檢測殺細胞的毒素(pvl)的裝置和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供檢測生物樣本中生物分子，例如PVL,PBP2a和SPA的方法和裝置。
【專利說明】
檢測殺細胞的毒素(PVL)的裝置和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測生物樣品中細菌毒素的裝置和方法。尤其本發(fā)明涉及一種用于識別樣品中存在的金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的生物分子，如殺細胞的毒素(Panton-Valentine Leukocidin, PVL)和 PBP2a,的橫向流動檢測。

【背景技術(shù)】
[0002]接下去的背景信息旨在幫助讀者理解本發(fā)明，并不屬于現(xiàn)有技術(shù)。
[0003]金黃色葡萄球菌是一種臨床醫(yī)學(xué)革蘭氏陽性菌。約20-30%的健康人群的粘膜上攜帶金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌可引起多種疾病，包括敗血癥，中毒性休克，肺炎，皮膚和軟組織感染，骨和人造植入物的感染。金黃色葡萄球菌也在多種動物中被檢測到。
[0004]耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是含有被稱為PBP2a的另一種青霉素結(jié)合蛋白的金黃色葡萄球菌，PBP2a由基因mecA基因和不同的等位基因編碼。正如其名稱所示，MRSA的檢測是通過存在甲氧西林情況下觀察到金黃色葡萄球菌的生長，也可以是其他β -內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素類，頭孢菌素類和碳青霉烯類。
[0005]由于治療方法的局限性，MRSA是住院患者發(fā)病和死亡的一個重要原因，并對感染控制和公共衛(wèi)生提出了挑戰(zhàn)。由于需要昂貴的二線藥物和檢疫措施，MRSA花費了醫(yī)療服務(wù)提供者相當(dāng)多的成本。世界上估計有5300萬MRSA攜帶者，美國有250萬MRSA攜帶者。
[0006]殺白細胞毒素(PVL)的毒素是金黃色葡萄球菌的噬菌體源性致病因子。它是金黃色葡萄球菌和MRSA臨床上重要的噬菌體源性的致病因子。PVL是由兩個相鄰的共同表達基因 IukS-PV 和 lukF-PV(lukS-PV, IukF-PV, GenBank ΒΑ000033.2:MW1378undMWl379)編碼。IukS-PV的T細胞表位能誘發(fā)LsT細胞強烈增殖，該IukS-PV的T細胞表位目前具有以下特點:N169YISEVERQNSKSVQWGIKANSFIT193 (Brown, et al.，OpenJ.1mmunol.，2(3):111-115(2012))。這些分子的聚合物在人類白細胞細胞膜上形成孔，導(dǎo)致細胞死亡和細胞因子的釋放否?；蛘撸涞蜐舛瓤烧T導(dǎo)粒細胞的細胞凋亡。
[0007]PVL與Y -溶血素(lukF/S-hlg)和其他殺白細胞素有關(guān)(金黃色葡萄球菌中的lukE/D, lukM/lukF_P83和中間葡萄球菌(S.1ntermedius) /假中間葡萄球菌(S.pseudintermedius)中的lukF/S-1nt)。PVL在結(jié)構(gòu)上，按照序列相似性，與其它殺白細胞素有關(guān)，如金黃色葡萄球菌中的lukE/D，lukM/lukF-P83和中間葡萄球菌(S.1ntermedius)/ 假中間葡萄球菌(S.pseudintermedius)中的 lukF/S-1nt,與 hlgA/lukF/S-hlg - Y-溶血素/殺白細胞素位點。
[0008]如上所述，PVL是人類白細胞素，因為它在白血細胞的細胞膜上形成聚合微孔。白細胞死亡導(dǎo)致細胞因子的釋放并吸引新的白血細胞。PVL基因為噬菌體源性并且是可移動的；它們被發(fā)現(xiàn)有非常多樣化的克隆物(例如CC1，5，8，15，22，25，30，45，59，72，80，88，93，96/154，121，188，398)。到目前為止，PVL僅限于從人體分離的金黃色葡萄球菌菌株中。來自反芻動物(如牛，山羊和綿羊)的金黃色葡萄球菌有另一種特異的殺白細胞素，由IukM和lukF-P83 (例如，在 CC479, 151，133，97，30，20 中)基因編碼。
[0009]當(dāng)皮膚和軟組織感染(SSTI)與慢性/復(fù)發(fā)性感染有關(guān)時，如癤病，尤其是在年輕人和曾健康的成年人中，從那里分離出的金黃色葡萄球菌中PVL經(jīng)常能被檢測到。PVL陽性的金黃色葡萄球菌也可引起更嚴重的疾病，例如壞死性肺炎。這種情況偶爾是其他呼吸道感染的并發(fā)癥如感冒，其致死率可高達40%。與此相反，分離自健康攜帶者的金黃色葡萄球菌，或從那些與其他感染類型如菌血病有關(guān)的菌株中，PVL很少被分離到。
[0010]雖然PVL在20世紀(jì)30年代才有描述，但在19世紀(jì)后期(28)就已假設(shè)PVL為由某些金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的一種強效殺白細胞素。在20世紀(jì)40年代和60年代，全球爆發(fā)PVL陽性，甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌，到20世紀(jì)90年代后期已經(jīng)出現(xiàn)PVL陽性MRSA后天免疫性群體(caMRSA)。
[0011]很多臨床狀況與PVL有關(guān)，包括皮膚和軟組織感染，膿腫，癤病(癤)，和乳腺炎。這些狀況的范圍從輕微感染到威脅生命，例如壞死性筋膜炎。與PVL相關(guān)的感染往往是慢性或反復(fù)出現(xiàn)的。金黃色葡萄球菌偶爾也引起肺炎，常作為重復(fù)感染或流行感冒的并發(fā)癥。壞死性肺炎，肺炎的最嚴重形式，通常與PVL有關(guān)，并且往往是致命的。
[0012]從健康攜帶者或與植入物有關(guān)的感染中分離到的金黃色葡萄球菌中，PVL是極罕見的。而來自如膿腫或癤等感染的菌株中，PVL是普遍的。由于傾向于引起慢性、復(fù)發(fā)性或特別嚴重感染，要確保對PVL陽性金黃色葡萄球菌菌株的治療不同于“正?！苯瘘S色葡萄球菌，要更加積極。在英國，這是衛(wèi)生防護局做出的指導(dǎo)方針的官方推薦。
[0013]迄今為止，PVL檢測主要使用分子方法，該方法基本上局限于具有設(shè)備和經(jīng)驗的參考中心和專業(yè)實驗室來進行這種測定。目前檢測PVL和PBP2a的方法包括聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)來鑒定PVL和PBP2a的基因。PCR只能在專門的實驗室用專用硬件和訓(xùn)練有素的人員來執(zhí)行并且需要樣品的制備。那些具有家庭醫(yī)生和初級保健中心的患者不能使用這樣的實驗設(shè)施。這些不能確診案例因而可能沒有得到充分治療，對病人造成更大的健康風(fēng)險，并對醫(yī)生和醫(yī)院造成潛在的經(jīng)濟后果。鑒定產(chǎn)生PVL的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的其他方法，諸如那些在美國2010/0129839中公開的方法，需要預(yù)處理生物樣品(即，加熱)以變性PVL，除了要耗費更多時間和工作的免疫性測定如ELISA。
[0014]因此，最小限度樣品處理的快來速檢測PVL，PVP2a與金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的方法和裝置，同時確保準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果，這個需求持續(xù)存在。一個簡單，快速的檢測可以促進在初級和二級保健機構(gòu)對PVL相關(guān)疾病的診斷，并確定該菌株是否耐甲氧西林?？焖贆z測節(jié)省時間，因為來自參考實驗室的結(jié)果往往需要數(shù)天或數(shù)周。從PVL陰性MRSA菌株中區(qū)分PVL陽性的MASA菌株的測試可能最終對患者造成更大的治療益處，有助于在醫(yī)院內(nèi)預(yù)防前者的傳播。另外，從PBP2a陰性MRSA菌株中區(qū)分PBP2a陽性MRSA菌株的測試可能最終對患者造成更大的治療益處，有助于在醫(yī)院內(nèi)預(yù)防前者的傳播。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明提供了用于檢測生物分子如生物樣品中的PVL，PBP2a和SPV的橫向流動動測定。該測定包括利用噬菌體展示技術(shù)培育針對金黃色葡萄球菌的PVL，PBP2a和SPA的重組抗體。
[0016]在一些實施例中，生物樣品是培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)物，傷口拭子，鼻拭子，或在獸醫(yī)學(xué)中，傷口或乳房拭子。在實施例中，初代培養(yǎng)物是采自感染的患者，例如可能由多種病原體引起的癤病和膿腫。
[0017]本發(fā)明上述的摘要不意味著限制，從接下去的詳細描述以及權(quán)利要求中將會明顯體現(xiàn)本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1A是一個表格，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的一些【具體實施方式】中的毒素抗體測定，顯示了代表菌株體外產(chǎn)生PVL的濃度。
[0019]圖1B是一個圖，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實施例，顯示了代表菌株體外產(chǎn)生PVL的濃度。
[0020]圖2是一個表格，其所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明毒素抗體測定實施例，來說明產(chǎn)生不同濃度毒素的不同菌株被確認。
[0021]圖3是一個表格，其所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明毒素抗體測定實施例。描述了一個矩陣用于序列測定，來確定抗體的最優(yōu)組合。0，無反應(yīng)；(+)到+++，活性從弱到強。
[0022]圖4是一個圖形，顯示了本發(fā)明的一個實施例(PVL-1401)中抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列信息。
[0023]圖5是一個圖形，顯示了本發(fā)明的一個實施例(PVL-1841)中抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列信息。
[0024]圖6是一個圖形，顯示了本發(fā)明的一個實施例(PVL-1321)中抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列信息。
[0025]圖7是一個圖形，顯示了本發(fā)明的一個實施例中使用Binax卡片形式來測定的過程。
[0026]圖8A的表格中描述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實施例，說明產(chǎn)生不同濃度的毒素的不同菌株已經(jīng)被確認。
[0027]圖SB表格中描述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實施例，說明產(chǎn)生不同濃度的毒素的不同菌株已經(jīng)被確認。
[0028]圖9是一個表格，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實施例，來說明不同的固體培養(yǎng)基可以被使用。
[0029]圖10是一個表格，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實施例，來說明不同的液體培養(yǎng)基可以被使用。
[0030]圖11的表格表示數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實施例。通過測定588個臨床分離物和12個參考菌株，同時平行的用分子手段(DNA芯片)定性，獲得敏感性，特異性，陽性和陰性預(yù)測值。
[0031]圖12A列出了菌株和克隆物，并從復(fù)合物中鑒定PVL陽性的菌株，來開發(fā)本發(fā)明實施例中的毒素抗體測定。
[0032]圖12B列出了菌株和克隆物，并從復(fù)合物中鑒定PVL陽性的菌株，來開發(fā)本發(fā)明實施例中的毒素抗體測定。
[0033]圖13是一個表格，所示數(shù)據(jù)是來自幾個國家的臨床分離菌株的初步試驗。
[0034]圖14的表格表示通過位點研究獲得的PVL陰性MSSA，PVL陰性MRSA，PVL陽性MSSA和PVL陽性MRSA的概率。
[0035]詳細描述
[0036]本發(fā)明提供的裝置和方法用于確定樣品中被分析物的存在或存在數(shù)量。在一個實施例中，本發(fā)明提供檢測細菌生物分子或毒素的設(shè)備和方法，例如生物樣品中的金黃色葡萄球菌的PVL或PVP2a。在一個實施例中，樣品是來自患者的生物樣品。
[0037]用PCR產(chǎn)物來構(gòu)建一個HisTaq-PVL融合質(zhì)粒，該PCR產(chǎn)物包括來自已經(jīng)過測序的參考菌株MW2/USA400中，PVL和IukF-PV兩個組分中的一個組分的完整開放讀碼框。純的IukF-PV融合蛋白被合成，分離和純化。將純化的材料作為抗原用于初次免疫，隨后通過特定的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生抗體。用不同的技術(shù)，天然和重組PV被用來進行噬菌體展示技術(shù)。類似的方法被用于開發(fā)PVP2a和SPA的抗體。
