因的表達(dá)。他在基因功能研究和藥物發(fā)現(xiàn)中有很重要的應(yīng)用。用人類全長(zhǎng)基因制成的生物芯片雖已存在，但這些芯片都是利用質(zhì)粒載體制成的。當(dāng)質(zhì)粒載體點(diǎn)到芯片上之后，它的轉(zhuǎn)染效率非常低。實(shí)際上，覆蓋人類整個(gè)基因組的全長(zhǎng)基因芯片也不存在。用質(zhì)粒做成的芯片的致命弱點(diǎn)是它不能用來(lái)轉(zhuǎn)染不分裂的細(xì)胞，像與疾病有關(guān)的原發(fā)細(xì)胞和干細(xì)胞?；蚬δ芙M學(xué)的目的是用以細(xì)胞為基礎(chǔ)的試驗(yàn)分析方式，在基因組的范圍內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)每一個(gè)基因的功能，尤其是利用原發(fā)細(xì)胞或者是干細(xì)胞，然而大部分原發(fā)細(xì)胞或干細(xì)胞不能用傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化。以病毒為基礎(chǔ)的載體，像腺病毒載體，對(duì)分裂或不分裂的細(xì)胞都有很高的轉(zhuǎn)染率。腺病毒載體是轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞最有效的，多樣化的系統(tǒng)，它被廣泛的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)研究和基因療法領(lǐng)域。腺病毒載體能夠有效的轉(zhuǎn)染分裂或不分裂的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到百分之百。腺病毒載體進(jìn)入細(xì)胞后不整合到人類基因組，所以它相對(duì)比較安全。腺病毒的生產(chǎn)比較容易達(dá)到很高的滴度，并且能夠容納多達(dá)30kb以上的外源基因。腺病毒重組蛋白的表達(dá)可以達(dá)到20-30%的細(xì)胞重量。與其他病毒載體(像慢病毒)相比，腺病毒更穩(wěn)定。病毒載體不僅轉(zhuǎn)染效率高，并且轉(zhuǎn)染過(guò)程中不影響細(xì)胞的生存，相反很多質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染試劑都有很高的毒性。因?yàn)橄俨《颈容^穩(wěn)定，容易保存和運(yùn)輸，它是一個(gè)很好的材料去制作人類全長(zhǎng)基因的“腺病毒芯片”。最常見(jiàn)的生物芯片是用寡聚核苷酸制成的。這些芯片的主要作用是用來(lái)測(cè)定基因表達(dá)和基因突變分析。這種芯片與人類全長(zhǎng)基因芯片有很多不同，因?yàn)槿L(zhǎng)基因芯片可以用來(lái)研究細(xì)胞的功能，形態(tài)變化，也就是說(shuō)可以用來(lái)測(cè)定基因產(chǎn)物，蛋白質(zhì)水平的變化。質(zhì)粒基因克隆可以放到96孔板或384孔板中，然后加入動(dòng)物細(xì)胞做細(xì)胞水平的分析，但是這種方式既繁瑣又昂貴。目前現(xiàn)有芯片存在以下問(wèn)題:
1.現(xiàn)有芯片細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低?，F(xiàn)有的基因芯片是用來(lái)研究基因表達(dá)和基因突變的，因?yàn)橛萌L(zhǎng)基因質(zhì)粒載體制成的芯片細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率非常低。一般質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率只有20%。當(dāng)質(zhì)粒載體被點(diǎn)到芯片上之后，其轉(zhuǎn)染效率會(huì)更低。低的轉(zhuǎn)染效率最終影響蛋白的表達(dá)和細(xì)胞功能的研究。2.現(xiàn)有芯片技術(shù)不能用來(lái)研究不分裂的細(xì)胞。在生理上和功能上與人類細(xì)胞或疾病細(xì)胞最相近的是很多原發(fā)細(xì)胞或干細(xì)胞，但是現(xiàn)有的全長(zhǎng)基因芯片不能夠轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。慢病毒雖然能夠轉(zhuǎn)染不分裂的細(xì)胞，但要得到高的滴度非常困難，所以也不能用來(lái)制造全長(zhǎng)基因芯片。3.當(dāng)質(zhì)?；蛐酒蠘狱c(diǎn)的密度增大時(shí)，相互污染會(huì)增加。在用芯片點(diǎn)樣機(jī)打印到顯微玻片之前，質(zhì)粒DNA要跟0.2%的凝膠混合。一般樣點(diǎn)的大小在100微米，間距在300-400微米。這樣最終影響一個(gè)芯片上基因克隆的數(shù)量。4.現(xiàn)有全長(zhǎng)基因高通量分析效率低，試劑消耗大?