專利名稱：伊犁馬育種方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物分子生物學(xué)和育種領(lǐng)域，具體的說，涉及一種提高伊犁馬體尺性狀的育種方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
馬肉質(zhì)味極佳，越來越受到消費(fèi)者青睞，價(jià)格平穩(wěn)上揚(yáng)。近年來，隨著人們對馬肉理化特性和營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)一步認(rèn)識，逐漸明確了它們所具有的特殊作用。馬肉瘦肉多、脂肪少，含較多的不飽和脂肪酸，這種不飽和脂肪酸能抵消飽和脂肪酸促使血管中膽固醇沉積的有害過程等優(yōu)點(diǎn)，馬肉中膽固醇含量低，每IOOg可食肉中膽固醇含量僅為10.4-31.9mg,因此有很好的防止動(dòng)脈血管粥樣硬化的作用。國內(nèi)馬肉消費(fèi)主要集中在新疆、內(nèi)蒙等喜食馬肉的少數(shù)民族聚集區(qū)，馬肉市場銷售量逐年上升。新疆馬肉產(chǎn)量2000年3.57萬噸，2008年達(dá)到4.8萬噸。目前，國內(nèi)馬肉的產(chǎn)量已經(jīng)無法滿足消費(fèi)者日益增長的需求。同時(shí)在國際市場上也成為熱銷商品，因此發(fā)展肉用養(yǎng)馬業(yè)勢在必行。伊犁昭蘇馬場近年來從國外和東北引進(jìn)了大量的大型阿爾登馬對當(dāng)?shù)氐囊晾珩R進(jìn)行雜交改良，進(jìn)行肉用馬新類型的培育。但是馬作為大家畜，其世代間隔長，且馬的主要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳力低，用傳統(tǒng)的育種方法很難獲得較為顯著的遺傳進(jìn)展。要在常規(guī)的雜交和選優(yōu)交配培育馬的基礎(chǔ)上，需要篩選與馬的肉用性能密切相關(guān)的DNA標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，實(shí)現(xiàn)早期選種和選種的準(zhǔn)確性，加速伊犁馬肉用新類群的培育工作。生長發(fā)育性狀，屠宰性能和肉品質(zhì)是評價(jià)馬肉用性能的主要指標(biāo)。馬的體尺性狀的準(zhǔn)確測定能夠評估生長發(fā)育性狀，因此我們通過鑒定與馬的體尺性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，進(jìn)行肉用馬的標(biāo)記輔助選擇，加速伊犁馬肉用新類群的培育工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種伊犁馬的育種方法和試劑盒，通過檢測與伊犁馬肉用新類群體尺性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記,該位點(diǎn)位于如SEQ ID N0.1所示的170bp處,通過分子生物學(xué)技術(shù)檢測該標(biāo)記，利用該標(biāo)記輔助選擇有利的個(gè)體留種，以顯著提高伊犁馬肉用新類群的體尺性狀，即體高，體長，胸圍和管圍，加速伊犁馬肉用新類群的培育。本發(fā)明一方面涉及一種伊犁馬的育種方法，其特征在于包括如下步驟:提取伊犁馬父本和/或母本血液中的DNA，針對SEQ ID N0.1中170bp處的SNP多態(tài)性位點(diǎn)，根據(jù)SEQIDN0.1序列分別在其160bp上游、ISObp下游設(shè)計(jì)適合的、與其核苷酸互補(bǔ)的正向、反向引物，采用正反向引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Alu I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物使用凝膠電泳進(jìn)行檢測，選擇在凝膠電泳中出現(xiàn)2或者3條條帶的父本和/或母本作為育種的父本和/或母本。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其特征在于上游正向引物為:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’ 和 / 或下游的反向引物 5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’，選擇在凝膠電泳中284bp，169 bp，115bp附近有2或者3條條帶的父本和/或母本作為育種的父本和/或母本。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其特征在于選擇在284bp，169bp，115bp附近僅有2條條帶的父本和/或母本作為育種的父本和/或母本，優(yōu)選的，所述的條帶位于169bp 和 115bp 附近。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其特征在于還包括針對所培育的子代進(jìn)行相同的篩選步驟。本發(fā)明另一方面還涉及一種伊犁馬育種的試劑盒，其特征在于包括正向引物F:5，-TGGAGTCAGTTGGGTTTAATG-3，、反向引物 R: 5 ’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3 ’、Alu I 限制性內(nèi)切酶，任選的，包括PCR和/或凝膠電泳所需要的其它試劑。本發(fā)明還涉及上述試劑盒在提高伊犁馬體高和/或體長和/或胸圍和/或管圍中的應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法和試劑盒能夠顯著提高伊犁馬肉用新類群的體尺性狀，即體高，體長，胸圍和管圍，加速伊犁馬肉用新類群的培育。
具體實(shí)施方式