[0038]噬菌體展示抗體通過ELISA法初步定性，不同稀釋物在微量管/帶式蛋白質(zhì)微芯片中被識別(ArrayTube?(AT)或ArrayStrip?(AS)的平臺，由美艾利爾(Alere)技術(shù)有限公司開發(fā))。捕獲和檢測抗體之間的所有可能組合都用微芯片來檢測，從而發(fā)現(xiàn)在已知濃度的重組和天然毒素制劑的特定條件下的最特異，最敏感的抗體對。因此，對這些抗體的每一種可能的組合進行了測定，并且對PVL，SPA或PBP2a具有最高的靈敏度和特異性的抗體對進行鑒定。
[0039]針對重組生物分子產(chǎn)生的噬菌體展示抗體進行活性篩選，不僅只針對HisTaq融合蛋白，也針對生物分子的原始形式。微芯片分析結(jié)果表明，重組抗體能識別原始生物分子。然后這些抗體被用于開發(fā)橫向流動動測定，以檢測包括PVL，SPA和PBP2a的生物分子。通過一系列毒素稀釋物，橫向流的檢測極限大約是在I納克/毫升的數(shù)量級(見下文)。固定在微芯片上的抗體被用于評估金黃色葡萄球菌臨床分離物的生物分子產(chǎn)物。一般來說，在相同培養(yǎng)條件下克隆物從屬關(guān)系和外毒素產(chǎn)量間有一定的相關(guān)性。
[0040]收集的USA300臨床分離物(ST8MRSA-1V，平均產(chǎn)生約4000納克/毫升PVL，F(xiàn)組分)，昆士蘭克隆(ST93-MRSA-1V，約 5000 納克 / 毫升)，ST93-MSSA(ca.6，500 納克 / 毫升)和ST59-MRSA-VT (約3，000納克/毫升)顯然平均產(chǎn)生比其他PVL陽性MRSA或MSSA菌株更多的PVL，例如ST80-MRSA-1V (ca.250納克/毫升)，和CC5-MSSA (ca.750納克/毫升)。這些實驗證明，任何測試的菌株產(chǎn)生PVL產(chǎn)量的濃度明顯高于所選的抗體組合的檢測極限。
[0041]在一個實施例中，在檢測設(shè)備中使用的抗體是PVL，SPA或PBP2a特異的重組噬菌體展示的抗體。在實施例中，在檢測設(shè)備中使用的抗體是下列抗體克隆中的一個或多個=PVL-1031, PVL-1061, PVL-1101, PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771，PVL-1841, PVL-1881, PBP2a_1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10,PBP2a-17C8, PBP2a_19Bl, PBP2a_8A5, PBP2a_9C6, PBP2a_pc_2.1, PBP2a_pc_2.2，SPA-A135,and SPA-4412.
[0042]在實施例中，抗體對包括抗體克隆PVL-1841，其可以與金顆粒軛合，抗體對也包括抗體克隆PVL-1401，它可以被固定，例如，在硝酸纖維素膜上作為捕獲抗體。在其他實施例中，抗體對包括抗體克隆PVL-1841，其可以與金顆粒軛合，它也包括抗體克隆PVL-1321和抗體克隆PVL-1401作為捕獲抗體被固定在，例如硝酸纖維素膜上?？贵w克隆PVL-1321檢測人的PVL，而抗體克隆PVL-1401檢測人的PVL以及與牛乳腺炎的發(fā)病有關(guān)的牛變種(lukF-P83)。
[0043]在一個實施例中，在基礎(chǔ)微生物實驗室的條件下化驗可以被用于檢測金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中的生物分子。在一些實施方案中，使用的基本設(shè)備來執(zhí)行化驗，例如接種環(huán)，培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱，和在細菌學(xué)和生物安全中的基本知識。本發(fā)明允許快速檢測PVL，PBP2a和SPA,例如，直接對過夜細菌培養(yǎng)物進行化驗，無需使用專門的設(shè)備，例如熱循環(huán)儀，不需要生物分子的變型，例如通過加熱，不需要專業(yè)分子生物學(xué)技術(shù)知識，如，核酸擴增。
[0044]在實施例中，用從患者皮膚和軟組織感染中得到的拭子來執(zhí)行化驗，拭子樣品可以在固體培養(yǎng)基上進行過夜初培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌克隆在初培養(yǎng)中被鑒定并檢測PVL，PBP2a和/或SPA的存在。在混合培養(yǎng)物或具有皮膚植物區(qū)系污染物的情況下，通過標(biāo)準(zhǔn)實驗程序分離金黃色葡萄球菌進行二次培養(yǎng)。無論在初次或者二次培養(yǎng)中的生物分子都用試驗設(shè)備檢測，例如橫向流動試紙，卡或試劑盒。
[0045]各種各樣的檢測設(shè)備可用于檢測生物樣品中生物分子的存在或不存在。在一個實施例中，測試裝置可以是一種免疫測定裝置，諸如橫向流測試條，其被廣泛用于測試各種分析物。然而，任何適宜的化驗裝置可以在本發(fā)明中被使用。
[0046]在一個實施例中，也可使用折疊卡片形式化驗裝置，例如霍華德錢德勒的美國專利號5468648(這里完整的引用在參考文獻中)所述的裝置。在另一個實施方案中，可使用帶盒式測定裝置。通過本發(fā)明中所述的測試裝置對各種分析物進行檢測或定量。該被分析物可以是傳染性病原體。
[0047]測試試紙可被用于多種形式，如免疫或化學(xué)檢測形式，用于檢測樣品中的目的被分析物。在特異結(jié)合化驗中，如免疫測定法，浸潰試劑測試條的使用，是眾所周知的(見，例如，May等的美國專利號5622871，完整的被引用在參考文獻中)。測試條也可配置在非競爭性或競爭性測定形式中。在一些形式中，具有樣品應(yīng)用區(qū)，試劑區(qū)，和測試結(jié)果區(qū)的測試試紙條具有吸水材料。樣品被施加到樣品應(yīng)用區(qū)并通過毛細管作用流入試劑區(qū)。
[0048]在試劑區(qū)，樣品溶解并與檢測被分析物(如果存在)必需的試劑混合?，F(xiàn)在樣品承載著試劑，繼續(xù)流至測試結(jié)果區(qū)域中。另外一些試劑被固定在測試結(jié)果區(qū)域中，諸如與被分析物特異結(jié)合的分子。這些試劑與被分析物(如果存在的話)或者來自試劑區(qū)的第一試劑中的一種反應(yīng)，結(jié)合。用來提供可檢測的信號的標(biāo)記存在于試劑區(qū)域中，或者在一個單獨的標(biāo)記區(qū)域。
[0049]一般，在非競爭性形式中，如果樣品中含有被分析物則產(chǎn)生信號，如果不存在被分析物則沒有信號產(chǎn)生。在競爭形式中，沒有被分析物存在時產(chǎn)生信號，如果被分析物存在則沒有信號產(chǎn)生。
[0050]在被分析物通過信號產(chǎn)生系統(tǒng)被檢測的實施例中，例如通過與被分析物特異性反應(yīng)的一種或多種酶，信號產(chǎn)生系統(tǒng)的一個或多個組件可以與測試條材料上的被分析物檢測區(qū)綁定，綁定的方式與上述的特異結(jié)合成分與檢測試紙條材料的相同?？商娲幕蚋郊拥模ㄔ跇悠窇?yīng)用區(qū)，試劑區(qū)，或測試條的分析物檢測區(qū)的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的組成部分，或者被包括在整個測試條中的部分，可被浸潰到測試條的一種或多種材料中?？梢酝ㄟ^這些組分溶液的表面處理，或通過一個或多個測試條材料浸沒入這些組分溶液來實現(xiàn)。一個或多個表面處理或一個或多個浸沒之后，測試條材料被干燥?？商娲幕蚋郊拥模ㄔ跇悠窇?yīng)用區(qū)，試劑區(qū)，或測試條的被分析物檢測區(qū)的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的組分，或包含在整個測試條中的組分，可被應(yīng)用到一個或多個測試條的測試條材料的表面，如同標(biāo)記試劑一樣。
[0051]使用過程中，一個取樣裝置，例如拭子，可用于收集生物樣品，如來自患者受感染的傷口的樣品。一旦樣品被收集，可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或直接施加到測定裝置。生物樣品可以在應(yīng)用到測定裝置之前，先在固體或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，下面的例子中有進一步描述。該樣品被施加到一個測定裝置以確定目的被分析物的存在或存在濃度。在實施例中，測定可用于單獨檢測金黃色葡萄球菌PVL、金黃色葡萄球菌PBP2a、SPA的存在，不存在，或存在濃度，或者用于檢測它們的任意組合，或包括其他相關(guān)標(biāo)記組合例如，中毒性休克綜合征毒素(TST1編碼)，腸毒素A(entA或sea),腸毒素B(entB或seb),來自
S.pseuintermedius, S.1ntermedius,或 S delphinii 的殺白細胞毒素，α 毒素(α -溶血素，HLA)或β-溶血素(HLB)。在其它實施例中，上述的方法和裝置可用于檢測來源于動物樣品的金黃色葡萄球菌或其毒素。例如，在反芻動物的各種物種中，包括，金黃色葡萄球菌克隆物CC151和479占主導(dǎo)地位，它們是引起牛乳腺炎的常見原因。顯然，大多數(shù)牛菌株攜帶殺白細胞素基因lukM/lukF-P83，它可以作為偶然在人菌株間傳播的牛群流行菌株變異的一個標(biāo)記。
[0052]如本文中所討論的，本發(fā)明提供了抗體，或能特異結(jié)合PVL毒素的功能性結(jié)合片段。所述抗體或抗體片段不需要預(yù)處理就能夠特異性結(jié)合生物分子，例如，通過生物分子的變性。在一個實施例中，抗體或它的功能性結(jié)合片段，其特異性結(jié)合下面的一個或多個基因的表達產(chǎn)物:LUKS-PV，IukF-PV, IukM, lukF_P83，mecA和spa。例如，本發(fā)明的抗體可以是對 LUKS-PV 的 T 細胞表位具有特異性的抗體:N16OTISEVERQNSKSVQWGIKANSFIT193 (Brown,et al., Open J.1mmunol.，2 (3): 111-115 (2012))。
[0053]在一個實施例中，本發(fā)明的抗體包括克隆PVL-1031，PVL-1061, PVL-1101,PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771, PVL-1841, PVL-1881,PBP2a-1631, PBP2a_1721， PBP2a_1941， PBP2a_6G10， PBP2a_17A10， PBP2a_17C8，PBP2a-19Bl,PBP2a-8A5,PBP2a_9C6，PBP2a-PC_2.1，PBP2a-PC_2.2，SPA-A135 和 SPA-4412。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，相同或基本相同的抗體可通過本領(lǐng)域已知的很多方法產(chǎn)生。
[0054]特別地，對本文演示的PVL具有親和力的抗體可被鑒定，例如，通過使用公開抗體的競爭化驗法，特別是那些對PVL具有高親和力的公開抗體即，PVL-1321，PVL-1401和PVL-1841 ο抗體也可以是共享PVL表位結(jié)合區(qū)域的那些抗體。在這方面，這些領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉那些識別抗體中結(jié)合區(qū)域的技術(shù)，包括但不限于Whitelegg和Rees, Marcatili,和 Sivasubramanian 所公開的模式技術(shù)(Protein Engineeringl3 (12):819 - 824 (2000)；MarcatiIi, et al.B1informatics, 24(17):1953 - 1954 (2008) ；and Sivasubramanian, etal..Proteins, 74(2):497 - 514(2009))。
[0055]如本文所用，術(shù)語“抗體”廣義上包括多克隆和單克隆抗體，以及這些抗體的功能性結(jié)合片段。在本發(fā)明中有用的抗體，或它的功能性結(jié)合片段的特征在于，例如，對PVL毒素的表位具有特異性結(jié)合活性。
[0056]就抗體而言，使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合活性”是指抗體的互作，或其功能性結(jié)合片段，與特定表位的相互作用具有一個解離常數(shù)，至少約為IX1-6, 一般至少約I X 10_7，通常至少約I X 10_8，和特別地至少約I X 10_9或I X 10,或更小。就此而言，保留了與PVL的表位特異性結(jié)合的抗體的Fab，F(xiàn)(AB’)2，F(xiàn)d和Fv片段被包括在抗體的定義內(nèi)。
[0057]此外，本文所用的術(shù)語“抗體”包括天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括，例如，單鏈抗體，嵌合抗體，雙功能和人源化抗體，以及它的抗原結(jié)合片段。
[0058]在不同實施例中，PVL, PBP2a和/或SPA的檢測可以組合一種或多種另外的被分析物。例如，本發(fā)明采用的方法和裝置可適于檢測一個或多個腸毒素A(ent A)的，腸毒素B(ent B),毒素休克綜合癥毒素(tstl), α毒素，α溶血素(HLA), β溶血素(HLB),和葡萄球菌激酶(SAK)。
[0059]下列實例被用來進一步說明本發(fā)明的實施例，但不意味著限制本發(fā)明的范圍。雖然這些實例是使用實例中的典范，也可以選擇使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它程序，方法或技術(shù)。
[0060]實施例子
[0061]毒素抗體分析
[0062]圖1A和IB顯示了 PVL的濃度和許多金黃色葡萄球菌菌株(包括MRSA和MSSA)的克隆物的從屬關(guān)系。
[0063]實施例子I
[0064]培養(yǎng)參數(shù)