，F(xiàn)有的利用全長(zhǎng)基因的基因組范圍的高通量分析是在96孔或384孔板中進(jìn)行的。這種分析效率低，并且需要大量的實(shí)驗(yàn)試劑和動(dòng)物細(xì)胞。原發(fā)細(xì)胞和干細(xì)胞有時(shí)候很難得到大量的細(xì)胞，所以傳統(tǒng)的方式很難用到這些細(xì)胞的高通量分析。5.現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品的價(jià)格高。如果進(jìn)行全基因組范圍的高通量分析，需要購(gòu)買(mǎi)15，000-18,000個(gè)全長(zhǎng)基因質(zhì)?？寺?。這些克隆的價(jià)格至少在幾百萬(wàn)美元。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種腺病毒芯片。更進(jìn)一步本發(fā)明提供一種人類全基因組腺病毒芯片及其用途。本發(fā)明是將覆蓋人類基因組的腺病毒克隆制成一個(gè)高密度芯片，這樣可以并列同時(shí)分析整個(gè)基因組范圍的人源基因。制造腺病毒芯片的關(guān)鍵如提是生廣基因組范圍的腺病毒人源全長(zhǎng)基因克隆。我們已經(jīng)發(fā)明了高通量腺病毒克隆生產(chǎn)技術(shù)，利用該生產(chǎn)技術(shù)所提供的方案，現(xiàn)有的人源全長(zhǎng)基因克隆可以在短時(shí)間內(nèi)克隆到腺病毒載體并包裝成腺病毒粒子。本發(fā)明所述的腺病毒芯片是把含有人類的全長(zhǎng)基因的腺病毒粒子點(diǎn)到顯微玻璃芯片上制成的。當(dāng)高濃度的含有人類的全長(zhǎng)基因的腺病毒用芯片點(diǎn)樣儀打印到芯片上之后，用一種合成的封閉劑把有腺病毒的區(qū)域覆蓋，這樣有腺病毒的樣點(diǎn)就像一個(gè)一個(gè)分離的“島嶼” 一樣。然后在培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)的細(xì)胞(如，細(xì)胞HEK293)到芯片上，之后細(xì)胞會(huì)附著到有腺病毒的點(diǎn)上并得到腺病毒的轉(zhuǎn)染。最后在一層沒(méi)有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間產(chǎn)生很多活體的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。點(diǎn)到芯片上的腺病毒一般不擴(kuò)散，會(huì)聚集在一個(gè)小區(qū)域形成一個(gè)個(gè)的樣點(diǎn)。細(xì)胞形態(tài)的變化或熒光反應(yīng)可以用高通量的圖像掃描技術(shù)獲得。本發(fā)明所述腺病毒芯片的制備方案如下:
O生產(chǎn)高濃度腺病毒粒子:腺病毒克隆在線性化之后，轉(zhuǎn)染到6孔板中進(jìn)行腺病毒的包裝，腺病毒形成以后，擴(kuò)增1-2次，直至滴度達(dá)到IO9-1Oki粒子/毫升；
2)腺病毒芯片的生產(chǎn):用芯片點(diǎn)樣儀將高濃度的腺病毒打印到硝化纖維玻璃片上或其他的基質(zhì)上。每個(gè)樣點(diǎn)的大小在100-150微米，一個(gè)18X54毫米的玻璃片可以容納至少10，000-15，000個(gè)樣品，整個(gè)人類基因組可以打印到2個(gè)顯微玻璃片上。腺病毒芯片如附圖1所示。本發(fā)明所述腺病毒芯片可以轉(zhuǎn)化成蛋白芯片:將細(xì)胞加入到腺病毒芯片上培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞在過(guò)表達(dá)之后，每個(gè)基因所表達(dá)的蛋白可以得到固定，這樣腺病毒芯片就轉(zhuǎn)化成蛋白芯片。腺病毒芯片轉(zhuǎn)化的蛋白芯片可以容納人類基因組所有的基因，可以用來(lái)研究基因組中所有蛋白的功能。本發(fā)明腺病毒芯片的檢測(cè)可采用多種方式進(jìn)行，很多可以用于普通基因芯片的自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，儀器設(shè)備，都可以用在腺病毒芯片的檢測(cè)上。例如采用熒光標(biāo)記的方法進(jìn)行檢測(cè)，腺病毒克隆帶有綠色或紅色熒光蛋白標(biāo)簽，芯片可以用熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如附圖2所示。本發(fā)明所述腺病毒芯片可以應(yīng)用到很多不同的生物醫(yī)學(xué)研究:活體細(xì)胞分析(包括細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞凋亡，組織特異性基因表達(dá)，細(xì)胞對(duì)小分子的毒性和敏感性分析等)；腺病毒芯片還可以用來(lái)做免疫分析、酶活性分析、啟動(dòng)子/報(bào)告基因分析、抗體特異性分析、自身免疫疾病檢測(cè)、生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)等。