目標(biāo)粒子的檢測方法
【專利摘要】該目標(biāo)粒子的檢測方法中，(a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有前述發(fā)光探針的前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序；(b)在前述工序(a)之后，從前述溶液中通過固液分離處理回收前述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；(c)通過掃描分子計數(shù)法算出前述試樣溶液中存在的前述復(fù)合體的分子數(shù)；前述分離回收用粒子與由前述目標(biāo)粒子和前述發(fā)光探針形成的結(jié)合體結(jié)合。
【專利說明】目標(biāo)粒子的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測到來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)求出在試樣溶液中分散并隨機運動、且與基于固液分離處理的分離回收用粒子結(jié)合后的粒子的濃度的方法。
[0002]本申請基于2011年8月30日在日本提交的日本特愿2011-187600號主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來光學(xué)測量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進行光子計數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù)，能夠檢測/測定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測技術(shù)，進行生物分子等的分子間相互作用或者分子間的結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測的各種裝置或方法。提出有例如，熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，參見專利文獻 I ?3、非專利文獻I?3)中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)技術(shù)，測定來自在試樣溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光聚光而成的焦點區(qū)域，被稱為共焦體積。)內(nèi)出入的熒光分子或進行了熒光標(biāo)記的分子(熒光分子等)的熒光強度。然后基于由測定的熒光強度的自相關(guān)函數(shù)的值確定的、微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時間(平移擴散時間)以及滯留的分子個數(shù)的平均值，能夠取得熒光分子等的運動速度或大小、濃度這類信息，或者檢測到分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集的各種現(xiàn)象。此外，提出有利用突光強度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專利文獻4、非專利文獻4)或光子計數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如，專利文獻5)，與FCS同樣地，生成檢測到的出入共焦體積內(nèi)的熒光分子等的熒光強度的直方圖。并且，通過對該直方圖的分布擬合統(tǒng)計學(xué)公式而算出熒光分子等固有的明亮度的平均值和滯留于共焦體積內(nèi)的分子的個數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息，推測分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此外，專利文獻6、7中提出了:基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測定出的試樣溶液的熒光信號的時程來檢測熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻8中提出了一種信號運算處理技術(shù)，其用于:使用光子計數(shù)技術(shù)，測量在流式細胞儀內(nèi)流過的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘Ｋl(fā)出的微弱光，檢測液流中或基板上的熒光微粒的存在。
[0004]特別是，通過應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測定技術(shù)的方法，測定所必需的試樣的濃度比以前低得多且可以是微量(每次測定使用的量最多數(shù)十UL左右)，測定時間也大幅地縮短(每次測定中可重復(fù)進行數(shù)次的秒數(shù)量級時間的測定。)。因此，特別在對于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價的試樣進行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待能夠成為低廉或迅速地進行實驗或檢測的強有力的工具。[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻1:日本特開2005-098876號公報
[0008]專利文獻2:日本特開2008-292371號公報
[0009]專利文獻3:日本特開2009-281831號公報
[0010]專利文獻4:日本專利第4023523號公報
[0011]專利文獻5:國際公開第2008/080417號
[0012]專利文獻6:日本特開2007-20565號公報
[0013]專利文獻7:日本特開2008-116440號公報
[0014]專利文獻8:日本特開平4-337446號公報
[0015]非專利文獻
[0016]非專利文獻1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號、第1431?1438 頁。
[0017]非專利文獻2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler編、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁。
[0018]非專利文獻3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號、第271?277 頁。
[0019]非特許文獻4:P.Kask、其他3名(K.Palo, D.Ullmann, K.Gall)、美國《國家科學(xué)院院刊》(PNAS)、1999年、第96卷、第13756?13761頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明要解決的問題
[0021]上述的FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)簡而言之是通過統(tǒng)計學(xué)處理算出所測量的熒光強度隨時間波動的大小，根據(jù)該波動的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度適合調(diào)制成:在平衡狀態(tài)下在秒數(shù)量級長度的一次測量時間中有能夠統(tǒng)計學(xué)處理的個數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)；優(yōu)選調(diào)制成在微小區(qū)域內(nèi)經(jīng)常地存在有一個左右的熒光分子等(典型地，共焦體積的體積為IfL左右，所以熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。)。換言之，試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度大幅地低于能夠統(tǒng)計學(xué)處理的程度時(例如，大幅地低于InM時)，產(chǎn)生測量時間內(nèi)只有稀少的觀測對象物進入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，在熒光強度的測量結(jié)果中長期包括著觀測對象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)，并且顯著的熒光強度的觀測量變少，所以通過如上述的基于熒光強度的統(tǒng)計學(xué)波動的光分析技術(shù)難以獲得有意義的或精度良好的分析結(jié)果。
[0022]專利文獻6、7中所述的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測方法中公開有:不進行如上述的涉及熒光強度波動的統(tǒng)計學(xué)處理，根據(jù)數(shù)秒的測量時間內(nèi)有無顯著強度的熒光信號的產(chǎn)生，判斷試樣中的觀測對象的熒光分子等的有無，而得到顯著強度的熒光信號的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專利文獻7中，提出了產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機流動時，檢測靈敏度提高。然而，即便在這些方法，也只停留在檢測通過擴散或隨機的流動概率地進入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子行為，并沒有實現(xiàn)例如:粒子的計數(shù)、定量地算出粒子的濃度或數(shù)密度。此外，專利文獻8中記載的技術(shù)是逐個檢測流式細胞儀的液流中的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘５拇嬖诘募夹g(shù)，而不是用于檢測試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等的粒子，即不是用于對于在試樣溶液中隨機運動的粒子進行檢測的技術(shù)，所以并沒有定量地算出在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻8的技術(shù)包含流式細胞儀中的測量或者熒光粒子向基板上的固定化處理的過程，因此可以認(rèn)為，檢測所需要的試樣量遠大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技術(shù)的情況，并且對實施者要求復(fù)雜的高難度的操作技術(shù)。