抬養(yǎng)參數(shù)
[0065]-；--

培養(yǎng)基 Kiito&Noda$M!培養(yǎng)基
培養(yǎng)時聞謂小時
[0066]以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌(產(chǎn)量高水平的，低水平的生產(chǎn)菌株和牛的變體)生長在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)產(chǎn)生PVL。培養(yǎng)物上清液用橫向流測定法檢測(試紙片形式)。如圖2所示，與微芯片測定的結(jié)果幾乎完全一致。在金黃色葡萄球菌菌株NCTC8235上觀察到微弱的假陽性結(jié)果
[0067]實施例子2
[0068]培養(yǎng)參數(shù)

培養(yǎng)參數(shù)
接種物^來η冷庫的--個珠子
[_9]培養(yǎng)堪Kato&Noda_il^il 養(yǎng)描
培養(yǎng)吋則.......................................................................................2小時...........................................................................
[0070]以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌(產(chǎn)量高水平的，低水平的生產(chǎn)菌株和牛的變體)在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時用于檢測，用橫向流PVL試紙檢測PVL的產(chǎn)量。結(jié)果與微芯片測定的結(jié)果幾乎完全一致。
[0071]實施例子3
[0072]培養(yǎng)參數(shù)...........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................mmmm..............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
[0073]小 BtJIf )
WWm五瓊脂培養(yǎng)鎮(zhèn)坊養(yǎng)時_18?24小時
[0074]以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌(高水平的生產(chǎn)菌株，低水平的生產(chǎn)菌株和牛菌株變體，lukM/lukF-P83)被接種到血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接檢測PVL的產(chǎn)量。結(jié)果與微芯片測定的結(jié)果幾乎完全一致。
[0075]實施例子4
[0076]培養(yǎng)參數(shù)

培養(yǎng)參數(shù)
麗物I 過夜培養(yǎng)物，來A圖5中指定的各種生K培養(yǎng)
[0077]培養(yǎng)基--------系列固體生K培養(yǎng)基(瓊脂)
抬養(yǎng)時間18-24小時
[0078]以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌菌株(PVL陽性ST8-MRSA-1V USA300和ST22-MRSA-1V)在不同的固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后被直接檢測PVL的產(chǎn)量。從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接用于橫向流PVL測定(試紙形式)。所有的固體培養(yǎng)基都是陽性結(jié)果O
[0079]實施例子5A
[0080]培養(yǎng)參數(shù)
培養(yǎng)參數(shù)1..........................1iiS..............................................................來__「__1冷__雨的_:________:不■種環(huán)..................................
[0081]培.J1I
[0082]以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌菌株(很多不同克隆物)用MRSA ID顯色瓊脂(B1Merieux)過夜培養(yǎng)后在平板上被直接檢測PVL的產(chǎn)量。從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接用于橫向流PVL測定(試紙形式)。所有克隆物都是陽性結(jié)果。
[0083]實施例子5B
[0084]培養(yǎng)參數(shù)培養(yǎng)基B1Mferieiix MRSA 1011色.?
[0085]---------------------------------------------—
樣品勘備/l:Staphylype_AI緩沖液中的-'

個接種環(huán)培養(yǎng)時間24小時
[0086]以前鑒定的PVL陰性的金黃色葡萄球菌菌株(很多不同克隆的復(fù)合物)用MRSAID顯色瓊脂(B1Merieux)過夜培養(yǎng)后在平板上被直接檢測PVL的產(chǎn)量。從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接用于橫向流動PVL測定(試紙形式)。其結(jié)果與以不同克隆物為陰性對照的微芯片的結(jié)果幾乎完全一致。
[0087]實施例子6
[0088]金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923 (從文化的加藤和野田肉湯上清中純化)產(chǎn)生的一系列PVL毒素稀釋物被用來確定試紙檢測形式的檢測極限?？乖瓭舛葹?0微克/毫升。按手冊中所描述的，不同稀釋物(終濃度)被施加并應(yīng)用到橫向流動PVL檢測(試紙片形式)中。作為參考，用蛋白質(zhì)芯片(ArrayStripTM)的檢出極限被確定為約0.5毫微克/毫升。
[0089]