(1)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行活體細(xì)胞分析:腺病毒芯片可以用來(lái)做以細(xì)胞為基礎(chǔ)的活體細(xì)胞分析。當(dāng)哺乳細(xì)胞加到芯片上和經(jīng)過(guò)培養(yǎng)之后，細(xì)胞的形態(tài)變化可以直接用顯微鏡觀察。應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。如果另外一個(gè)基因和芯片上的一個(gè)基因共同作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這個(gè)基因克隆可以加到細(xì)胞中一起加到芯片上，細(xì)胞凋亡也可以用顯微鏡觀察到。應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行小分子毒性和敏感性分析。如果一個(gè)小分子對(duì)細(xì)胞有毒性，但是一個(gè)特殊蛋白的表達(dá)有抗毒性，腺病毒芯片可以用來(lái)區(qū)別基因組內(nèi)哪一個(gè)基因有抗毒性，或用來(lái)測(cè)定對(duì)小分子的敏感性。(2)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行免疫分析。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以先跟腺病毒芯片一塊培養(yǎng)，這樣每個(gè)樣點(diǎn)上的基因得到過(guò)表達(dá)，然后細(xì)胞被固定之后，可以作免疫方面的分析。固定后的芯片可以跟需要測(cè)定的抗體反應(yīng)，過(guò)表達(dá)的蛋白可以被檢測(cè)到。(3)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行酶活性分析。酶底物可以加到細(xì)胞培養(yǎng)液中一塊用來(lái)與腺病毒芯片培養(yǎng)，通過(guò)一定的顯示方式(像顏色變化)來(lái)監(jiān)視基因組內(nèi)一種或幾種蛋白與酶底物的反應(yīng)。有時(shí)候一個(gè)酶底物會(huì)跟細(xì)胞內(nèi)很多酶起反應(yīng)，這樣通過(guò)全基因組芯片的方式可以發(fā)現(xiàn)所有相關(guān)的基因。(4)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行啟動(dòng)子/報(bào)告基因分析。為了發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子跟一個(gè)特殊的啟動(dòng)子反應(yīng)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始，啟動(dòng)子可以先跟一個(gè)報(bào)告基因(像綠色熒光蛋白)制成一個(gè)質(zhì)粒載體或腺病毒，然后與哺乳細(xì)胞一起轉(zhuǎn)染腺病毒芯片。如果基因組內(nèi)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活帶啟動(dòng)子的報(bào)告基因，報(bào)告基因的產(chǎn)物像綠色熒光可以從顯微鏡下觀察到。全基因組范圍的腺病毒芯片可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)所有與某一個(gè)啟動(dòng)子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或其他相關(guān)的基因或蛋白。(5)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行抗體特異性分析。所有疾病治療和疾病檢測(cè)的單克隆抗體都需要很高的特異性，也就是說(shuō)單克隆抗體應(yīng)該只對(duì)相對(duì)的抗原有反應(yīng)。腺病毒轉(zhuǎn)化的全基因組蛋白芯片可以用來(lái)檢測(cè)抗體的特異性。不同的單克隆抗體可以用來(lái)與蛋白芯片雜交。通過(guò)與所有蛋白的反應(yīng)，可以判定一個(gè)抗體是不是具有很高的特異性。(6)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行自身免疫疾病檢測(cè)。許多疾病是自身免疫造成的。這些病人的體液包括血液會(huì)含有自身免疫的抗體。通過(guò)與腺病毒轉(zhuǎn)化的全基因組蛋白芯片的反應(yīng)，可以檢測(cè)身體有哪一種自身免疫疾病。不同的自身免疫疾病有不同的生物標(biāo)記物，或不同的自身免疫抗體。(7)應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。全基因組的蛋白芯片可以用于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，比如卵巢癌生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。用很多卵巢癌病人的血液與蛋白芯片雜交，可以發(fā)現(xiàn)基因組范圍內(nèi)自身免疫抗體的種類。如果一個(gè)生物標(biāo)記物發(fā)生在所有活很多病人的血液中，該生物標(biāo)記物可能作為卵巢癌的生物標(biāo)記物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下突出的優(yōu)點(diǎn):