[0023]另一方面，使用光分析技術(shù)檢測目標(biāo)粒子的情況下，通常將目標(biāo)粒子用發(fā)光探針標(biāo)記，將與該目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出的光作為指標(biāo)間接地進行檢測。該情況下，如果試樣溶液中存在不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針，則不僅檢測到由目標(biāo)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體的發(fā)出的光還檢測到由游離的發(fā)光探針的光；結(jié)果，存在目標(biāo)粒子的檢測精度降低的問題。
[0024]因此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測方法，其不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)中進行的統(tǒng)計學(xué)處理，因此，對于觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述的光分析技術(shù)中處理水平的試樣溶液中的觀測對象粒子的狀態(tài)或特性也能夠檢測，根據(jù)該新型的光分析技術(shù)，抑制由游離的發(fā)光探針導(dǎo)致的影響并且高精度地檢測使用發(fā)光探針標(biāo)記后的目標(biāo)粒子。
[0025]用于解決問題的方案
[0026]本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于在試樣溶液中分散并隨機運動的粒子，在以由與該粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出的光作為指標(biāo)間接地進行檢測的情況下，通過使用掃描分子計數(shù)法進行結(jié)合有發(fā)光探針的粒子的檢測，即便試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度非常低時，也能夠靈敏度良好地檢測結(jié)合有發(fā)光探針的粒子。進而發(fā)現(xiàn)，使被發(fā)光探針標(biāo)記的目標(biāo)粒子與分離回收用粒子結(jié)合之后通過固液分離處理進行回收，通過掃描分子計數(shù)法檢測所回收的分離回收用粒子，對由目標(biāo)粒子、發(fā)光探針和分離回收用粒子形成的復(fù)合體的分子數(shù)進行計數(shù)，由此能夠高精度地檢測目標(biāo)粒子，至此完成本發(fā)明。
[0027]此處，掃描分子計數(shù)法是日本特愿2010-044714中由本申請的 申請人:提出的新型光分析技術(shù)。
[0028]即，本發(fā)明提供以下的目標(biāo)粒子的檢測方法。
[0029](I) 一種目標(biāo)粒子的檢測方法，其特征在于，其為檢測在溶液中分散并隨機運動的粒子的方法，具有:
[0030](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有前述發(fā)光探針的前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序；
[0031](b)在前述工序(a)之后，從前述溶液中通過固液分離處理回收前述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；和[0032](c)算出前述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序；
[0033]前述分離回收用粒子與由前述目標(biāo)粒子和前述發(fā)光探針形成的結(jié)合體結(jié)合，如下進行前述工序(C)的前述復(fù)合體的分子數(shù)的計數(shù):
[0034]使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，移動前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的工序；
[0035]—邊在前述試樣溶液內(nèi)移動前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置,一邊檢測由該光檢測區(qū)域中的前述復(fù)合體發(fā)出的光的工序；
[0036]由前述檢測到的光逐個檢測來自每個復(fù)合體的光信號而逐個檢測復(fù)合體的工序;
[0037]對前述逐個檢測到的復(fù)合體的個數(shù)進行計數(shù)而計數(shù)前述光檢測區(qū)域的位置的移動中檢測到的前述目標(biāo)粒子的個數(shù)的工序。
[0038](2)根據(jù)前述⑴所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，前述分離回收用粒子在前述試樣溶液中的沉降速度為lX10_6m/s以下。
[0039](3)根據(jù)前述⑴或(2)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，在前述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測區(qū)域的位置沿著第二路徑移動，所述第二路徑的位置沿著第一路徑移動。
[0040](4)根據(jù)前述(3)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，前述第一路徑以及第二路徑為循環(huán)路徑；沿著前述第二路徑的前述光檢測區(qū)域的位置的移動周期短于沿著前述第一路徑的前述第二路徑的位置的移動周期。
[0041](5)根據(jù)前述(3)或⑷所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，前述光檢測區(qū)域的位置的移動周期τ 1、前述第二路徑的位置的移動速度ν2、和前述光檢測區(qū)域的直徑d滿足:
[0042]ν2.τ I > do
[0043](6)根據(jù)前述(3)?(5)的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，通過改變前述光學(xué)系統(tǒng)的光路而使前述光檢測區(qū)域的位置沿著前述第二路徑移動；通過移動前述試樣溶液的位置而使前述試樣溶液內(nèi)的前述第二路徑的位置沿著前述第一路徑移動。
[0044](7)根據(jù)前述(3)?(6)的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，前述第二路徑為圓形或橢圓形，前述第一路徑為圓形、橢圓形或直線。
[0045](8)根據(jù)前述(I)?(7)的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，在前述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測區(qū)域的位置以比前述復(fù)合體的擴散移動速度更快的速度移動。
[0046](9)根據(jù)前述(I)?(8)的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，在由前述檢測到的光逐個檢測來自每個復(fù)合體的光信號而逐個檢測復(fù)合體的工序中，根據(jù)檢測到的按照時間順序的光信號的形狀，檢測到一個復(fù)合體進入了前述光檢測區(qū)域。
[0047](10)根據(jù)前述(I)?(9)的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，前述分離回收用粒子為磁性粒子。
[0048]發(fā)明的效果
[0049]本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測方法中應(yīng)用的掃描分子計數(shù)法不進行算出熒光強度的波動這樣的統(tǒng)計學(xué)處理。因此，通過本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測方法，即便試樣中僅極微量地存在作為解析對象的目標(biāo)粒子時，也能夠檢測試樣中的該目標(biāo)粒子。進而，本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測方法中，使用分離回收用粒子，從結(jié)合有目標(biāo)粒子的發(fā)光探針中分離去除不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針之后，通過掃描分子計數(shù)法進行檢測。因此，由游離的發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測被有效地抑制，能夠高精度地檢測目標(biāo)粒子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1A是用于掃描分子計數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0051]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0052]圖1C是改變鏡7的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動光檢測區(qū)域的位置的機構(gòu)的示意圖。
[0053]圖1D是移動微孔板的水平方向位置而移動試樣溶液的位置的機構(gòu)的示意圖。