加入200 μ I試劑A后的終濃度


33.3ng/mL

10ng/mL

Ing/mL

0.1ng/mL

0.0lng/mL

0.0Olng/mL
檢測極限被確定為?I納克/毫升。~
[0090]實施例子7
[0091]來自金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923上清液的未純化的PVL毒素用來確定橫向流PVL測定(浸潰片形式)受Kato和Noda培養(yǎng)基的所有組分影響的檢測極限。不同稀釋物(終濃度)如手冊上描述的那樣被施加并應(yīng)用到橫向流PVL測定(浸潰片形式)上。檢測的檢出限被確定為約I納克/毫升。這些結(jié)果與實施例6相結(jié)合表明Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基的組分似乎不影響測定的檢出極限。
[0092]
PVL濃度(ArrayStrip?檢測)?I5微克/毫升
ToxArray?的檢測極限是約1.5納克/毫升
200微升試劑A的終濃度，用I倍的PBS稀釋。

33.3ng/mL

16.7ng/mL

3.33ng/mL

1.67ng/mL

0.33ng/mL

0.033ng/mL
檢測極限被確定為約I納克/毫升
[0093]實施例子8
[0094]通過凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)菌株作為陰性對照來確定橫向流PVL測定的特異性。在Columbia血瓊脂上和Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)一批CNS菌株。從Columbia血瓊脂以及Kato&Noda上清液直接分離的菌落用橫向流PVL測定(浸潰片形式)進行檢測
[0095]生長在Columbia血瓊脂上的所有CNS菌株的PVL檢測結(jié)果呈陰性。當(dāng)CNS菌株在Kato&Noda中生長，那些在人體中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)的CNS菌株的小種，其PVL檢測結(jié)果呈陰性。
[0096]實施例子9
[0097]此前鑒定的包括高產(chǎn)PVL和低產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌株，PVL陰性的菌株和產(chǎn)生假陽性結(jié)果的菌株(NCTC8325)，在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中生長后，分別劃線接種到Columbia血瓊脂上過夜培養(yǎng)。分離的克隆在葡萄糖肉湯和腦心浸劑肉湯中過夜再培養(yǎng)。每個生長培養(yǎng)基的樣品上清液直接用橫向流PVL檢測(試紙形式)PVL的產(chǎn)量。
[0098]PVL陰性菌株在兩種培養(yǎng)基中仍然保持PVL陰性。在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中呈假陽性的菌株在兩種培養(yǎng)基中PVL是陰性。用兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)高產(chǎn)和低產(chǎn)PVL的菌株的橫向流PVL檢測是陽性。
[0099]實施例子10
[0100]以前鑒定的金黃色葡萄球菌(冷凍庫存珠子)，包括高產(chǎn)PVL和低產(chǎn)PVL的菌株，劃線接種到哥倫比亞血瓊脂過夜。分離的克隆在葡萄糖肉湯與增加了人體血液或Fe++的葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中過夜再培養(yǎng)。同樣的，分離的菌落在Schaedler液體肉湯培養(yǎng)基與增加了人體血液或Fe++的Schaedler肉湯培養(yǎng)基過夜再培養(yǎng)。每種生長培養(yǎng)基的上清液樣品直接用橫向流PVL檢測(試紙形式)PVL的產(chǎn)量。無論是培養(yǎng)基平板還是添加有Fe++的培養(yǎng)基都無PVL產(chǎn)生。然而，添加了人血到兩種培養(yǎng)基中的任意一種都導(dǎo)致PVL的表達
[0101]實施例子11
[0102]設(shè)計一個研究來確定是否鼻腔樣品中的正常細菌群落和分泌物會干擾橫向流PVL的檢測。具體地說，使用Puritan25-3316鼻拭子從具有陽性和陰性的金黃色葡萄球菌的患者上收集鼻樣品。以前鑒定的金黃色葡萄球菌菌株加標(biāo)后(?15CFU)直接進入鼻腔樣品。用該拭子樣品接種Kato&Noda液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)過夜。用橫向流PVL測定(試紙片形式)檢測培養(yǎng)基中的PVL。正常鼻腔菌群并不干預(yù)PVL的檢測。該實驗結(jié)果表明，該試驗具有篩選鼻腔樣品的潛力，并且這些樣品可被培養(yǎng)并用來檢測PVL。
[0103]實施例子12
[0104]為了評估在常規(guī)實驗室條件下使用的潛力，不同的接種時間和生長培養(yǎng)基被檢測。
[0105]金黃色葡萄球菌用下列液體培養(yǎng)基中的一種在36°C搖床上生長3-12小時:葡萄糖肉湯，腦心浸液，或Kato和Noda培養(yǎng)基。用橫向流PVL測定(試紙片形式)過夜培養(yǎng)物中PVL的產(chǎn)量。測定按照提供的手冊進行。200微升檢測試劑移入含有測定軛合物沉淀的反應(yīng)管中。渦旋管子直到測定軛合物(紫色沉淀)被懸浮。加入100微升過夜培養(yǎng)物并晃動管子。試紙插入含有檢測試劑和培養(yǎng)物樣品的反應(yīng)管中。10分鐘后結(jié)果可被讀取。觀察到兩個條帶或線(檢測與對照)被視為陽性結(jié)果。僅觀察到對照線被認為是陰性結(jié)果。
[0106]可選擇使用固體培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌在下列固體生長培養(yǎng)基的一種上36°C過夜生長:瓊脂，Mueller Hinton 瓊脂，MRSA ID? 顯色培養(yǎng)基(B1Merieux), Columbia 血瓊脂，加血的Mueller Hinton瓊脂，C.A.P.瓊脂和“巧克力”瓊脂。生長過夜后挑取分離的克隆并重懸浮在100微升下列緩沖液中的一種:緩沖液Al (來自Alere Staphytype測定)，PBS, or TRIS/EDTA。200微升檢測試劑被移入含有軛合物(紫色的沉淀)的反應(yīng)管。沉淀通過渦旋重懸浮。100微升重懸浮細菌加入反應(yīng)管，通過渦旋混勻?；蛘咛羧∫粋€接種環(huán)的菌落直接溶解在含有200微升檢測試劑的反應(yīng)管中。試紙片放入含有反應(yīng)試劑和檢測樣品的反應(yīng)管中。10分鐘后結(jié)果可讀取。觀察到兩個條帶或線(試驗與對照)被視為陽性結(jié)果。僅觀察到對照線被認為是陰性結(jié)果。PVL濃度大概從1-5納克/毫升開始，大于這個濃度可以被這個測定檢測到。
[0107]實施例子13
[0108]在本實例中，從臨床條件下分離的培養(yǎng)物被檢測，該臨床條件中PVL占合理的比例。分離物來自下面的條件:皮膚膿腫，“蜘蛛咬傷”病變(尤其是慢性/復(fù)發(fā))，癤病(“疔瘡”)，癰，膿腫形成乳腺炎，蜂窩組織炎，以及不尋常的或嚴重的皮膚及軟組織感染，如熱帶性膿皮病或壞死性筋膜炎。分別對金黃色葡萄球菌進行鑒定和藥敏試驗，以及通過分子手段檢測PVL基因并分配到克隆物和菌株。
[0109]231個金黃色葡萄球菌分離物被檢測的，其來自美國、歐洲、澳大利亞、非洲和中東。屬于26個不同金黃色葡萄球菌菌種的123個分離物為PVL陽性。屬于33個金黃色葡萄球菌菌種的108個分離物是PVL陰性。
[0110]橫向流PVL測定(試紙片形式)產(chǎn)生的結(jié)果如下列表I所示(包括重復(fù)試驗)。
[0111]表1:橫向流PVL測定(試紙片形式)結(jié)果
[0112]

真陽性結(jié)果j 124
真陰性結(jié)果1108
假陽性結(jié)果i
假陰性結(jié)果b
靈敏性 100%

特異性 98.18%

陽性預(yù)測值98.41%

陰性預(yù)測值 100%
[0113]橫向流PVL測定(卡片形式)產(chǎn)生的結(jié)果如下列表2所示(包括重復(fù)試驗)。
[0114]表2:橫向流PVL測定(卡片形式)結(jié)果
[0115]