1、腺病毒粒子有很高的轉(zhuǎn)染效率。腺病毒比較容易得到很高的滴度(可達(dá)到IO12-1O13粒子/毫升)，所以轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到100%。相比質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率只有20-30%。蛋白質(zhì)利用腺病毒的表達(dá)可以達(dá)到10-30%的細(xì)胞干重，而質(zhì)粒載體蛋白的表達(dá)在0.1%以下。高的轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)是制作全基因組范圍芯片的重要基礎(chǔ)。2、腺病毒載體可以用來(lái)轉(zhuǎn)染分裂或不分裂的細(xì)胞，包括原發(fā)細(xì)胞和干細(xì)胞。質(zhì)粒載體不能用來(lái)轉(zhuǎn)染很多重要的與疾病有關(guān)的不分裂細(xì)胞，所以質(zhì)粒載體制成的芯片也不能用來(lái)做這方面的研究。對(duì)不同的細(xì)胞株，質(zhì)粒載體都有不同的轉(zhuǎn)染效率，所以針對(duì)不同的細(xì)胞株制作芯片上也應(yīng)作出調(diào)整，這樣在研發(fā)和測(cè)試上需要大量時(shí)間。腺病毒載體對(duì)各類不同的細(xì)胞株都有很高 的轉(zhuǎn)染效率，一個(gè)覆蓋基因組的產(chǎn)品可以用到各種細(xì)胞上。3、腺病毒芯片的密度高，互相污染少。腺病毒每個(gè)樣點(diǎn)的大小在100微米，間距在100微米。樣點(diǎn)一般保持在固定位置，沒(méi)有樣點(diǎn)之間的互相污染。與質(zhì)?；蛐酒啾?，腺病毒芯片的容量會(huì)增加2-3倍。4、腺病毒芯片可以用來(lái)做基因組范圍的高通量分析。由于腺病毒芯片的密度高，整個(gè)基因組可以打印到1-2個(gè)顯微玻片上?，F(xiàn)有全長(zhǎng)基因高通量分析是在96孔或384孔板中進(jìn)行的。如果整個(gè)基因組包含在兩個(gè)玻璃片上，可以放到一個(gè)培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)分析。這樣減少了孔與孔之間的差異，獲得的數(shù)據(jù)更可靠。因?yàn)楸稽c(diǎn)到玻片上的腺病毒極其微量，這樣可以同時(shí)生產(chǎn)大量的一樣的芯片。性能一樣的芯片對(duì)以后試驗(yàn)重復(fù)有利。5、生產(chǎn)全基因組范圍腺病毒芯片的關(guān)鍵是把每一個(gè)人源基因克隆到腺病毒載體并包裝成腺病毒。一旦有了基因組范圍的腺病毒，芯片的生產(chǎn)比較容易進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。作為一種消耗品，腺病毒芯片的成本會(huì)大大降低。利用96孔板或384孔板的方式作高通量分析，會(huì)利用大量的質(zhì)粒載體。因?yàn)橘|(zhì)粒載體會(huì)很容易的進(jìn)行再?gòu)?fù)制，一般生廠商也不會(huì)以這種方式制造。只有幾家大的制藥公司或生物技術(shù)公司能做這方面的分析。腺病毒芯片作為消耗品，可以大批量的生產(chǎn)。因?yàn)橐粋€(gè)芯片只能用一次，不同的實(shí)驗(yàn)需要再購(gòu)買(mǎi)新的芯片。其價(jià)格會(huì)是質(zhì)粒芯片的百分之一或幾十分之一。所以，本發(fā)明的實(shí)用性很強(qiáng)。6、腺病毒芯片可以轉(zhuǎn)化成蛋白芯片。用腺病毒載體，蛋白的表達(dá)可以達(dá)到10-30%細(xì)胞重量。過(guò)表達(dá)的腺病毒芯片可以作為蛋白芯片用在各種不同的生物學(xué)研究中。蛋白芯片有多種用途:可以定量分析癌細(xì)胞，體液和組織中蛋白的表達(dá)?？梢杂脕?lái)做生物標(biāo)記物的綜合性分析，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分析以及疾病診斷。對(duì)不同的疾病階段，不同的組織和器官，不同的病人的蛋白表達(dá)都可以用該蛋白芯片檢測(cè)。蛋白芯片還可以用來(lái)對(duì)蛋白動(dòng)態(tài)變化的分析，比如對(duì)外界不同的刺激，不同的藥量，或者不同的時(shí)間點(diǎn)。蛋白芯片還可以用來(lái)研究和識(shí)別蛋白信號(hào)傳遞途徑，評(píng)估分子藥靶點(diǎn)，和理解藥物作用機(jī)制。蛋白芯片也是一個(gè)好的方法去測(cè)定很多疾病包括癌癥中自身免疫性抗體的定量和定性分析。7、腺病毒芯片可以用到很多不同的生物醫(yī)學(xué)研究:細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞凋亡，組織特異性基因表達(dá)，細(xì)胞對(duì)小分子的毒性和敏感性分析。腺病毒芯片還可以用來(lái)做免疫分析，酶活性分析，啟動(dòng)子/報(bào)告基因分析。