[0054]圖2A是說明基于用于掃描分子計數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測原理的示意圖。
[0055]圖2B是用掃描分子計數(shù)法測量的光強度的時間變化的示意圖。
[0056]圖2C是說明通過改變本實施方式的光學(xué)系統(tǒng)的光路而實現(xiàn)的、光檢測區(qū)域的位置沿著掃描軌跡(第二路徑)移動的方式的圖。
[0057]圖2D是說明試樣溶液的位置的移動(第二路徑的位置沿著第一路徑移動)的方式的圖。
[0058]圖2E是說明試樣溶液的位置的移動、與光檢測區(qū)域的位置沿著掃描軌跡移動的關(guān)系的圖。
[0059]圖3A是觀測對象粒子一邊進行布朗運動一邊橫穿光檢測區(qū)域時的示意圖。
[0060]圖3B是表示圖3A的示意圖中的光子計數(shù)(光強度)的時間變化的例子的圖。
[0061]圖4A是以快于觀測對象粒子的擴散移動速度的速度移動試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置、從而觀測對象粒子橫穿光檢測區(qū)域時的示意圖。
[0062]圖4B是表示圖4A的示意圖中的光子計數(shù)(光強度)的時間變化的例子的圖。
[0063]圖5是以流程圖的形式顯示根據(jù)掃描分子計數(shù)法測量的光子計數(shù)(光強度)的時間變化進行粒子的計數(shù)的處理次序的圖。
[0064]圖6A為表示通過掃描分子計數(shù)法測量的光子計數(shù)(光強度)的時間變化的例子的圖的一例。
[0065]圖6B是說明在根據(jù)通過掃描分子計數(shù)法測量的光子計數(shù)(光強度)的時間變化進行粒子計數(shù)的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0066]圖7表示通過掃描分子計數(shù)法測量的光子計數(shù)數(shù)據(jù)的實測例(柱狀圖)、和將數(shù)據(jù)平滑化后獲得的曲線(虛線)、和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實線)。圖中，帶有“噪音”的信號作為由噪音或雜質(zhì)帶來的信號被無視。
[0067]圖8是表示實施例1中，將測定時間設(shè)為240秒鐘通過掃描分子計數(shù)法檢測使用磁體進行了純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
[0068]圖9是表示實施例1中，將測定時間設(shè)為2秒鐘通過掃描分子計數(shù)法檢測沒有使用磁體進行純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
[0069]圖10是表示實施例2中，將測定時間設(shè)為240秒鐘通過掃描分子計數(shù)法檢測使用磁體進行了純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
[0070]圖11是表示實施例2中，將測定時間設(shè)為2秒鐘通過掃描分子計數(shù)法檢測沒有使用磁體進行純化處理的試樣溶液而得到的峰數(shù)的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0071]以下，對于本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測方法的一實施方式進行說明。
[0072]首先，對掃描分子計數(shù)法進行說明。掃描分子計數(shù)法為如下技術(shù):一邊通過微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機運動的發(fā)出光的粒子(以下，稱為“發(fā)光粒子”。))橫穿微小區(qū)域內(nèi)時，檢測由微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，一個一個逐個檢測試樣溶液中的發(fā)光粒子，能夠獲得發(fā)光粒子的計數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的相關(guān)信息。掃描分子計數(shù)法與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，檢測所需的試樣可以是微量(例如，數(shù)十UL左右)，另外，測定時間短；并且與FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，對于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，可以定量檢測其濃度或數(shù)密度等特性。
[0073]需要說明的是，發(fā)光粒子是指通過熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。本實施方式的目標(biāo)粒子的定量方法中，目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而成的物質(zhì)為發(fā)光粒子。
[0074]本實施方式和本說明書中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測到光的微小區(qū)域，當(dāng)由物鏡照射照明光時，相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。在共聚焦顯微鏡中，所述區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔之間的位置關(guān)系確定。發(fā)光粒子沒有照明光而發(fā)光的情況下，例如，為通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光而發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。需要說明的是，本說明書中，言及發(fā)光粒子的“信號”時，只要沒有特別的限定，是指表示由發(fā)光粒子發(fā)出的光的信號。
[0075]邊在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域的位置、即通過光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進行光的檢測。這樣一來，移動的光檢測區(qū)域包含與隨機運動的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時，檢測到由發(fā)光探針發(fā)出的光，由此檢測到一個粒子的存在(根據(jù)實驗的方式，也包括如下情況:發(fā)光探針暫時與要檢測的粒子(目標(biāo)粒子)結(jié)合之后，在檢測光時從粒子解離。)。接著，在逐次檢測到的光中逐個檢測來自發(fā)光探針的光信號，由此，一個一個地逐個逐次地檢測到(結(jié)合有發(fā)光探針的)粒子的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在上述構(gòu)成中，可以計數(shù)逐個檢測到的粒子，從而計數(shù)在光檢測區(qū)域的位置移動中檢測到的粒子的個數(shù)(粒子的計數(shù))。根據(jù)所述構(gòu)成，通過組合粒子的個數(shù)與光檢測區(qū)域的位置的移動量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是，通過任意手法例如以規(guī)定速度移動光檢測區(qū)域的位置等來確定光檢測區(qū)域的位置移動軌跡的總體積，就能夠具體計算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，并不是直接確定絕對數(shù)密度值或濃度值，也可以算出相對于多個試樣溶液、或者相對于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對的數(shù)密度或濃度之比。
[0076]另外，掃描分子計數(shù)法中，采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動光檢測區(qū)域的位置的構(gòu)成。根據(jù)該構(gòu)成，光檢測區(qū)域的移動是迅速的，并且在試樣溶液中實質(zhì)上不產(chǎn)生機械振動、流體力學(xué)的作用。因此，作為檢測對象的粒子能夠不受力學(xué)的作用的影響，在穩(wěn)定的狀態(tài)下進行光的測量(試樣溶液中，振動或流動起作用時，粒子的物理性質(zhì)存在變化的可能性。)。并且，在掃描分子計數(shù)法中，由于使試樣溶液流動的構(gòu)成不是必需的，因此能夠用與FCS、FIDA等情況下同樣微量(I?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進行測量和分析。[0077]在上述的逐個地檢測粒子的工序中，由逐次檢測到的光信號判斷與一個粒子結(jié)合的發(fā)光探針(包括:一個發(fā)光探針與一個粒子結(jié)合的情況；多個發(fā)光探針與一個粒子結(jié)合的情況；以及根據(jù)實驗方式的、與一個粒子結(jié)合之后從粒子解離的發(fā)光探針的情況。以下同樣)是否進入光檢測區(qū)域，可以根據(jù)按照時間順序檢測到的光信號的形狀而進行。本實施方式中，典型地，當(dāng)檢測到具有比規(guī)定閾值大的強度的光信號時，能夠檢測到與一個粒子結(jié)合的發(fā)光探針進入了光檢測區(qū)域。更具體而言，通常，表示由發(fā)光粒子發(fā)出的光的信號在光檢測部的按照時間順序的檢測值即光強度數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為具有某種程度以上的強度的鐘形的脈沖狀信號形式。噪音或者并非鐘形的脈沖狀或者表現(xiàn)為強度小的信號的形式。因此，也可以在按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)上，檢測具有超過規(guī)定閾值的強度的脈沖狀信號，將其作為表示由單一的發(fā)光粒子發(fā)出的光的信號?！耙?guī)定閾值”能夠通過實驗設(shè)定為適當(dāng)?shù)闹怠?br> [0078]此外，在上述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變試樣溶液內(nèi)部的光檢測區(qū)域的位置的移動速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，由與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針?biāo)鶛z測到的光的形態(tài)，可能會根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，如果光檢測區(qū)域的移動速度過快，則由與I個粒子結(jié)合后的發(fā)光探針得到的光量減少，為了精度良好且靈敏度良好地檢測到由與I個粒子結(jié)合后的發(fā)光探針發(fā)出的光，優(yōu)選適宜改變光檢測區(qū)域的移動速度。