:1.與伊犁馬體尺性狀相關(guān)的SNP的獲得(I)伊犁馬基因組DNA的提取采集伊犁馬血液，使用肝素納抗凝，采取天根血液基因組試劑盒提取伊犁馬基因組DNA，0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸蛋白定量儀測定其濃度和純度，稀釋至50ng/ul，保存?zhèn)溆谩?2)目的片段的擴(kuò)增根據(jù)NCBI數(shù)據(jù) 庫收錄的馬的基因組序列設(shè)計(jì)引物，包括正向引物F:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’ 反向引物 R:5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’，擴(kuò)增出目的片段。如SEQ ID N0.1所示，該SNP位于擴(kuò)增到目的片段的170bp處，該處堿基可以為C或T，當(dāng)該處堿基為C時(shí)，可以被Alu I內(nèi)切酶識別，識別序列為AGCT。PCR反應(yīng)體系為25μ L，包含:10 X buff er2.5 μ L，IOpmol/μ L正反向引物各
0.5 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, 2.5U/ μ L DNA 聚合酶 0.4 μ L，50ng/ μ L DNA 模板 I μ L,余量用水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序:94 V 5分鐘；94 V 30秒，54 V 30秒，72 V 30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。(3)PCR-RFLP該P(yáng)CR產(chǎn)物用Alu I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為20yL:10yL PCR產(chǎn)物，2 μ LlO XBuffer, I μ LIOU/ μ LAlu I限制性內(nèi)切酶，余量為水。反應(yīng)條件:37°C溫育3小時(shí)。然后將得到的酶切產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相。(4)基因型判定根據(jù)PCR-RFLP的結(jié)果判定檢測個(gè)體的基因型。當(dāng)擴(kuò)增片段的170bp處堿基為C時(shí)，AluI內(nèi)切酶可以識別該位點(diǎn)，即可將PCR擴(kuò)增片段切成2條片段，一條為169bp，一條為115bp，該基因型記為CC型；當(dāng)擴(kuò)增片段的170bp處堿基為T時(shí)，Alu I內(nèi)切酶不能識別該位點(diǎn)，即無法切開PCR擴(kuò)增片段，凝膠中只有一條條帶，為284bp，該基因型記為TT型；當(dāng)擴(kuò)增片段的170bp處堿基既含有T又含有C時(shí)，凝膠中將有3條帶，分別為284bp，169bp，115bp，該基因型記為TC型。以上表明該位點(diǎn)存在3種基因型:TT:284，TC =284/169/115,CC:169/115。2伊犁馬不同基因型與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析按照實(shí)施I中方法，對采自新疆昭蘇縣158份伊犁馬進(jìn)行PCR-RFLP檢測，該SNP位點(diǎn)分析結(jié)果如表I所示:表ISNP位點(diǎn)在伊犁馬新類群中的基因型頻率和等位基因頻率
權(quán)利要求
1.一種伊犁馬的育種方法，其特征在于包括如下步驟:提取伊犁馬父本和/或母本血液中的DNA，針對SEQ ID N0.1中170bp處的SNP多態(tài)性位點(diǎn)，根據(jù)SEQ ID N0.1序列分別在其160bp上游-、180bp下游設(shè)計(jì)適合的、與其核苷酸互補(bǔ)的正向、反向引物,采用正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用Alu I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物使用凝膠電泳進(jìn)行檢測，選擇在凝膠電泳中出現(xiàn)2或者3條條帶的父本和/或母本作為育種的父本和/或母本。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊犁馬育種方法，其特征在于上游正向引物為:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’ 和下游的反向引物 5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’，選擇在凝膠電泳中284bp，169bp，115bp附近有2或者3條條帶的父本和/或母本作為育種的父本和/或母本。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的伊犁馬育種方法，其特征在于選擇在284bp，169bp，115bp附近僅有2條條帶的父本和/或母本作為育種的父本和/或母本，優(yōu)選的，所述的條帶位于169bp 和 115bp 附近。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的伊犁馬育種方法，其特征在于還包括針對所培育的子代進(jìn)行相同的篩選步驟。
5.—種伊犁馬育種的試劑盒，其特征在于包括正向引物F:5’ -TGGAGTCAGTTGGGITTAATG-3’、反向引物 R:5’ -GACCGGATAGCATAGAGAGAG-3’、Alu I 限制性內(nèi)切酶，任選的，包括PCR和/或凝膠電泳所需要的其它試劑。
6.權(quán)利要求 5所述的伊犁馬育種試劑盒在提高伊犁馬體高和/或體長和/或胸圍和/或管圍中 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種伊犁馬的育種方法和試劑盒，通過檢測伊犁馬的SNP進(jìn)行育種。采用本發(fā)明的方法和試劑盒能夠顯著提高伊犁馬肉用新類群的體尺性狀，即體高，體長，胸圍和管圍，加速伊犁馬肉用新類群的培育。
文檔編號G01N27/447GK103181361SQ20131004005
公開日2013年7月3日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者賀三剛, 李文蓉, 劉明軍, 耿娟, 張寧, 張雪梅, 劉晨曦, 鄭新寶, 董紅 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心