圖1.腺病毒芯片。圖2.綠色和紅色熒光腺病毒在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的表達(dá):A是考馬斯亮藍(lán)的染色；B是在熒光顯微鏡下的熒光分析；綠色和紅色代表兩種腺病毒攜帶綠色熒光和紅色熒光基因，標(biāo)記的大小是100微米。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求的保護(hù)范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，為本領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)，通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)或按照制造廠商的操作指南所建議的方法進(jìn)行。實(shí)施例1.腺病毒芯片的制備
(1).載體制備
一般顯微玻片可以用來(lái)做載體。玻片首先浸入到25微克/毫升的硝化纖維素甲醇溶液中，然后在無(wú)菌的情況下讓甲醇蒸發(fā)，干燥。(2).腺病毒的制備
主要包括腺病毒質(zhì)粒載體的制備和腺病毒的包裝生產(chǎn)。1)人類的每個(gè)基因克隆首先用ORF引物擴(kuò)增，利用高通量的方式克隆到穿梭載體里，再用高通量的方式重組到腺病毒骨架載體內(nèi)。2)腺病毒的包裝。攜有人類基因的腺病毒在線性化之后，與轉(zhuǎn)染試劑一起，加入到6孔板的孔中，培養(yǎng)13天。之后，刮下細(xì)胞，用2000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心，加入1毫升PBS緩沖液，用液氮凍融4次。把0.5毫升的腺病毒加入到10厘米的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5-10天。重復(fù)10厘米培養(yǎng)2-3次到腺病毒滴度達(dá)到IO9-1Ow粒子/暈升。腺病毒可以在-70度作長(zhǎng)期保存。(3).芯片打印
用接觸式點(diǎn)樣，把制成的15 000個(gè)腺病毒人源克隆分布到384孔板中，打印針從多孔板取出樣品后直接打印在芯片上，打印時(shí)針頭與芯片接觸。如果每個(gè)樣點(diǎn)的大小是100微米，間距100微米，一個(gè)平方厘米的區(qū)域可以打印2500個(gè)樣點(diǎn)。
(4).覆蓋細(xì)胞間的區(qū)域
腺病毒樣點(diǎn)周圍的區(qū)域可以用過(guò)濾的封閉劑StabilGuard (SG01, SurModics,EdenPrairie,MN, USA)覆蓋45分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗。制成的芯片可以在_70度冰箱作長(zhǎng)期保存。實(shí)施例2.將腺病毒芯片轉(zhuǎn)成蛋白芯片
把腺病毒芯片放到培養(yǎng)皿中，加入I X IO6細(xì)胞(如，HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞)，8_10小時(shí)，37度，5% 二氧化碳培養(yǎng)。然后加入新鮮的培養(yǎng)液。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，可以對(duì)細(xì)胞作不同的處理。對(duì)細(xì)胞所做處理為本領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)。實(shí)施例3.腺病毒芯片熒光標(biāo)記的添加和檢測(cè)