[0079]進一步，在上述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，適當(dāng)?shù)氖菍⒃嚇尤芤簝?nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為高于與作為檢測對象的粒子結(jié)合后的發(fā)光探針(即，本實施方式的目標(biāo)粒子的定量方法中，與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針)的擴散移動速度(由布朗運動造成的粒子的平均移動速度)。如上述說明，通過掃描分子計數(shù)法，當(dāng)光檢測區(qū)域通過存在有與一個粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的位置時，檢測由該發(fā)光探針發(fā)出的光而逐個檢測發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運動而隨機移動，在光檢測區(qū)域中出入多次時，多次檢測到來自一個發(fā)光探針的(表示希望檢測的粒子存在的)光信號，難以將檢測到的光信號與一個希望檢測的粒子的存在對應(yīng)起來。因此，如上所述，將光檢測區(qū)域的移動速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的擴散移動速度(具體而言，設(shè)定為以比與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的擴散移動速度快的速度移動)；由此，能夠使與一個粒子結(jié)合后的發(fā)光探針對應(yīng)于一個(表示粒子的存在的)光信號。需要說明的是，擴散移動速度隨著與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針而改變，所以如上述，優(yōu)選根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性(特別是擴散常數(shù))，適當(dāng)改變光檢測區(qū)域的移動速度。
[0080]可以以任意方式，進行用于移動光檢測區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0081]例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計鏡改變光路，使光檢測區(qū)域的位置發(fā)生變化。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可以任意地設(shè)定，也可以選自例如圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0082]掃描分子計數(shù)法中，其光檢測機理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對來自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測區(qū)域的光進行檢測的構(gòu)成，所以試樣溶液的量同樣地可以是微量的。然而，掃描分子計數(shù)法中，不進行算出熒光強度的波動這樣的統(tǒng)計學(xué)處理，所以掃描分子計數(shù)法的光分析技術(shù)能夠適用于粒子的數(shù)密度或濃度大幅地低于FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平的試樣溶液。
[0083]另外，掃描分子計數(shù)法中，由于能夠逐個檢測溶液中分散或溶解的每個粒子，所以可以使用該信息定量地進行粒子的計數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過掃描分子計數(shù)法，使通過光檢測區(qū)域的粒子與檢測到的光信號一一對應(yīng)，一個一個地檢測出粒子，所以能夠進行溶液中分散并隨機運動的粒子的計數(shù)，與以前相比較，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。實際上，根據(jù)逐個檢測與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針并計數(shù)其數(shù)目、確定粒子濃度的本實施方式的目標(biāo)粒子的定量方法，即使試樣溶液中的與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的濃度是比通過熒光分光光度計或酶標(biāo)儀測量的熒光強度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠定量地檢測目標(biāo)粒子。
[0084]進一步，根據(jù)改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、利用光檢測區(qū)域掃描試樣溶液中的方式，不對試樣溶液產(chǎn)生機械振動或流體力學(xué)作用，使試樣溶液內(nèi)部在均勻的狀態(tài)或試樣溶液機械上穩(wěn)定的狀態(tài)下進行觀察。因此，與例如使試樣產(chǎn)生流動的情況(賦予流動的情況下難以恒常地賦予同樣的流速，并且裝置構(gòu)成變得復(fù)雜，還有需要的試樣量大幅地增大，并且由于流動導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用，溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)存在變質(zhì)或變性的可能性。)相比較，定量的檢測結(jié)果的可靠性提高；另外，對于試樣溶液中的成為檢測對象的粒子，能夠在沒有力學(xué)作用的影響下或沒有人為影響的狀態(tài)下進行測量。
[0085]<用于掃描分子計數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0086]可以通過在基本的構(gòu)成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測器而構(gòu)成的光分析裝置實施掃描分子計數(shù)法。參照同一圖，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計算機18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣，此處，自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光，通過準(zhǔn)直儀4成為平行光，在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9 ;自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點，形成光強度強的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測對象物的粒子、與所述粒子結(jié)合的發(fā)光探針、帶有發(fā)光標(biāo)記(典型地為熒光色素等)的分子，與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實驗的方式，與粒子暫時結(jié)合后與粒子解離的發(fā)光探針)進入激發(fā)區(qū)域時，發(fā)光探針就在其間被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光，通過小孔13，透過二次濾片14 (此處，只選擇特定的波長范圍的光成分。)被導(dǎo)入至多模光纖15而到達光檢測器16，轉(zhuǎn)換成按照時間順序的電信號之后，輸入至計算機18，按照后面說明的方式實施用于光分析的處理。需要說明的是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點位置共軛的位置上，由此，僅自圖1B中示意地所示的激光的焦點區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過小孔13，而來自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點區(qū)域通常是具有I?IOfL左右的實際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測區(qū)域(典型地，光強度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點的高斯型分布或洛倫茲型分布。實際體積是以光強度為l/e2的面為界面的幾乎橢球體的體積。)，被稱為共焦體積。另外，掃描分子計數(shù)法中，檢測來自一個粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來自發(fā)光探針的光，例如，來自一個或數(shù)個熒光色素分子的微弱光，所以光檢測器16優(yōu)選使用能夠用于光子計數(shù)的超高靈敏度的光檢測器。此外，為了改變欲進行觀察的孔10，在顯微鏡的平臺(沒有圖示)上可以設(shè)有用于移動微孔板9的水平方向位置的平臺位置變化裝置17a?？梢酝ㄟ^計算機18控制平臺位置變化裝置17a的動作。通過所述的構(gòu)成，即使被檢體為多個，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測量。