真陽性結(jié)果|23
真陰性結(jié)果假陽性結(jié)果i
假陰性結(jié)果0
靈敏性 100%

特異性 88.89%

陽性預(yù)測值79.31%

陰性預(yù)測值100%
[0116]實施例子14
[0117]一項涉及快速檢測金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中的PVL的研究被執(zhí)行，該研究使用單克隆抗體的橫向流測定。研究的目的是為了評估檢測PVL的橫向流測定。
[0118]如這里所述，PVL是金黃色葡萄球菌噬菌體源的致病因子。它包含2個部件(S和F組分)，由2個雖然共定位、共表達，但獨立的基因編碼。這些分子的聚合物在人類白血球膜上形成孔導(dǎo)致細胞死亡。PVL與慢性/復(fù)發(fā)性皮膚和軟組織感染(SSTI)有關(guān)，尤其是在年輕人和以前健康的成年人中，和壞死性肺炎。由于其臨床相關(guān)性，攜帶PVL基因的金黃色葡萄球菌的檢測具有積極治療和感染控制措施(見萬維網(wǎng)hpa.0rg.uk/webc/HPAwebFiIe/HPAweb_C/1218699411960)o然而，因為PVL檢測是用分子的方法進行，目前該檢測基本上限制于參照中心和專業(yè)實驗室。為了促進快速，非分子的檢測在臨床實驗室中的應(yīng)用，單克隆抗體被培育，橫向流測定被開發(fā)。
[0119]通過噬菌體展示法過量表達的PVL，F(xiàn)組分被用于產(chǎn)生單克隆抗體。接下去免疫小鼠，分離B細胞的mRNA并擴增。得到對抗體的抗原結(jié)合部分特異的cDNA，連接入噬菌體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。得到純化的抗體，通過ELISA初步定性，不同稀釋物在microtiterstrip-mounted蛋白質(zhì)芯片上顯跡。這樣可以快速地確定捕捉和檢測抗體的最佳組合。這些抗體被用來設(shè)計橫向流動測定如，免疫層析測定，在該測定中金標(biāo)檢測抗體與樣品材料(金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物)混合，通過毛細作用向固定了檢測抗體的區(qū)域流動。在陽性情況下，可觀察到一個明顯的線形成。制作兩種不同的測定形式(試紙和Binax卡)平行處理來優(yōu)化操作過程和和條款。這個試驗被用于來自皮膚和軟組織感染的金黃色葡萄球菌分離物，平行的，分離物通過芯片雜交測定基因型，來確定菌株和克隆物的從屬關(guān)系以及它們的PVL狀態(tài)
[0120]圖7描述了 Binax卡片形式的檢測過程。對于試紙片形式，用接種環(huán)挑取培養(yǎng)物并攪拌放入含有標(biāo)記抗體緩沖液的管子中。然后，試紙片放入管子中，10分鐘后結(jié)果可讀取。
[0121]為了選擇捕捉和標(biāo)記抗體的最優(yōu)組合，每一種抗體的4種不同濃度在蛋白芯片上顯跡。這些芯片用重組PVL的F組分，原始PVL(2種不同濃度，來自菌株ATCC25923)或來自獸醫(yī)CC705分離物的“牛殺白細胞素”lukM/lukF-P83以及所有抗體的所有生物素標(biāo)記的制備物來檢測。根據(jù)這些結(jié)果，抗體5和抗體10的組合物被選定來建立檢測PVL(F組分)以及l(fā)ukF-P83基因產(chǎn)物的橫向流測定。
[0122]在最初的一系列的實驗中，檢測在不同的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的已知菌株。如Kato&Noda或Schaedler描述的,在肉湯中，在腦心浸液中以及從普通瓊脂挑取的克隆材料中，具有或不具有血液的Mueller Hinton瓊脂中，MRSA ID瓊月旨(B1Merieux), Columbia血，C.A.P.和“巧克力”瓊脂中被注意到有可檢測的PVL產(chǎn)量。在葡萄糖肉湯上偶爾觀察到假陰性結(jié)果，以及來自Kato&Noda肉湯或血瓊脂的克隆物CC8菌株的假陽性結(jié)果。這些橫向流測定用于篩選來自SSTI診斷標(biāo)本中的共計450個臨床分離物。這些菌株源于澳大利亞，特立尼達和多巴哥，美國，英國，德國，瑞典，西班牙，挪威，日本，烏干達和沙特阿拉伯。258株被證明是陽性。它們所屬的分離物屬于20個克隆物的37個不同的菌株。已檢測了192PVL陰性分離物屬于29克隆物的47個不同的菌株。PVL陽性分離物的比例在被檢測的全部SST I分離物中占10.5% (瑞典樣品)到81.4% (澳大利亞樣品)。
[0123]該檢測允許PVL快速檢測在不能夠進行分子檢測的常規(guī)細菌學(xué)實驗室條件下進行。因為它利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的過夜純培養(yǎng)(包括顯色瓊脂篩選MRSA)，可以很容易地與這樣的實驗室的工作流程相結(jié)合。因此，預(yù)計將有助于及時干預(yù)治療PVL相關(guān)感染病例，以及幫助選取一些分離物遞交參考中心進一步分型。
[0124]實施例子15
[0125]用篩選測定對使用PBP2a結(jié)合抗體的PBP2a檢測進行評估，PBP2a結(jié)合抗體通過這里所討論的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生。一系列來自金黃色葡萄球菌USA300的稀釋過的PBP2a被用于檢測評估。很多克隆物(數(shù)據(jù)未顯示)具有陽性結(jié)果。
[0126]實施例子16
[0127]此前鑒定的金黃色葡萄球菌(很多不同的克隆物)用本發(fā)明的抗體檢測PBP2a和SPA產(chǎn)量。很多克隆物(數(shù)據(jù)未顯示)具有陽性結(jié)果。
[0128]實施例子17
[0129]此前鑒定的金黃色葡萄球菌(很多不同的克隆物)用本發(fā)明的抗體檢測PVL，PBP2a和SPA產(chǎn)量。很多克隆物(數(shù)據(jù)未顯示)具有陽性結(jié)果。
[0130]實施例子18
[0131]這個實例描述了橫向流檢測法的發(fā)展，使用這里所述的單克隆抗體在常規(guī)臨床微生物實驗室建立快速，非分子的PVL檢測。該測定對生長在各種不同培養(yǎng)基的分離物進行了驗證，然后利用從SSTI重新獲得的國際金黃色葡萄球菌對檢測進行評估。
[0132]為了開發(fā)快速的表型測定，通過噬菌體展示法，重組PVL的F組分被用于產(chǎn)生單克隆抗體。在蛋白芯片上顯跡，用不同的IukF制備物和測定抗體篩選這些抗體。這樣就鑒定出了用于建立橫向流測定的最優(yōu)抗體組合。這個試驗被用來檢測金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中的PVL。對純化的天然和重組抗原的檢測極限被確定為約I納克/毫升。各種固體和液體培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物都適用于PVL檢測。
[0133]600個被測定的菌株和臨床分離物來自美國、歐洲、澳大利亞，非洲和中東的患者。平行的分離物通過DNA芯片雜交確定基因型來證實PVL類型并被轉(zhuǎn)移到克隆表達中。這個試驗中測定的靈敏性，特異性，陽性和陰性預(yù)測值分別是99.7%，98.3%，98.4%和99.7%。302個臨床分離物和參考菌株是PVL陽性并被歸屬到21個不同的克隆物。
[0134]總的來說，橫向流檢測允許在常規(guī)細菌學(xué)實驗室進行快速的經(jīng)濟的PVL檢測。因為檢測利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，不需要高級設(shè)備，可以簡單的整合到實驗室的工作流程中，有助于及時治療PVL相關(guān)感染病例。
[0135]下面為所用的材料和方法
[0136]重組PVL，F(xiàn)組分
[0137]PVL F組分基因(IukF-PV)用在5’和3’端包含一個EcoRl酶切位點和Notl酶切位點的設(shè)計引物(lukF-PV_fw_5Eco, CCTGAATTCATGAAAAAAATAGTCAAATC(SEQ ID NO: 13)和lukF-PV_rev_5Not, ATAGCGGCCGCTTAGCTCATAGGATTTT(SEQ ID NO:14))進行擴增。來自全測序ST1-MRSA-1V參考菌株麗2的DNA作為模板。PCR產(chǎn)物被克隆到一個市售載體(Τ0Ρ0
II,Invitrogen, Karlsruhe,德國)上并測序。得到的序列與GenBank登記的相應(yīng)序列比較(BA000033.2 ； 1529381:153035)。確認的克隆用EcoRl/Notl酶切，包含開放性讀碼框的DNA片段被插入pet28a表達載體(Novagen, Darmstadt,德國)連接后，表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21.用50毫升異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1毫摩爾)誘導(dǎo)后，在50毫升LB培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基，添加了卡那霉素)獲得表達重組蛋白。離心收集大腸桿菌細胞并冰凍過夜。表達重組蛋白在鎳-次氮基三乙酸-瓊脂糖(N1-NTA-瓊脂糖)柱(Qiagen, Hamburg,德國)上按照生產(chǎn)商家的說明書純化。每個步驟取出部分試樣通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組蛋白的存在。每一個樣品中的蛋白質(zhì)濃度用二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce公司，波恩,德國)測定。
[0138]噬菌體展示過程和抗體的初測定
[0139]通過噬菌體展示法過表達的PVL F組分被用于產(chǎn)生單克隆抗體。接下去免疫小鼠，分離擴增B-細胞的mRNA。獲得對抗體的抗原結(jié)合部分特異的cDNA，被連入噬菌體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。獲得的抗體被純化，通過ELISA初鑒定，不同的稀釋物在microtiterstrip-mounted 蛋白芯片顯跡。
[0140]根據(jù)此前描述的手冊使用抗體芯片。
[0141]為了選擇捕捉和標(biāo)記抗體的最優(yōu)組合，每一個選定的11種抗體中的5個不同濃度被點樣到蛋白芯片上。為了測定所有可能的組合，這些芯片用重組PVL F組分，天然的PVL (2種不同濃度，來自CC30-MSSA菌株ATCC25923)或“牛殺白細胞素”lukM/lukF_P83 (來自獸用CC151/705分離物)作為抗原，以及用生物素標(biāo)記的所有11種抗體的制備物作為檢測抗體來測定。然后通過鏈霉親和素-辣根過氧化物酶軛合物和通過過氧化物酶引發(fā)的染料沉淀來進行染色。
[0142]這個途徑能確定捕捉檢測抗體的最優(yōu)組合(見圖3).
[0143]橫向流測定PVL的原理