(I)制作穿梭載體和腺病毒克隆的時(shí)候，把外源的基因和綠色熒光蛋白(GFP)愈合在一起。當(dāng)加入細(xì)胞到芯片上和細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染之后，熒光可以在熒光顯微鏡下直接觀察到。或者，GFP也可以在同一個(gè)載體中用不同的啟動(dòng)子或利用IRES方式表達(dá)。熒光和顏色都可以用高通量顯微鏡掃描技術(shù)獲得。(2)使用不同的標(biāo)簽或顏料標(biāo)記小分子化合物，蛋白或其他物質(zhì)來(lái)檢測(cè)。例如測(cè)定一個(gè)細(xì)胞表面受體(Receptor)和一個(gè)配體(Ligand)的結(jié)合,配體可以用不同的突光物質(zhì)或顏料標(biāo)記。在加入細(xì)胞到腺病毒芯片上的時(shí)候，也同時(shí)加入標(biāo)記好的配體。當(dāng)配體和基因組中一個(gè)受體結(jié)合時(shí)，熒光或顏色就會(huì)顯示在某一個(gè)樣點(diǎn)細(xì)胞的表面。熒光和顏色都可以用高通量顯微鏡掃描技術(shù)獲得。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例4.藥物發(fā)現(xiàn)和 研究
腺病毒芯片可以用來(lái)監(jiān)測(cè)一個(gè)小分子藥物對(duì)所有蛋白的結(jié)合性能。進(jìn)而能夠檢測(cè)藥物的毒性。例如，檢測(cè)一個(gè)很有效的候選藥物，小分子或大分子藥物對(duì)人體的毒性。腺病毒芯片經(jīng)過(guò)加入細(xì)胞培養(yǎng)之后，細(xì)胞所表達(dá)的蛋白被固定在芯片上，然后加入標(biāo)記好的候選藥物。如果候選藥物跟一個(gè)蛋白結(jié)合得很緊的話，標(biāo)記就能從哪一個(gè)樣點(diǎn)上檢測(cè)到。如果一個(gè)候選藥物除了跟靶標(biāo)蛋白結(jié)合，還與很多其他蛋白結(jié)合的話，這個(gè)候選藥物可能會(huì)有毒性。與此相反，如果一個(gè)候選藥物只與靶標(biāo)蛋白結(jié)合，說(shuō)明它的作用很專一，有其他毒性的可能性也小。全基因組的腺病毒芯片將是一個(gè)發(fā)現(xiàn)新藥物的重要工具。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例5.用來(lái)調(diào)查蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用
為了研究一個(gè)蛋白的所有相互作用的伙伴，該蛋白可以用熒光或其他顏料標(biāo)記，然后跟腺病毒芯片轉(zhuǎn)化后的蛋白芯片雜交。通過(guò)這種方式，所有與該蛋白相互作用的蛋白都可以從全基因組范圍的芯片中區(qū)別出來(lái)。一旦發(fā)現(xiàn)所有與該蛋白有關(guān)聯(lián)的其他蛋白，就會(huì)比較容易理解它的功能，尤其是對(duì)一個(gè)不知道功能的蛋白。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例6.細(xì)胞表面受體的發(fā)現(xiàn)
為了研究一個(gè)藥物，小分子化合物或大分子藥物例如蛋白或抗體的作用機(jī)制，需要發(fā)現(xiàn)該藥物的細(xì)胞表面受體。很多時(shí)候雖然知道一個(gè)藥物很有效，但不知道是通過(guò)那一個(gè)表面受體。候選藥物可以用熒光或其他顏料標(biāo)記，然后與腺病毒芯片一塊培養(yǎng)。如果該藥物與基因組中一個(gè)特殊的蛋白反應(yīng)的話，那一個(gè)樣點(diǎn)就會(huì)有熒光或其他顏色。熒光或顏色可以通過(guò)高通量顯微掃描技術(shù)獲得。腺病毒芯片在這方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榧?xì)胞所表達(dá)的蛋白保持在細(xì)胞表面或保持一定的立體結(jié)構(gòu)。標(biāo)記的藥物結(jié)合以后，整個(gè)芯片可以直接觀察或固定后觀察。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例7.活體細(xì)胞分析
以研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)候選藥物對(duì)癌細(xì)胞分裂的影響為例。候選藥物可以與癌細(xì)胞一塊加入培養(yǎng)皿與腺病毒芯片培養(yǎng)。藥物與某一個(gè)蛋白的反應(yīng)可能會(huì)阻止細(xì)胞的分裂，或?qū)е录?xì)胞形態(tài)的變化。與鄰近樣點(diǎn)比較，細(xì)胞形態(tài)的變化可以直接從顯微鏡下觀察到。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例8.應(yīng)用腺病毒芯片進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析
要研究一個(gè)配體是通過(guò)哪一個(gè)途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡，可以把這個(gè)受體一塊加入細(xì)胞和腺病毒芯片培養(yǎng)。因?yàn)檎麄€(gè)芯片在加入細(xì)胞培養(yǎng)后，每個(gè)樣點(diǎn)的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是活的細(xì)胞，所以細(xì)胞形態(tài)的變化很容易在顯微鏡地下觀察到。不同的影響細(xì)胞凋亡的藥物，其它化合物與基因組范圍蛋白的作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，可以直接從顯微鏡下觀察到。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例9.siRNA或shRNA驗(yàn)證