[0087]進一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部、即用于在試樣溶液內(nèi)移動焦點區(qū)域(即，光檢測區(qū)域)的位置的機構(gòu)。所述用于移動光檢測區(qū)域的位置的機構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。所述的鏡轉(zhuǎn)向器17也可以與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計鏡裝置相同(移動光檢測區(qū)域的位置的方式)。另外，進一步，如圖1B所例示，為了移動注入有試樣溶液的容器10(微孔板9)的水平方向的位置而移動試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的相對的位置，也可以操作平臺位置變化裝置17a(移動試樣溶液的位置的方式)。通過上述的改變光路而移動光檢測區(qū)域的絕對的位置的方式，使光檢測區(qū)域沿著掃描軌跡(第二路徑)而繞轉(zhuǎn)移動，同時地，通過移動試樣溶液的位置的方式，使試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的掃描軌跡的位置沿著規(guī)定的移動路徑(第一路徑)移動。利用任意方式的情況下，鏡轉(zhuǎn)向器17在計算機18的控制下與光檢測器16的光檢測協(xié)調(diào)而被驅(qū)動，以實現(xiàn)預(yù)期的光檢測區(qū)域的位置移動模式。光檢測區(qū)域的位置的移動軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計算機18的程序中的各種移動模式中選擇。)。需要說明的是，圖中沒有顯示但也可以通過上下移動物鏡8而使光檢測區(qū)域的位置沿上下方向移動。如上所述，根據(jù)不移動試樣溶液而改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動光檢測區(qū)域的位置的構(gòu)成，試樣溶液內(nèi)實質(zhì)上不發(fā)生機械振動或流體力學(xué)的作用，能夠排除力學(xué)作用對觀測對象物的影響，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的測量。
[0088]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過吸收多光子而發(fā)光時，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點區(qū)域(光檢測區(qū)域)中發(fā)出光，所以可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴激發(fā)光發(fā)光時，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過磷光或散射發(fā)光時，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在光分析裝置I中，如圖所示，可以為如下構(gòu)成:可以設(shè)置有多個激發(fā)光源2，根據(jù)用于將粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針激發(fā)的光的波長，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長。同樣地，也可以在檢測光的光路上插入分色鏡14a，將檢測光分割成多個波長頻帶，分別地通過多個光檢測器16進行檢測。根據(jù)所述的構(gòu)成，在涉及發(fā)光粒子的發(fā)光波長特性(發(fā)光光譜)的信息的檢測以及包含多種發(fā)光粒子的情況下，能夠根據(jù)它們的波長分別地檢測由它們發(fā)出的光。進而還有，關(guān)于光的檢測，還可以使用在規(guī)定的方向上偏振的光作為激發(fā)光，將檢測光的、與激發(fā)光的偏振方向垂直的方向的成分分別地進行檢測而能夠檢測發(fā)光粒子的光的偏振特性。該情況下，在激發(fā)光的光路上插入偏振片(沒有圖示)，在檢測光的光路上插入偏振光分束器14a。
[0089]<掃描分子計數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0090]FIDA等分光分析技術(shù)與以前的生物化學(xué)分析技術(shù)相比，其優(yōu)點是必需的試樣量非常少，并且可以快速實施檢查。然而，在FIDA等分光分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強度波動計算觀測對象粒子的濃度或特性。因此，為了獲得精度良好的檢測結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強度測量中，在光檢測區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個左右的觀測對象粒子，在測量時間內(nèi)總是檢測到顯著的光強度(光子計數(shù))。如果觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述時，例如，當(dāng)觀測對象粒子只是偶爾進入光檢測區(qū)域CV內(nèi)的水平時，僅在一部分測量時間內(nèi)出現(xiàn)顯著的光強度(光子計數(shù))，因而難以以良好的精度計算光強度的波動。此外，在觀測對象粒子的濃度大幅地低于測量中通常在光檢測區(qū)域內(nèi)存在一個左右的觀測對象粒子的水平時，光強度波動的運算易受背景的影響，為了獲得對運算而言為充分量的顯著的光強度數(shù)據(jù)，測量時間延長。與此相對，即使當(dāng)觀測對象粒子的濃度低于FIDA等分光分析技術(shù)要求的水平時，本實施方式的掃描分子計數(shù)法也能夠檢測觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0091]掃描分子計數(shù)法的光分析技術(shù)中，作為進行的處理，直接了當(dāng)?shù)卣f，驅(qū)動用于移動光檢測區(qū)域的位置的機構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路,如圖2A?2E中不意地描述,一邊在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域CV的位置即利用光檢測區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實施光檢測。
[0092]如此一來，例如，如圖2A所示，在光檢測區(qū)域CV移動期間(圖2A中，時間t0?t2)，當(dāng)通過存在有I個粒子(圖中，發(fā)光探針結(jié)合有熒光色素)的區(qū)域時(tl)，檢測到如圖2B所述的顯著的光強度(Em)。如此，實施上述的光檢測區(qū)域CV的位置的移動和光檢測，通過一個一個地檢測在此期間出現(xiàn)的圖2B所例示的顯著的光強度而逐個檢測出結(jié)合有發(fā)光探針的粒子。通過將其個數(shù)進行計數(shù)，能夠得到與存在于所測量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。所述掃描分子計數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，粒子一個一個地被檢測出且不進行如熒光強度波動的算出這類統(tǒng)計學(xué)運算處理，所以可以認(rèn)為即便是欲觀測粒子濃度低至無法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液中，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0093]另外，通過掃描分子計數(shù)法這類逐個檢測、計數(shù)試樣溶液中的粒子的方法，與由通過熒光分光光度計或酶標(biāo)儀測量的熒光強度來檢測被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時相比，能夠測定至更低的濃度。當(dāng)通過熒光分光光度計或酶標(biāo)儀來檢測某被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時，通常假設(shè)熒光強度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度充分地降低時，噪音信號的量相對于由被熒光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號量變大(S/N比惡化)，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號量之間的比例關(guān)系瓦解，確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計數(shù)法在由被檢測的光信號檢測對應(yīng)于各個粒子的信號的工序中，從檢測結(jié)果中排除了噪音信號，只將對應(yīng)于各個粒子的信號進行計數(shù)而算出濃度，所以與通過假設(shè)熒光強度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時相比較，能夠檢測至更低的濃度。