[0144]檢測金黃色葡萄球菌初代培養(yǎng)中PVL的橫向流測定是免疫層析膜測定，該測定用上述芯片選定的2個高靈敏性的噬菌體展示重組單克隆抗體。針對PVL的2個選定抗體被用于設(shè)計橫向流測定，其中一個抗體在檢測試紙上作為捕獲抗原，而第二種抗體在反應(yīng)管內(nèi)被金標(biāo)記并包被。測定試紙由固定在膜支撐物上的PVL捕獲抗體和對照蛋白組成，加樣品和吸收劑后形成兩條明顯的線。T執(zhí)行檢測時，金黃色葡萄球菌分離物或培養(yǎng)物上清液被加到包被的反應(yīng)管中，反應(yīng)管含有與已添加的萃取劑共軛的金標(biāo)。然后PVL檢測試紙條被放入反應(yīng)管支持液體樣品和軛合物。10分鐘后根據(jù)粉色到紫色樣品線的存在或不存在對檢測的結(jié)果進行解釋。兩條帶(PVL線和對照線)說明是有效的陽性結(jié)果，而一條線(對照線)說明有效的陰性結(jié)果。沒有明顯的對照線說明這是無效的檢測。
[0145]測定的執(zhí)行
[0146]對來自SSTI (見下文)的金黃色葡萄球菌的分離物進行檢測，該菌通過芯片雜交檢測基因型來確定菌株和克隆物的從屬關(guān)系和PVL狀態(tài)。280微升萃取劑被特異的加入含有凍干抗體-金軛合物的包被反應(yīng)管內(nèi)。挑取一個接種環(huán)的金黃色葡萄球菌克隆材料，放入管子，用接種環(huán)徹底混合直到細胞和軛合物沉淀全部溶解。使用液體培養(yǎng)基時，200微升緩沖液和100微升過夜液體培養(yǎng)物被加入反應(yīng)管并混合。然后檢測試紙被插入反應(yīng)管，在室溫下培養(yǎng)10分鐘后，檢測試紙離開管子并進行讀取。
[0147]菌株和分離物
[0148]檢測共計600個金黃色葡萄球菌菌株和分離物的IukF-PV產(chǎn)量，同時包括甲氧西林敏感(MSSA)和抗加氧西林(MRSA)的金黃色葡萄球菌。
[0149]PVL 陰性參考菌株是 Sanger MSSA476(測過序的 STl-MSSA-SCC/us, GenBank 檢索號 BX571857.1)，Mu50 和 N315 (同時測過序的 ST5-MRSA-1I，GenBank BA000017.4 和ΒΑ000018.3)，NCTC8325(測過序的 ST8-MSSA, GenBank CP000253.1)，COL (測過序的 CC8/ST250-MRSA-1, GenBank CP000046.1)以及澳大利亞(WA)MRSA_8 (ST75-MRSA-1V03-17848 ;(23))和 WA-MRSA-59 (具有非典型 SCCmec 元件的 CC12-MRSA)。
[0150]PVL 陽性參考菌株是 MW2-USA400 (測過序的 STl-MRSA-1V, GenBankBA000033.2)，USA300-FPR3757 (測過序的 ST8-MRSA-1 V，GenBankCP000255.1)，ATCC25923 (以質(zhì)量控制為目的廣泛用于診斷生物學(xué)的著名分離物ST30-MSSA),昆士蘭 caMRSA(ST93-MRSA-1V03-16790)和 WA-MRSA-60/ 孟加拉海灣caMRSA(ST772-MRSA-V)。
[0151]另外，包括從具有SSTI的患者上收集到的588個臨床分離物。
[0152]源自澳大利亞的臨床分離物(作為全國性的澳大利亞集團金黃色葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測項目SAP2008and SAP2010的部分)可在萬維網(wǎng)www.agar group, org/files/FED% 20REP0RT% 20SAP2008% 20MRSA% 20final.pdf 和 www.agar group.0rg/files/FED %20REP0RT% 20SAP210% 20MRSA% 20FINAL% 20shrink.pdf 上獲得。
[0153]更多的臨床分離物來自德國的診斷實驗室(Dresden大學(xué)醫(yī)院)，沙特阿拉伯(法赫德國王醫(yī)學(xué)城，利雅得)，西班牙(Hospital Universitari Germans, Trias i Pujol,巴達洛納)，瑞典(OerebiX)大學(xué)附屬醫(yī)院)，特立尼達和多巴哥共和國(從全國各地區(qū)醫(yī)院)，烏干達(在恩德培的醫(yī)學(xué)研究理事會)和英國(包括在布里斯托爾西南部的一個醫(yī)院，和國家葡萄球菌參考單位，HPA，倫敦)。所有來自英格蘭的分離物和來自其他國家(8個來自沙特阿拉伯，7個來自德國，3個來自澳大利亞)分離物的PVL狀態(tài)是已知的。這些菌株被包括是為了最大限度地代表廣泛的克隆物范圍，在對來源于不同的國家的PVL進行概率分析時，這些菌株被排除在外。
[0154]另外，檢測17個分離物的LukF-P83 ;包括屬于家畜相關(guān)菌系CC133，CC151/705和CC479的獸醫(yī)來源(牛和羊)的P83陽性分離物。這些分離物來自以前的研究或參考弗里德里希洛弗勒研究所，德國耶拿。作為對照，3個lukM/lukF-P83陰性分離物被包括:2個CC133分離物，一個來自疣鼻天鵝，一個是來自Dresden大學(xué)醫(yī)院的人類分離物和來自牛的CC479分離物。沒有l(wèi)ukF-P83陰性CC151/705分離物可用于檢測。
[0155]用不同培養(yǎng)基驗證橫向流動測定
[0156]液體培養(yǎng)基包括葡萄糖肉湯(0X0ID，目錄為Nr.CM67加葡萄糖)，腦心浸液(0X0ID, CM225)，2XTY(胰蛋白胨/酵母提取物)，Schaedler肉湯+維生素K3 (梅里埃，42106)和Kato和Noda所描述的肉湯
[0157]接下去所用的固體培養(yǎng)基為:普通瓊脂(0X0ID，CM3),加血與不加血的MuellerHinton瓊脂(0X0ID，CM337)，哥倫比亞血瓊脂(瓊脂主要成分0X0ID，CM331和羊血0X0ID，F(xiàn)SR1055)，C AP瓊脂，“巧克力”瓊脂(瓊脂基礎(chǔ)0X0ID, CM331和羊血0X0ID FSR1055加血晶素，賽瓦，24410，和NAD，默克，1.024542)和市售葡萄球菌MRSA顯色培養(yǎng)基(MRSA ID瓊月旨，b1Merieux, 43459)。
[0158]芯片程序
[0159]為了確認PVL狀態(tài)并分配給相應(yīng)的克隆物和菌株，所用分離物用DNA芯片雜交定性。根據(jù)生產(chǎn)商家的說明執(zhí)行程序；引物、標(biāo)記和進一步的細節(jié)同上所述。
[0160]酶裂解后簡單的制備DNA。多重引物延伸來擴增和標(biāo)記(通過混合生物素-16-dUTP)大概對應(yīng)170個基因的共計333條靶序列。單鏈擴增產(chǎn)物與具有相應(yīng)探針的芯片進行雜交。添加了能結(jié)合生物素標(biāo)記的鏈霉親和辣根過氧化物酶結(jié)合物，并用過氧化物酶-引發(fā)染料沉淀，使雜交可視化。對由此產(chǎn)生的芯片上的斑點圖案進行掃描，分析，與此前模式菌株的參考數(shù)據(jù)相比較。在補充文件中提供了所有菌株和分離株的全雜交圖。
[0161]獲得下列試驗結(jié)果
[0162]抗體篩選
[0163]根據(jù)圖3顯示的篩選結(jié)果，抗體1401(這里也指PVL-1401)和抗體1841(這里也指PVL-1841)的組合被選定來建立能檢測PVL(F組分)以及l(fā)ukF_P83基因產(chǎn)物的橫向流測定。通過一些稀釋，確定橫向流測定對純化的天然和重組抗原的檢測極限約為I納克/毫升。
[0164]對不同生長培養(yǎng)基的橫向流檢測試驗
[0165]在最初的一系列實驗中,檢測在不同生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)的已知菌株。培養(yǎng)PVL陰性 Mu50 (ST5-MRSA-1I)，NCTC8523 (ST8-MSSA)，ST398-MRSA-V 和 ST8-MSSA 的已知菌株以及PVL 陽性的 USA300-FPR3757 (ST8-MRSA-1V，USA300)，CC30-MSSA 和 ST93-MRSA-1V (昆士蘭克隆)分離物的液體生長培養(yǎng)基中(葡萄糖肉湯，腦心浸液，2XTY，Schaedler, Kato&Noda)被檢測。PVL陰性ST8-MSSA菌株NCTC8325在Kato&Noda所描述的生長培養(yǎng)基中具有微弱但一致的假陽性結(jié)果。用ST8-MSSA相同表型的臨床分離菌株沒有觀察到相同情況。所有其他的結(jié)果是正確的。
[0166]從產(chǎn)生正確陽性結(jié)果的普通瓊脂,無血和有血Mueller Hinton瓊脂,哥倫比亞血，C.A.P和“巧克力”瓊脂上挑取克隆材料(USA300-FPR3757和PVL陽性的ST22-MRSA-1V)。然后從哥倫比亞血瓊脂的過夜培養(yǎng)菌落篩選臨床分離株(見下文)。
[0167]除了前述的生長培養(yǎng)基，對市售的用于檢測MRSA的發(fā)光培養(yǎng)基進行了測試(MRSAID瓊脂來自梅里埃公司)。對以下的PVL陽性菌株進行了測試，并取得了正確的結(jié)果:CC1-MRSA-1V(MW2, USA400)，CC5-MRSA-1V,ST8-MRSA-1V (USA300-FPR3757)，ST22-MRSA-1V,ST30-MRSA-四(西南太平洋克隆)，ST59/ST952-MRSA-V (T)(臺灣克隆)，CC80-MRSA-1V (歐洲 caMRSA 克隆)，CC88-MRSA-1V 和 CC152-MRSA-V。PVL 陰性菌株 CC1-MRSA-1V&SCC/us(WA-MRSA-1/45), ST22-MRSA-1V(UK-EMRSA-15/Barnim), ST45-MRSA-1V(柏林 EMRSA)，ST75-MRSA-1V (WA-MRSA-8)，ST239-MRSA-1II (維也納 / 匈牙利 / 巴西流行株)，以及在 MRSAID瓊脂上產(chǎn)生準(zhǔn)確(陰性)結(jié)果的CC80-MRSA-1V的一個PVL陰性變體。
[0168]LukF_P83 的檢測
[0169]14個lukF-P83陽性分離物(2個CC133，4個CC479和8個CC151)在橫向流測定中產(chǎn)生陽性結(jié)果。3個lukF-P83陰性分離物(2個CC133和I個CC479)被正確的鑒定為陰性。
[0170]用橫向流測定和芯片篩選臨床分離物
[0171]與芯片的基因分型數(shù)據(jù)比較時，301個實驗是真陽性，293個是真陰性；有5個假陽性，和I個假陰性。這相當(dāng)于靈敏性99.7%,特異性98.3%, PPV98.4 %和NPV99.7 %。隨后對這六個錯誤結(jié)果的實驗進行重復(fù)并取得正確的結(jié)果，這說明在初級測定時操作錯誤。