生產(chǎn)一整套基因組范圍的帶GFP標(biāo)記物的穿梭載體和腺病毒，然后制成腺病毒芯片。加入細(xì)胞培養(yǎng)之后，所有的樣點(diǎn)都應(yīng)該有熒光出現(xiàn)。如果一個(gè)siRNA或shRNA抑制(Knockdown) 一個(gè)基因，綠色熒光應(yīng)該消失或減弱。對(duì)一個(gè)藥物siRNA或shRNA，需要用整個(gè)基因組范圍的芯片去測(cè)定它是否有特異性。在細(xì)胞與芯片共同培養(yǎng)的時(shí)候加入siRNA或shRNA,然后觀察每個(gè)樣點(diǎn)綠色螢光的強(qiáng)度。這樣就可以斷定一個(gè)siRNA或shRNA是否只對(duì)應(yīng)該抑制的靶點(diǎn)起作用。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例10.酶活性分析
腺病毒芯片用于發(fā)現(xiàn)基因組中對(duì)一個(gè)特殊的底物起反應(yīng)的酶。底物可以用熒光或其它顏料標(biāo)記，然后與細(xì)胞和腺病毒芯片一塊培養(yǎng)。如果底物與一個(gè)特別的蛋白結(jié)合的話，那個(gè)特別的樣點(diǎn)就會(huì)有熒光或得到該顏料的標(biāo)記。有熒光的樣點(diǎn)可以用熒光顯微鏡區(qū)分出來(lái)。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例11.啟動(dòng)子/報(bào)告基因分析
將啟動(dòng)子的DNA序列與報(bào)告基因序列一起克隆到一個(gè)質(zhì)粒載體中。該啟動(dòng)子/報(bào)告基因質(zhì)粒可以一塊與細(xì)胞和腺病毒芯片培養(yǎng)。如果人類基因組中的任何一個(gè)表達(dá)的蛋白調(diào)節(jié)或激活啟動(dòng)子，那個(gè)樣點(diǎn)就會(huì)發(fā)出綠色熒光。熒光可以用顯微鏡觀察到。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例12.抗體特異性分析
利用腺病毒芯片來(lái)檢測(cè)Her-2單克隆抗體的特異性。該抗體是一個(gè)治療乳腺癌的抗體。為了檢測(cè)它的特異性，可以用該抗體與腺病毒芯片轉(zhuǎn)化 的蛋白芯片雜交。該抗體除了與靶標(biāo)蛋白有反應(yīng)以外，還與其他一個(gè)不相關(guān)的一個(gè)蛋白有交叉反應(yīng)。一個(gè)單克隆抗體的好壞決定于該抗體是否與其他蛋白有交叉反應(yīng)，利用腺病毒芯片可以有效對(duì)其特異性進(jìn)行分析。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例13.自身免疫疾病檢測(cè)
將病人的血液與腺病毒轉(zhuǎn)化的蛋白芯片雜交，一種或幾種不同的自身免疫抗體就可以被區(qū)別出來(lái)。根據(jù)是哪一種或幾種自身免疫抗體，就可以斷定該病人是有什么樣的疾病，因?yàn)楹芏嗉膊〉臉?biāo)記物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。最終該芯片可以作為一般人的疾病診斷應(yīng)用，包括健康人的血液樣品。在很多疾病還沒(méi)有癥狀的時(shí)候，生物標(biāo)記物或自身免疫抗體就產(chǎn)生了。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例14.生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)
一種疾病的生物標(biāo)記物是指自身免疫抗體或蛋白只發(fā)現(xiàn)在一個(gè)或很多個(gè)病人的樣品中，但不出現(xiàn)在健康人的樣品中。通過(guò)用健康人的樣品和很多病人的樣品與芯片雜交，就可以發(fā)現(xiàn)哪些蛋白或基因只在病人或大部分在病人的體內(nèi)表達(dá)，而不在或很少在健康人體內(nèi)表達(dá)。這些蛋白可以被認(rèn)為是該疾病的生物標(biāo)記物，因?yàn)樗麄兪桥c該疾病有關(guān)的。具體操作方法為本領(lǐng)域的一般方法。實(shí)施例15.本發(fā)明腺病毒芯片與普通質(zhì)粒芯片比較 采用列表的方法將本發(fā)明和普通載體做對(duì)比。
權(quán)利要求
1.一種腺病毒芯片，其特征在于，是將含有人類全基因組序列腺病毒粒子點(diǎn)到顯微玻璃芯片上制成的。