[0094]進而還有，當(dāng)一個觀測對象粒子結(jié)合有多個發(fā)光探針時，與傳統(tǒng)的假定熒光強度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而確定濃度的方法相比，掃描分子計數(shù)法這類對試樣溶液中的粒子逐個檢測、計數(shù)的方法的情況下，粒子濃度高一側(cè)的粒子濃度的測量精度提高。在一個觀測對象粒子結(jié)合有多個發(fā)光探針的情況下，向試樣溶液添加某一量的發(fā)光探針時，觀測對象粒子的濃度升高時，相對而言與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的個數(shù)降低。在此情況下，由于每一個觀測對象粒子的熒光強度降低，因此，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解，所確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計數(shù)法在由檢測到的光信號檢測對應(yīng)于各個粒子的信號的工序中，每個粒子的熒光強度降低的影響變少，由粒子數(shù)算出濃度，所以，與假設(shè)熒光強度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時相比較，能夠檢測至更高的濃度。
[0095]<通過掃描分子計數(shù)法的試樣溶液的光強度的測定>
[0096]就掃描分子計數(shù)法的光分析中的光強度的測定而言，除了在檢測中驅(qū)動鏡轉(zhuǎn)向器17，在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強度檢測工序相同的方式實施光強度檢測。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺上后，使用者對計算機18輸入測定開始的指示，計算機18根據(jù)存儲裝置(沒有圖示)存儲的程序(將用于在試樣溶液內(nèi)移動光檢測區(qū)域的位置的光路進行改變的次序、和在光檢測區(qū)域的位置的移動中檢測來自光檢測區(qū)域的光的次序)，開始試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強度的測量。所述測量中，在根據(jù)計算機18程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)進行光檢測區(qū)域的位置的移動，與此同時，光檢測器16將逐次檢測到的光轉(zhuǎn)換為電信號，傳送給計算機18，計算機18以任意方式由送達的光信號生成按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)并保存。需要說明的是，典型地光檢測器16為能夠檢測到單光子到達的超高靈敏度光檢測器，所以，光的檢測是以如下方式進行的光子計數(shù):在規(guī)定時間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時間(BINTIME)如每10 μ秒逐次地測量到達光檢測器的光子的個數(shù)，按照時間順序的光強度的數(shù)據(jù)可以為按照時間順序的光子計數(shù)數(shù)據(jù)。
[0097]光強度測量中的光檢測區(qū)域的位置移動速度可以是任意的，可以設(shè)定為適合例如實驗或分析目的的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測到的觀測對象粒子的個數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的大小或體積是必需的，所以以移動距離受掌握的方式進行光檢測區(qū)域的位置移動。需要說明的是，測量中的經(jīng)過時間與光檢測區(qū)域的位置的移動距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測定結(jié)果，所以移動速度基本上優(yōu)選為恒定速度，但并非僅限于此。
[0098]此外，對于光檢測區(qū)域的位置移動的速度，為了由測量的按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)逐個檢測觀測對象粒子，或以良好的精度定量實施觀測對象粒子數(shù)的計數(shù)，優(yōu)選將所述的移動速度設(shè)定為比觀測對象粒子(更嚴(yán)密地，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針、本實施方式中，為結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子)的隨機運動即布朗運動導(dǎo)致的移動速度更快的值。掃描分子計數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測對象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機運動的粒子，由于布朗運動，位置伴隨著時間而移動。因此，光檢測區(qū)域的位置的移動速度比粒子的布朗運動導(dǎo)致的移動慢時，如圖3Α示意地描述，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機地移動，由此，光強度如圖3Β所示隨機地變化(如已知，光檢測區(qū)域的激發(fā)光強度以區(qū)域的中心為頂點向外側(cè)降低。)，難以確定對應(yīng)于各個觀測對象粒子的顯著的光強度的變化。于是，如圖4Α所示，優(yōu)選粒子幾乎直線地橫穿光檢測區(qū)域，由此，按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)中，如圖4Β例示，對應(yīng)于各個粒子的光強度變化的分布圖大致一致(粒子幾乎直線地通過光檢測區(qū)域的情況下，光強度變化的曲線與激發(fā)光強度分布幾乎相同。)，將光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為快于粒子的布朗運動導(dǎo)致的平均的移動速度(擴散移動速度)，以容易確定每個觀測對象粒子與光強度的對應(yīng)關(guān)系。
[0099]具體而言，由于布朗運動，具有擴散系數(shù)D的觀測對象粒子(更嚴(yán)密的是，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體，或與粒子結(jié)合后再分解、游離的發(fā)光探針)通過半徑Wo的光檢測區(qū)域(共焦體積)時所需的時間At是由均方位移的關(guān)系式
[0100](2Wo)2 = 6D.At...(I)
[0101]推斷出
[0102]At = (2ffo)2/6D— (2)
[0103]所以觀測對象粒子通過布朗運動移動的速度(擴散移動速度)Vdif大約是
[0104]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(3)
[0105]此處，光檢測區(qū)域的位置的移動速度可以參考前述Vdif而設(shè)定為比之更快的值。例如，假定觀測對象粒子的擴散系數(shù)為D = 2.0X 10_1(lm2/S左右的情況下，Wo為0.62 μ m左右，則Vdif為1.0X10_3m/s，所以光檢測區(qū)域的位置的移動速度設(shè)定為其大約10倍的15mm/s即可。此外，當(dāng)觀測對象粒子的擴散系數(shù)未知時，為了找到使在光檢測區(qū)域的位置移動速度的各種設(shè)定下的光強度變化曲線成為預(yù)期曲線(典型的是與激發(fā)光強度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進行預(yù)備實驗，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測區(qū)域的位置的移動速度。
[0106]為了實現(xiàn)發(fā)光粒子以外的其他物質(zhì)的穩(wěn)定性，試樣溶液內(nèi)的流動或振動等干擾應(yīng)該最小。因此，光檢測區(qū)域的位置的移動原則上優(yōu)選通過改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路而進行。這是因為，如上述說明，通過利用鏡轉(zhuǎn)向器17的光路的改變，能夠比較容易地高速地進行光檢測區(qū)域的位置的移動。
[0107]關(guān)于這一 點，在物鏡的視野的周邊，通常像差變大，光檢測區(qū)域的尺寸、形狀存在根據(jù)位置而不同的可能性；所以利用改變光路進行的光檢測區(qū)域的位置的移動的范圍優(yōu)選在物鏡的像差少的視野的中心附近的區(qū)域內(nèi)進行。
[0108]另一方面，如果光檢測區(qū)域的位置的移動范圍限于物鏡的視野的中心附近的區(qū)域內(nèi)，則光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域即掃描區(qū)域變小，能夠檢測到的發(fā)光粒子的個數(shù)也變少。另外，重復(fù)地通過小的區(qū)域的情況下，特別是對于擴散慢的粒子，光檢測區(qū)域重復(fù)地通過其存在區(qū)域而多次檢測到同一粒子。當(dāng)然，通過有意地重復(fù)檢測由同一粒子發(fā)出的光而精度良好地估計其光的特性也是有用的；但發(fā)光粒子的個數(shù)的計數(shù)、濃度或數(shù)密度的檢測等想要盡可能增多發(fā)光粒子的檢測數(shù)時，優(yōu)選不多次檢測同一粒子而掃描更廣范圍的區(qū)域或更長的距離。另外，此時，想要得到關(guān)于發(fā)光粒子的濃度的信息時，優(yōu)選容易估計掃描區(qū)域(光檢測區(qū)域的通過區(qū)域)的長度或體積且光檢測區(qū)域的尺寸、形狀幾乎沒有變化。
[0109]如下進行光檢測區(qū)域位置的移動:使光檢測區(qū)域的位置在規(guī)定的掃描軌跡上移動并且使該掃描軌跡移動，以使光檢測區(qū)域的位置在短時間內(nèi)盡可能不通過(排除路徑的交差點)同一區(qū)域，由此能夠穩(wěn)定地掃描更廣范圍的區(qū)域或者更長的距離。光檢測區(qū)域的位置的移動路徑任選三維的或者二維的。