[0172]總的來說，297個檢定分離物和5個參考菌株是PVL陽性。通過芯片雜交，它們被分配到 21 個克隆物中，CCl (包括 ST772)，CC5, CC8 (包括 ST72)，CC15, CC22, CC25, CC30, CC45，CC49, CC59, CC80, CC88, CC93, CC96, CC121, CC152, CC188, CC398 和 3 個未鑒定的菌系(圖13)。它們中的一個產(chǎn)生 1-141-1-1-128-3 的 MLST (與 STsl279/1496/1982 有關(guān))。最常分離到的PVL陽性菌系是CC12 (來自不同區(qū)域的50個分離物，都是MSSA)，CC8 (46個分離物包括來自特立尼達島和多巴哥島的MSSA，以及來自各區(qū)域的“US300” )和CC93 (42個分離物，MSSA和ST93-MRSA-1V，昆士蘭caMRSA克隆，幾乎全部來自澳大利亞)。287個PVL陰性檢測分離物和7個參考菌株屬于31個不同克隆物:CC1，CC5, CC6, CC7, CC8 (包括ST72和ST239)，CC9 (ST834)，CC12, CC15, CC20, CC22, CC25, CC30 (包括 ST34)，CC45, CC50, CC59, CC75,CC80, CC88, CC96, CC97, CC101, CC121, CC140, CC188, CC398, CC425, CC509, CC707 和 CC1021.一個CC不能分派2個分離物。
[0173]陽性金黃色葡萄球菌在不同國家的流行
[0174]在所有SSTI的分離物中流行的PVL陽性分離物在不同國家之間存在廣泛的變化。在澳大利亞的樣品中觀察到的PVL陽性率最高，有82.2% (90中的72)為PVL陽性。PVL陽性菌株的一半(74個中的37個)是CC93，并且其中大部分是MRSA (37個CC93分離物的29個，78% )，這反映了目前所謂的昆士蘭caMRSA克隆所造成的負擔(dān)。第2位和第3位常在澳大利亞被分離到的PVL陽性克隆是CC121-MSSA(N = 15)和CC93_MSSA(N = 8)。僅有兩個ST8-MRSA-1V(USA300)菌株被鑒定。PVL陰性金黃色葡萄球菌菌株分別來自多個CC菌系，包括 CCl, CC5, CC8, CC8/ST72, CC15, CC22, CC30, CC45, CC88 和 CC188，包括兩個 MRSA 克??；ST22-MRSA-1V(UK-EMRSA-15/Barnim EMRSA)和 ST5-MRSA-1V (小兒克隆/WA-MRSA-65)。
[0175]來自德國的SSTI分離物中，有PVL概率是40 % (50個中20個)。最常見的菌株是 CCl21-MSSA (η = 7)和 CC30-MSSA (η = 4)。每一個 ST8-MRSA-1V (USA300)和ST93-MRSA-1V (昆士蘭caMRSA克隆)分離物都被鑒定，后者與傳播到澳大利亞有關(guān)。在PVL陰性之中，CC30和CC8是最常被分離到的；其他CC包括CC5，CC7, CC8/ST72, CC15, CC22, CC45,CClOl 和 CC398。 屬于 CC7-MRSA-1V, CC22-MRSA-1V(UK-EMRSA-15/BarnimEMRSA)，ST5/ST225-MRSA-1I(UK-EMRSA-3/Rhine-Hesse EMRSA)和CC45-MRSA-1V (柏林EMRSA)的PVL陰性的MRSA單菌落被鑒定。
[0176]對于來自沙特阿拉伯的分離物，47.3%被證實是PVL陽性。大約一半是MRSA (η =13)，該MRSA具有屬于CC80-MRSA-1V (歐洲caMRSA克隆)的最常見的PVL陽性單克隆。最常見的分離物PVL-MSSA克隆是CC30-MSSA(n = 4)和還未被鑒定的MSSA (η = 3)。PVL陰性菌株屬于 CCl, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9/ST834, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC75 (與 ST1667有關(guān))，CC80, CC96, CC97, CC398 (ST291/813)，和一個未鑒定菌系。MRSA 的比例高(29 個 PVL陰性中8個是MRSA);最常見的菌株是ST239-MRSA-1II (維也納/匈牙利/巴西克隆，η =4)。其他MRSA屬于CC22-MRSA-1V的tstl-陽性變種，CC80-MRSA-1V的PVL陰性變種，僅知道來自馬耳他(27)的 CC5-MRSA-1V&SCC/us 菌株和 CC9/ST834-MRSA-VI。
[0177]第二高的PVL概率被發(fā)現(xiàn)在西班牙，具有75% (44個中33個)的PVL基因和分泌LukF-PV蛋白陽性。這里最常見的克隆是ST8-MRSA-1V(USA300)的ACME陰性變種，有10個分離物被分配給該變種。接著是CC30-MSSA(n = 6)和CC22_MSSA(n = 5)。PVL陰性屬于各種各樣的 CC (CC5, CC8/ST72, CC15, CC30, CC45, CC121, CC188 和 CC707)，不包括任何 MRSA。
[0178]最低的PVL流行率在瑞典分離物中被發(fā)現(xiàn)，僅16.7% (114個中19個)是PVL陽性，都是 MSSA0 最常見的 PVL 陽性菌株是 CC30-MSSA(n = 4)和 CCl21-MSSA (η = 3)。PVL陰性分離物是 CCl, CC5, CC7, CC8, CC12, CC15, CC20, CC22, CC30, CC45, CC50, CC88, CC97, CClOI, CC121, CC188, CC509and CC1021。CC45 (η = 19)和 CC15(n= 18)是最常見的 CC 分離物。MRSA沒有被發(fā)現(xiàn)。
[0179]在特立尼達島和多巴哥島共和國，PVL流行率是50% (80個中40個分離物)。最豐富的PVL陽性菌株是CC8-MSSA(n = 18)，該菌株另外攜帶腸毒素基因sed，sej, ser, sek和seq。兩個CC8-MRSA-1V分離物被鑒定為具有相同的毒素屬性，但缺乏ACME，因此與WA-MRSA-62類似。ST8-MRSA-1V (USA300)，即攜帶ACME位點和腸毒素基因sek和seq，在三種情況下被鑒定。其他分離到的常見的PVL陽性菌株是CC30-MSSA(n= 10)和CC5_MSSA(n=5)。PVL 陰性分離物包括 CCl, CC6, CC7, CC8, CC8/ST72, CC8/ST239, CC12, CC15, CC45, CC59，CC101, CC121, CC188 和與 CC75 (ST1223, ST1667)有關(guān)的不尋常菌株。PVL 陰性 MRSA 菌株是 CC59-MRSA-V&SCC/us 和 ST239-MRSA-1II (維也納 / 匈牙利 / 巴西克隆)。
[0180]與來自其他國家的收集菌株相對應(yīng)的，英國的分離物的PVL狀態(tài)是已知的，因此其PVL率不能與其他國家的進行比較。很多不同的PVL-MRSA菌株在倫敦的分離物中被鑒定出，CC30-MRSA-1V (西南太平洋caMRSA克隆)，CC5-MRSA-1V (小兒克隆)，CC5-MRSA-V, CC80-MRSA-1V (歐洲 caMRSA 克隆)，ST59/ST952-MRSA-V (T)(臺灣 caMRSA克隆)，ST772-MRSA-V (孟加拉海灣 caMRSA 克隆 /WA-MRSA-60)，ST8-MRSA-1V (USA300)和ST93-MRSA-1V(昆士蘭 caMRSA 克隆)。PVL 陰性分離物屬于 CCl, CC8, CC8/ST239, CC12, CC22，CC25, CC30, CC45, CC59, CC121, CC425 包括 MRSA 菌株 CCl-MRSA-1V (WA-MRSA-1/57)，ST239-MRSA-1II (維也納 / 匈牙利 / 巴西克隆)，CC22-MRSA-1V (UK-EMRSA-15/Barnim EMRSA)和ST59-MRSA-V。進一步包括來自英國西南部第二中心的已知為PVL陽性的28個分離物。這些分離物被排除在PVL概率分析之外，但他們的種群結(jié)構(gòu)是值得注意的。這個組僅包括 2 個 PVL 陽性 MRSA，ST772-MRSA-V (孟加拉海灣 caMRSA 克隆 /WA-MRSA-60) andCC1-MRSA-1V (USA400)。也包括一個 CC59-MSSA可能是 ST59/ST952-MRSA-V (T)(臺灣 caMRSA克隆)的SCCmec檢測突變體,根據(jù)抗性基因和毒性標(biāo)記(erm(B), apha3, sat, tet (K), cat,fexA, seb/k/q, lukF/S-PV)的雜交屬性。這個組中最常見的菌株是PVL陽性CC22_MSSA(n=10)。另外5個具有SPA類型t417或tl601的PVL陽性CC22分離物攜帶“SCCfus”組件(ccrA/B-1，and Q6⑶50，or fusC)。這些分離物來自平均年齡接近94歲的患者。這在PVL陽性中是不尋常的發(fā)現(xiàn)，這說明這個克隆物與這個區(qū)域護理設(shè)備間的可能聯(lián)系。PVL是金黃色葡萄球菌獨特的毒力標(biāo)志，與臨床癥狀的關(guān)聯(lián)非常普遍，這些癥狀往往要么慢性/反復(fù)發(fā)作，或偶爾進展迅速而危及生命。因此PVL的診斷檢測能滿足目標(biāo)患者的管理的需要。這里所述的橫向流測定允許在不能輕易進行分子測定的常規(guī)細菌學(xué)實驗室中進行PVL快速檢測。當(dāng)利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物時，例如Columbia血瓊脂，這樣就能輕易的整合入常規(guī)診斷實驗室的工作流程中。因此測定可能有助于及時干預(yù)PVL相關(guān)感染病例，也能幫助選擇一些需要遞交參考中心進一步分型的菌株。金黃色葡萄球菌體外分泌的PVL有廣泛的變化，然而基因型和表型間的高度一致說明lukS/F-PV陽性菌株在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基條件下通常能表達可檢測數(shù)量的PVL。在這個研究中沒有鑒定到含有PVL基因卻不產(chǎn)生體外毒素的分離物。由于缺少體外表達造成假陰性的可能性是很低的。這個研究中所包括的PVL和lukM/lukF-P83陽性菌株的多樣性說明，可能的PVL序列特異變體菌系不會對PVL檢測造成障礙，PVL檢測使用這里所述的抗體。這里描述的菌株收集物進一步提供了與SSTI相關(guān)的金黃色葡萄球菌的分子流行病學(xué)的快照。在PVL陽性甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌中，CC121(總計50個分離物)和CC30(35個分離物)占主導(dǎo)地位。在特立尼達和多巴哥共和國中PVL陽性CC8-MSSA是非常豐富的，雖然這個菌株在其他地方罕見。這印證了USA300菌株在加勒比海/拉丁美洲地區(qū)出現(xiàn)的假說。這個研究還顯示了 MRSA在世界的不同部分造成了嚴重的問題。MRSA(在這個研究中)流行率低或沒的國家是瑞典和烏干達，瑞典在MRSA感染控制是具有非常嚴格的政策，烏干達在醫(yī)療保健和獸醫(yī)中使用抗生素對金黃色葡萄球菌的選擇壓力比其他國家有更多的限制。在別的地方，由PVL陽性/ACME陽性 ST8-MRSA-1V (USA300)，PVL 陽性 /ACME 陰性 ST8-MRSA-1V, PVL 陽性 ST80-MRSA-1V (歐洲 caMRSA 克隆)和 ST93-MRSA-1V(昆士蘭 caMRSA 克隆)和 PVL 陰性 ST239-MRSA-1II 主導(dǎo)的MRSA經(jīng)常被分離到。橫向流測定與MRSA顯色篩選培養(yǎng)基相結(jié)合的可能性促進了新興的PVL陽性caMRSA菌株的快速篩選。這有助于捕獲它們的傳播和進一步的擴散。在澳大利亞和西班牙分離物中PVL陽性的高百分率以及ST93-MRSA-1V(昆士蘭caMRSA克隆)和ST8-MRSA-1V在這兩個國家的主導(dǎo)優(yōu)勢說明，是以建立PVL陽性MSSA種群為代價外，PVL陽性caMRSA的擴展沒有發(fā)生。除了限制內(nèi)酰胺的功效作為主要的治療選擇，PVL陽性caMRSA的出現(xiàn)可能因此導(dǎo)致PVL疾病相關(guān)的負擔(dān)增加。雖然在當(dāng)前研究中分離物的數(shù)量不足以明白的證明這樣的趨勢，還需進行關(guān)于PVL陽性金黃色葡萄球菌的分子流行學(xué)的進一步研究。