2.如權(quán)利要求1所述的腺病毒芯片，其特征在于，腺病毒芯片的制備方法如下: (1)生產(chǎn)高濃度腺病毒粒子:腺病毒克隆在線性化之后，轉(zhuǎn)染到6孔板中進(jìn)行腺病毒的包裝，腺病毒形成以后，擴(kuò)增1-2次，直至滴度達(dá)到IO9-1Oki粒子/毫升； (2)腺病毒芯片的生產(chǎn):用芯片點(diǎn)樣儀將高濃度的腺病毒打印到硝化纖維玻璃片上或其他的基質(zhì)上。
3.如權(quán)利要求1所述的腺病毒芯片，其特征在于，腺病毒芯片的制備方法具體操作如下: (1).載體制備 一般顯微玻片可以用來(lái)做載體，玻片首先浸入到25微克/毫升的硝化纖維素甲醇溶液中，然后在無(wú)菌的情況下讓甲醇蒸發(fā)，干燥； (2).腺病毒的制備 主要包括腺病毒質(zhì)粒載體的制備和腺病毒的包裝生產(chǎn): O人類的每個(gè)基因克隆首先用ORF引物擴(kuò)增，利用高通量的方式克隆到穿梭載體里，再用高通量的方式重組到腺病毒骨架載體內(nèi)； 2)腺病毒的包 裝:攜有人類基因的腺病毒在線性化之后，與轉(zhuǎn)染試劑一起，加入到6孔板的孔中，培養(yǎng)13天，之后，刮下細(xì)胞，用2000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心，加入I毫升PBS緩沖液，用液氮凍融4次，把0.5毫升的腺病毒加入到10厘米的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5-10天，重復(fù)10厘米培養(yǎng)2-3次到腺病毒滴度達(dá)到IO9-1Oki粒子/毫升，腺病毒可以在-70度作長(zhǎng)期保存； (3).芯片打印 用接觸式點(diǎn)樣，把制成的15 000個(gè)腺病毒人源克隆分布到384孔板中，打印針從多孔板取出樣品后直接打印在芯片上； (4).覆蓋細(xì)胞間的區(qū)域 腺病毒樣點(diǎn)周圍的區(qū)域用過(guò)濾的封閉劑覆蓋45分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗；制成的芯片可以在-70度冰箱作長(zhǎng)期保存。
4.如權(quán)利要求1所述腺病毒芯片，其特征在于，其腺病毒芯片可以轉(zhuǎn)化成蛋白芯片:將細(xì)胞加入到腺病毒芯片上培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞在過(guò)表達(dá)之后，每個(gè)基因所表達(dá)的蛋白可以得到固定，這樣腺病毒芯片就轉(zhuǎn)化成蛋白芯片。
5.如權(quán)利要求4所述腺病毒芯片，其特征在于，腺病毒芯片轉(zhuǎn)化成蛋白芯片的方法為:將細(xì)胞加入到腺病毒芯片上培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞在過(guò)表達(dá)之后，每個(gè)基因所表達(dá)的蛋白可以得到固定，這樣腺病毒芯片就轉(zhuǎn)化成蛋白芯片。
6.如權(quán)利要求4所述腺病毒芯片，其特征在于，所述蛋白芯片可用于抗體特異性分析、自身免疫疾病檢測(cè)、生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。
7.如權(quán)利要求1所述腺病毒芯片，其特征在于，用于活體細(xì)胞分析，如細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞凋亡，組織特異性基因表達(dá)，細(xì)胞對(duì)小分子的毒性和敏感性分析。
8.如權(quán)利要求1所述腺病毒芯片，其特征在于，用于免疫化學(xué)分析、酶活性分析、啟動(dòng)子/報(bào)告基因分析。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腺病毒芯片及其用途，具體涉及一種人類全基因組腺病毒芯片及其用途。本發(fā)明所述腺病毒芯片是把含有人類全長(zhǎng)基因的腺病毒粒子點(diǎn)到顯微玻璃芯片上制成的。包括生產(chǎn)高濃度腺病毒粒子和用芯片點(diǎn)樣儀將高濃度的腺病毒打印到硝化纖維玻璃片上或其他的基質(zhì)上。本發(fā)明腺病毒芯片還可以轉(zhuǎn)化成蛋白芯片。本發(fā)明所述腺病毒芯片可以應(yīng)用到很多不同的生物醫(yī)學(xué)研究活體細(xì)胞分析(細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞凋亡，組織特異性基因表達(dá)，細(xì)胞對(duì)小分子的毒性和敏感性分析)、腺病毒芯片還可以用來(lái)做免疫分析、酶活性分析、啟動(dòng)子/報(bào)告基因分析。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103103623SQ20131006635
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者孫在仁 申請(qǐng)人:山東維真生物科技有限公司