[0110]即，光檢測區(qū)域的位置在試樣溶液內(nèi)沿著第二路徑移動；所述第二路徑的位置沿著第一路徑移動。通過所述構(gòu)成，由于光檢測區(qū)域的位置所沿著移動的第二路徑的位置被移動，至少至第二路徑沿著第一路徑的位置移動結(jié)束為止，試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動路徑不通過(排除路徑瞬間地交差的情況)同一區(qū)域，檢測到同一發(fā)光粒子二次以上的可能性大幅地被降低。另外，由于光檢測區(qū)域的位置在試樣溶液內(nèi)移動，所以光檢測區(qū)域的位置的形狀、尺寸的變化被抑制為最低限度。
[0111]為了盡可能地將光檢測區(qū)域的形狀、尺寸的變化抑制為最低限度，光檢測區(qū)域的位置應(yīng)該在物鏡的視野內(nèi)被限制在像差小的范圍內(nèi)。另一方面，可以認(rèn)為觀測對象物為隨機運動的發(fā)光粒子，所以經(jīng)過了充分的時間、即曾經(jīng)檢測到的發(fā)光粒子擴散并移動到別的地點后，則光檢測區(qū)域的位置也可以通過同一位置。因此，作為光檢測區(qū)域的位置的軌跡的第二路徑、與作為第二路徑的位置的軌跡的第一路徑可以分別為循環(huán)路徑。例如，第二路徑具體而言，任選圓形或橢圓形。另一方面，第一路徑的形狀任選圓形、橢圓形或直線。該情況下，以試樣溶液為基準(zhǔn)的光檢測區(qū)域的位置的軌跡容易地把握，由于容易確認(rèn)光檢測區(qū)域的位置在短時間內(nèi)不連續(xù)地通過同一區(qū)域，可以將沿著第二路徑的光檢測區(qū)域的位置的移動周期設(shè)定為短于第二路徑的位置沿著第一路徑移動的移動周期。
[0112]具體而言，首先，驅(qū)動圖1A的鏡轉(zhuǎn)向器17而改變光路，在物鏡的視野內(nèi)，如圖2C，使光檢測區(qū)域沿著掃描軌跡(第二路徑)而繞轉(zhuǎn)移動。并且，與該運動同時地，如圖2D，連續(xù)地驅(qū)動平臺位置變化裝置17a而移動試樣溶液的位置，由此，以試樣溶液為基準(zhǔn)而移動光檢測區(qū)域的掃描軌跡的位置，盡量避免光檢測區(qū)域在短時間內(nèi)掃描同一區(qū)域。[如圖2D，如果將試樣溶液的位置的移動設(shè)為循環(huán)路徑，當(dāng)光檢測區(qū)域的掃描軌跡的位置完成該循環(huán)路徑一圈時，光檢測區(qū)域再次掃描相同的區(qū)域，而在光檢測區(qū)域的掃描軌跡的位置完成一圈時，通?？梢约俣òl(fā)光粒子通過擴散移動到其他的位置，所以可以認(rèn)為再次檢測到同一發(fā)光粒子的可能性極低。]
[0113]需要說明的是，雖然優(yōu)選以試樣溶液為基準(zhǔn)的光檢測區(qū)域的速度大致一定以使發(fā)光粒子的光的信號的脈沖狀形狀總是一定；但如果試樣溶液的位置的移動速度高至與光檢測區(qū)域的掃描軌跡上的移動速度相匹敵的程度，則以試樣溶液為基準(zhǔn)的光檢測區(qū)域的速度變化。因此，合適的是，試樣溶液的位置的移動速度優(yōu)選與光檢測區(qū)域的掃描軌跡上的移動速度相比較充分地低(例如，20%以下)。另外，如圖2E所示，當(dāng)光檢測區(qū)域完成掃描軌跡一圈時，為了避免前次(i)的繞轉(zhuǎn)時通過的區(qū)域與此次(ii)繞轉(zhuǎn)時通過的區(qū)域重復(fù)，設(shè)定試樣溶液的位置的移動速度(掃描軌跡的位置的移動速度)v2和光檢測區(qū)域的掃描軌跡上的移動周期τI與光檢測區(qū)域的直徑d之間滿足:
[0114]ν2.τ I > d...(4)
[0115]的關(guān)系。由此，當(dāng)光檢測區(qū)域的位置沿著第二路徑一周時，第二路徑至少移動相當(dāng)于光檢測區(qū)域的直徑的距離，所以在光檢測區(qū)域的位置連續(xù)繞轉(zhuǎn)中能夠避免光檢測區(qū)域與前次繞轉(zhuǎn)中通過的區(qū)域重復(fù)。具體而言，光檢測區(qū)域的直徑d為0.4?30 μ m，當(dāng)光檢測區(qū)域在掃描軌跡上的移動周期τ I為0.6?600m秒時，試樣溶液的位置的移動速度v2為0.67 μ m以上。實際上，通常光檢測區(qū)域在掃描軌跡上的移動周期τ I被設(shè)定為6?60m秒，所以該情況下，試樣溶液的位置的移動速度v2為17μπι以上。光檢測區(qū)域在掃描軌跡上的移動速度典型地被設(shè)定為10?90mm/秒，所以試樣溶液的位置的移動速度v2小至幾乎可以無視。
[0116]共聚焦光學(xué)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中的試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動，具體而言，能夠通過顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路的改變、或包含試樣溶液的容器的移動的任一者而進行。因此，光檢測區(qū)域的位置沿著第二路徑的移動通過改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路而進行，第二路徑的位置沿著第一路徑的移動可以通過移動試樣溶液的位置而進行。換言之，根據(jù)該方式，通過組合利用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路的光檢測區(qū)域的繞轉(zhuǎn)運動和試樣溶液的繞轉(zhuǎn)運動，能夠更廣或更長距離地掃描試樣溶液內(nèi)。此處，利用改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路實現(xiàn)的、試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置沿著第二路徑的移動任選以任意的方式進行。例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計鏡等改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路，使光檢測區(qū)域的位置發(fā)生變化。根據(jù)改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路而改變光檢測區(qū)域的位置的方式，因為光檢測區(qū)域的移動是快速的并且試樣溶液中實質(zhì)上不發(fā)生機械振動或流體力學(xué)作用，所以能夠在作為檢測對象的發(fā)光粒子不受力學(xué)作用的影響而穩(wěn)定的狀態(tài)下進行光的檢測，這一點是有利的。第二路徑具體而言，任選圓形或橢圓形。另一方面，第一路徑的形狀任選圓形、橢圓形或直線。需要說明的是，試樣溶液的移動可以優(yōu)選為如前所述的移動顯微鏡的平臺等，從而連同試樣溶液的容器一起移動。該情況下，溶液內(nèi)不產(chǎn)生流動，所以可以認(rèn)為試樣溶液對發(fā)光粒子的影響被降低。
[0117]<通過掃描分子計數(shù)法的光強度的分析>
[0118]經(jīng)上述處理獲得試樣溶液的按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)時，可以在計算機18中，根據(jù)存儲在存儲裝置中的程序進行處理(由檢測到的光逐個檢測來自各個發(fā)光粒子的光信號的次序)，由此實施如下所述的光強度的分析。
[0119](i) 一個觀測對象粒子的檢測
[0120]在按照時間順序的光強度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個觀測對象粒子通過光檢測區(qū)域時的軌跡是如圖4A所示幾乎直線狀時，與該粒子相對應(yīng)的光強度變化如圖6A示意性地描述，具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)確定的)光檢測區(qū)域的光強度分布的曲線(通常幾乎呈鐘形)。因此，觀測對象粒子的檢測的手法之一中，對于光強度設(shè)定閾值Ιο，超過該閾值的光強度持續(xù)時間寬度△ τ在規(guī)定的范圍時，判定為該光強度的分布圖與一個粒子通過光檢測區(qū)域相對應(yīng)，檢測到一個觀測對象粒子。光強度的閾值1以及時間寬度△ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)觀測對象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后再分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強度而預(yù)想的曲線確定的；所述觀測對象粒子相對于光檢測區(qū)域以規(guī)定的速度相對地移動。具體的值可以根據(jù)實驗任意地設(shè)定，也可以根據(jù)觀測對象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇確定。
[0121]此外，作為觀測對象粒子的檢測的其他方法，光檢測區(qū)域的光強度分布假定為高斯分布:
[0122]I=A* exp (_2t2/a2)…(5)
[0123]此時，對顯著的光強度曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)擬合式(5)算出的強度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時，該光強度曲線可判斷為對應(yīng)一個觀測對象粒子通過了光檢測區(qū)域，可以視為檢測到一個觀測對象粒子。(當(dāng)強度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外時，可以在分析中作為噪音或異物而無視。)
[0124](ii)觀測對象粒子的計數(shù)
[0125]觀測對象粒子的計數(shù)可以如下進行:通過任意方法計數(shù)通過上述觀測對象粒子的檢測方法檢測到的粒子的個數(shù)。然而，當(dāng)粒子的個數(shù)較大時，也可以通過例如圖5和圖6B所示例的處理來進行。
