專利名稱：一種測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種同時(shí)測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及一種測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的試劑盒。
背景技術(shù)：
近十年來，單克隆抗體在生物醫(yī)藥界、乃至整個(gè)醫(yī)藥行業(yè)里取得重大的成功和巨大的發(fā)展。與傳統(tǒng)小分子藥物相比，單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，療效顯著，副作用小，用量少等優(yōu)點(diǎn)。就藥物分子特性而言，抗體具有更大的不均一性?？贵w的這一特性是由多種因素引起的，翻譯后修飾是其中最重要的內(nèi)在因素。常見的抗體翻譯后修飾包括糖基化，N端焦谷氨酸化，C端脫賴氨酸，脫酰胺，氧化，異構(gòu)化等。在抗體藥物研發(fā)的多個(gè)環(huán)節(jié)，如分子鑒定、工藝開發(fā)、質(zhì)量監(jiān)控等，均需要對翻譯后修飾進(jìn)行檢測分析。抗體IgG糖基化發(fā)生在重鏈Fe區(qū)的天冬酰胺，屬N-糖基化，是抗體的重要結(jié)構(gòu)組成。IgG糖鏈的核心單元由兩個(gè)N-乙酰葡萄糖胺和三個(gè)甘露糖的雙叉結(jié)構(gòu)連接組成，根據(jù)末端半乳糖、核心巖藻糖、末端唾液酸等的差異，可以組成多種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)。IgG的糖基化是不均一的，表現(xiàn)為不同的糖型和含量。糖基化差異可以影響抗體的生物學(xué)活性和藥代特征，如CDC、ADCC、體內(nèi)清除半衰期等?？贵wIgG的N端氨基酸為谷氨酰胺時(shí)，容易發(fā)生環(huán)化反應(yīng)而生成焦谷氨酸(pyroglutamicacid, pyroE)。此反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行,也可以在酶催化條件下進(jìn)行。在抗體IgG分子的C端，則容易發(fā)生脫賴氨酸(-K)。在大部分情況下，兩者對抗體的生物活性沒有影響，但亦有報(bào)道指某些抗體的N端焦谷氨酸化可能會影響其與抗原的結(jié)合力。此外，N端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸均會影響抗體的電荷分布，而電荷特性是抗體質(zhì)量監(jiān)控的重要指標(biāo)之一。因此，建立快速檢測抗體IgG糖基化和末端修飾的分析方法在抗體研發(fā)中具有重要意義。目前，本領(lǐng)域一般對糖基化和末端修飾單獨(dú)進(jìn)行檢測。酶解熒光標(biāo)記法是IgGl糖基化測定的經(jīng)典定量方法，但樣品處理過程相當(dāng)復(fù)雜，耗時(shí)長，而且需要樣品量大；也有使用質(zhì)譜測定IgG酶解片段進(jìn)行糖基化分析，如papain酶和IdeS酶等，但這些方法都存在一些不足，如酶切位點(diǎn)選擇性不強(qiáng)，或成本過高，或樣品處理復(fù)雜等，不適宜常規(guī)或工藝開發(fā)樣品的批量檢測。應(yīng)用LC-MS進(jìn)行肽圖分析理論上可以同時(shí)檢測抗體的糖基化和末端修飾，但含糖多肽的分離、測定和數(shù)據(jù)分析存在諸多技術(shù)難點(diǎn)，不適用于糖基化定量分析，而且樣品處理過程復(fù)雜，耗時(shí)長，酶切過程也可能對抗體原有末端修飾產(chǎn)生影響。因此，目前仍未有適用于抗體研發(fā)的對IgG的糖基化和末端修飾同時(shí)進(jìn)行快速測定的報(bào)道，也未有可以對少量抗體電荷異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確表征和鑒定的方法
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)測定免疫球蛋白(即抗體)電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，該方法能夠同時(shí)、快速地對免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸進(jìn)行測定，可以對少量抗體電荷異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確的表征和鑒定。同時(shí)本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的試劑盒。本發(fā)明提供一種測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟:I)使用陽離子交換色譜(CEX-HPLC)分析羧肽酶B酶切前后的免疫球蛋白，并按保留時(shí)間柱后收集不同免疫球蛋白電荷異構(gòu)體；2)使步驟I)中免疫球蛋白經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；4)使用質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；以及5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。其中，所述免疫球蛋白優(yōu)選為人免疫球蛋白，優(yōu)選為人免疫球蛋白IgG，進(jìn)一步優(yōu)選為人免疫球蛋白IgGl和IgG2亞型。并且，所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況優(yōu)選包括免疫球蛋白的輕鏈N端焦谷氨酸化，以及重鏈的天冬酰胺糖基化和N端焦谷氨酸化、C端脫賴氨酸。在本發(fā)明提供的測定方法中，所述步驟I)中的羧肽酶B與免疫球蛋白的質(zhì)量比為