[0181]這里所述的發(fā)明可以在缺少未具體公開的任何要素或多個要素，一個或多個限制的情況下實施。所采用的術(shù)語或表達被用作描述術(shù)語而不是限制，并且，這里也沒有任何意圖在使用本發(fā)明的術(shù)語和解釋的時候，并沒有排除那些與本發(fā)明描述的特征等同的例子，但是，可以認識到，很多基于本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的改動也是可能的。以你，可以理解，盡管本發(fā)明機遇很多的實施例子進行了揭示和描述，基于發(fā)明描述的精髓進行改進或改變是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以進行的，這樣的改變和活便也被認為是屬于本發(fā)明哪些從屬權(quán)利要求所限定的范圍。
[0182]本發(fā)明說明書中提到的所有文章、專利和專利申請，和所有其他文獻和電子信息和雜志的全部或部分作為本發(fā)明的一部分作為參考。這里所引用的所有專利和出版物都被同樣列在參考文獻中，跟每一個出版物具體的單獨被參考引用一樣。 申請人:保留物理上的上述文章、專利、專利申請或其他文獻與本申請說明書結(jié)合的權(quán)利。
[0183]這里采用的術(shù)語和表達方式所為描述方式，而不受其限制，這里也沒有任何意圖來指明此書描述的這些術(shù)語和解釋排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本發(fā)明和權(quán)利要求的范圍內(nèi)做任何合適的改變或修改?？梢岳斫猓景l(fā)明所描述的實施例子都是一些優(yōu)選的實施例子和特點，任何本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都可以根據(jù)本發(fā)明描述的精髓下做一些更改和變化，這些更改和變化也被認為屬于本發(fā)明的范圍和獨立權(quán)利要求以及附屬權(quán)利要求所限制的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測樣品中生物分子的方法，包括: a)讓樣本與抗體或抗體的功能片段接觸并形成軛合物，該抗體特異結(jié)合選自以下一個或多個基因的表達產(chǎn)物:IukS-PV, IukF-PV, IukM, lukF-P83, mecA,和 spa ； b)檢測軛合物，從而檢測所述的毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中抗體或抗體的功能片段是PVL-1841的克隆，PVL-1321的克隆，或PVL-1401的克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，樣本與抗體或抗體片段接觸，所述的抗體或抗體的功能片段為PVL-1841克隆，PVL-1321克隆，和PVL-1401克隆中的至少兩個克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，抗體或抗體片段從下列中進行選擇:PVL-1031，PVL-1061,PVL-1101, PVL-1321,PVL-1401, PVL-1451,PVL-1631,PVL-1711,PVL-1771, PVL-1841，PVL-1881, PBP2a_1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10,PBP2a-17C8, PBP2a-19Bl, PBP2a_8A5, PBP2a_9C6, PBP2a-pc_2.1, PBP2a-pc_2.2，SPA-A135,和SPA-4412。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，抗體或抗體片段為下列PVL-1031，PVL-1061，PVL-1101, PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771, PVL-1841, PVL-188I,PBP2a-1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10, PBP2a_17C8, PBP2a_19BI, PBP2a-8A5, PBP2a_9C6, PBP2a-pc_2.1, PBP2a-pc_2.2，SPA-A135,和 SPA-4412 中的至少選擇兩個。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的功能結(jié)合片段選自抗體或抗體片段從下列Fab, F (ab’) 2，F(xiàn)d, Fv或者它們的組合進行選擇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的抗體與可被檢測的標(biāo)記物軛合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述的標(biāo)記物為金屬顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述的金屬為金。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的樣本包括預(yù)培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的細胞中的表達產(chǎn)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基為液體或固態(tài)培養(yǎng)基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法進一步包括讓樣本與抗體或抗體的功能片段接觸，其中所述的抗體或功能片段特異結(jié)合PVL，PBP2a，或A蛋白或者它們的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)在免疫檢測裝置或微陣列上進行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的免疫檢測裝置為橫向流動免疫檢測裝置。
15.抗體或抗體的功能結(jié)合片段，該抗體或功能結(jié)合片段特異結(jié)合IukS-PV,IukF-PV,IukM, lukF-P83, mecA,和spa基因中的一個或多個基因的表達產(chǎn)物，其中所述的抗體選自于 PVL-1031, PVL-1061, PVL-1101, PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771, PVL-1841, PVL-1881, PBP2a_1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10, PBP2a-17C8, PBP2a_19Bl, PBP2a_8A5, PBP2a_9C6, PBP2a-pc_2.1, PBP2a-pc_2.2，SPA-A135,和 SPA-441216。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述的功能結(jié)合片段從？&13，？(&13’)2，？(^\或它們的組合中進行選擇。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，所述的抗體或者功能結(jié)合片段與可被檢測的標(biāo)記物軛合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，所述的可被檢測的標(biāo)記物為金屬顆粒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體，所述的金屬為金。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述的抗體或功能結(jié)合片段被下列核酸序列SEQ ID NOs: 1,3，5，7，9 或 11 所克隆。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其中所述的抗體或功能結(jié)合片段包括SEQIDNOs: 2，4，6，8，10或12的氨基酸序列。
22.檢測樣本中生物分子的檢測裝置，該裝置包括如權(quán)利要求15所述的抗體或功能結(jié)合片段。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，其中該裝置被設(shè)置為微列陣或橫向流動試劑盒。
24.用于檢測樣本中生物分子的盒子，該盒子包括如權(quán)利要求15所述的抗體或功能結(jié)合片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的盒子，進一步包括一個或多個試劑和說明書。
26.用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，包括通過讓樣本接觸如權(quán)利要求15所述的抗體來形成抗體軛合物,從而檢測IukS-PV, IukF-PV, IukM, lukF-P83, mecA,和spa基因中的一個或多個基因的表達闡述的水平；和檢測所述的軛合物。
27.抗體或抗體的工能結(jié)合片段,其中該抗體或其功能結(jié)合片段特異結(jié)合IukS-PV,IukF-PV, IukM, lukF-P83, mecA,和spa基因中的一個或多個基因的表達產(chǎn)物或它們的肽鏈，其中所述的抗體與權(quán)利要求20-21所述的結(jié)合所述表達產(chǎn)物的抗體競爭。
【文檔編號】G01N33/53GK104185790SQ201280055383
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月11日
【發(fā)明者】R·易瑞特, S·莫列克, J·J·瑞嘉麥, J·布魯且爾 申請人:美艾利爾圣地亞哥公司