I: 20;酶切時(shí)間為3小時(shí)。具體地，所述步驟2)包括:向一定量的免疫球蛋白中加入10_30μ L的1_6Μ鹽酸胍水溶液，混合均勻后加入1-4 μ L 二硫蘇糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)，其中，反應(yīng)溶液中DTT終濃度為25-100mM，免疫球蛋白終濃度為0.2-3 μ g/μ L0優(yōu)選地，所述步驟2)中的DTT終濃度為50mM。優(yōu)選地，所述步驟2)中的免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為50_65°C，反應(yīng)時(shí)間為 45min_120mino更優(yōu)選地，所述步驟2)中的免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)時(shí)間為45min。具體地,所述步驟3)具體包括:采用反向超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，以實(shí)現(xiàn)所述輕鏈和重鏈的基線分離，據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，采用的液相系統(tǒng)可以為UPLC (Waters,ACQUITY)。色譜柱:ffaters, ACQUITY UPLC column, BEH C4,1.7 μ m(粒徑)，300A (孔徑)，
2.1 X 50mm。流動(dòng)相洗脫條件對輕鏈和重鏈的分離影響較大，優(yōu)選地，色譜條件設(shè)定為:色譜柱溫度設(shè)定為55-65°C，進(jìn)樣量0.2-3 μ g ;流動(dòng)相X為0.1 %甲酸水，流動(dòng)相Y為0.1 %甲酸乙腈，流速為0.4mL/min ；梯度洗脫條件為:
權(quán)利要求
1.一種測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟: 1)使用陽離子交換色譜(CEX-HPLC)分析羧肽酶B酶切前后的免疫球蛋白，并按保留時(shí)間柱后收集不同免疫球蛋白電荷異構(gòu)體； 2)使步驟I)中免疫球蛋白經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈； 3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈； 4)使用質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；以及 5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述羧肽酶B與免疫球蛋白的質(zhì)量比為1: 20;酶切時(shí)間為3小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)包括:向一定量的免疫球蛋白中加入10-30yL的1-6M鹽酸胍水溶液，混合 均勻后加入1-4 μ L 二硫蘇糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)，其中，反應(yīng)溶液中DTT終濃度為25-100mM，免疫球蛋白終濃度為0.2-3 μ g/μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中DTT終濃度為50mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為50-65°C，反應(yīng)時(shí)間為 45min_120mino
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫球蛋白發(fā)生變性、還原反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)時(shí)間為45min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟3)包括:采用C4反向超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，以實(shí)現(xiàn)所述輕鏈和重鏈的基線分離。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟4)包括: 采用電噴霧電離質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量，其中在0-5min，流路通往廢液，5-16min，流路通往質(zhì)譜，然后采用正離子模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
質(zhì)譜條件設(shè)定為: 錐孔氣流為50.0L/Hr，脫溶劑氣體為800.0L/Hr，脫溶劑溫度為500°C，錐孔電壓為20-40V，掃描范圍為400-2500Da，掃描時(shí)間為Is。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟5)包括: 由步驟3)中獲得的色譜峰面積計(jì)算得到所述免疫球蛋白的輕鏈的N端焦谷氨酸化比例，由步驟4)中獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)計(jì)算得到所述免疫球蛋白的重鏈的糖型相對含量以及N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸比例。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述免 疫球蛋白為人免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測定免疫球蛋白電荷異構(gòu)體的糖基化和末端修飾情況的方法，該方法能夠同時(shí)、快速地對免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸進(jìn)行測定，所述方法包括以下步驟1)使用陽離子交換色譜(CEX-HPLC)分析羧肽酶B酶切前后的免疫球蛋白，并按保留時(shí)間柱后收集不同免疫球蛋白電荷異構(gòu)體；2)使步驟1)中免疫球蛋白經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；4)使用質(zhì)譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；以及5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。
文檔編號G01N30/88GK103217499SQ20131002751
公開日2013年7月24日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者朱保國, 彭育才, 楊嘉明 申請人:珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司