[0126]參照圖5和圖6B，在根據(jù)按照時間順序的光強度(光子計數(shù))數(shù)據(jù)計數(shù)粒子數(shù)的方法的一個例子中，在通過上述說明的光強度測定、即用光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進行光子計數(shù)，獲得按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)(光子計數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)，對所述按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)(圖6B最上部分“檢測結(jié)果(未處理)”)，進行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，在微小的時間內(nèi)存在數(shù)據(jù)值產(chǎn)生欠缺，所以通過所述平滑化處理，可以無視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過移動平均法而進行。需要說明的是，可以根據(jù)獲得光信號數(shù)據(jù)時的光檢測區(qū)域的位置移動速度(掃描速度)、BIN--ΜΕ，適當(dāng)設(shè)定實施平滑化處理時的參數(shù)，例如，在移動平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點數(shù)或移動平均的次數(shù)等。
[0127]然后，為了檢測在平滑化處理后的按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)中存在顯著信號的時間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，對平滑化處理后的按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)對時間進行一階微分值運算(步驟120)。按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)的時間微分值，如圖6B中下部分的“時間微分”所示信號值變化時間點處的值的變化變大，所以通過參考所述時間微分值可以有利地確定顯著的信號(峰信號)的起點和終點。
[0128]之后，在按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)中，逐次檢測顯著的信號(峰信號)，判斷檢測到的峰信號是否是與觀測對象粒子相對應(yīng)的信號。
[0129]具體而言，首先，在按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)的按照時間順序的時間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時間微分值，搜索一個峰信號的始點和終點進行確定，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。一旦確定了一個峰存在區(qū)域，就對該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)進行鐘形函數(shù)擬合(圖6B下部分的“鐘形函數(shù)擬合”)，算出鐘形函數(shù)的峰強度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum))W、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。需要說明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。由此， 判斷算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過光檢測區(qū)域時檢測到的光信號所描述的鐘形曲線參數(shù)的規(guī)定范圍內(nèi)，即，峰強度、峰寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣，如圖7左側(cè)所示，算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對應(yīng)的光信號規(guī)定的范圍內(nèi)時，則該信號判定為與一個觀測對象粒子對應(yīng)的信號，由此，判斷為檢測到一個觀測對象粒子，計數(shù)為一個粒子(粒子數(shù)的計數(shù)增加。步驟160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將算出的鐘形函數(shù)的參數(shù)沒有在規(guī)定范圍內(nèi)的峰信號作為噪音而無視。
[0130]上述的步驟130~160的處理中的峰信號的搜索和判定可以在按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)的整個領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進行，每檢測到一個觀測對象粒子則作為粒子而計數(shù)。因此，在結(jié)束對按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)全部區(qū)域的峰信號搜索后(步驟170)，將所獲得的粒子計數(shù)值作為在按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)中檢測到的觀測對象粒子的個數(shù)。
[0131](iii)觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0132]進行了觀測對象粒子的計數(shù)后，使用在獲得按照時間順序的光信號數(shù)據(jù)的過程中光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，確定觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測區(qū)域的實際體積依賴于激發(fā)光或檢測光的波長、透鏡的開口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變，所以由設(shè)計值計算通常是困難的，因此，計算光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積也不簡單。在本文中，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測定相同的條件下，對已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進行上文說明的光強度測定、粒子的檢測和計數(shù)，根據(jù)檢測到的粒子的個數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，即確定觀測對象粒子的檢測數(shù)和濃度之間的關(guān)系。[0133]作為參照溶液的粒子，可以優(yōu)選為與觀測對象粒子所形成的粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測對象粒子結(jié)合后再游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對于粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測數(shù)為N時，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)
[0134]Vt = N/C...(6)
[0135]而獲得。另外，準(zhǔn)備多個不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對其實施測定，將算出的Vt的平均值作為光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的總體積Vt而采用即可。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度C就根據(jù)
[0136]c = n/Vt …(7)
[0137]而獲得。需要說明的是，可以不通過上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測區(qū)域的體積、光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的總體積即可。此外，本實施方式的光分析裝置也可以如下構(gòu)成，對于規(guī)定的光檢測區(qū)域的移動模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子的個數(shù)N之間的關(guān)系(式(6))的信息預(yù)先存儲在計算機18的存儲裝置中，裝置的使用者在實施光分析時可以適當(dāng)利用存儲的關(guān)系信息。
[0138]<目標(biāo)粒子的檢測方法>
[0139]本實施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法的特征在于，其為檢測在溶液中分散并隨機運動的目標(biāo)粒子的方法，使用分離回收用粒子，從與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針中將不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針分離去除，之后通過掃描分子計數(shù)法檢測結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。掃描分子計數(shù)法為能夠在分子離散的狀況下逐個粒子地測定發(fā)光粒子的測定方法，所以對于PM級以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進行測定。因此，通過本實施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時，也能夠高靈敏度地計數(shù)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。進而，本實施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法在使被發(fā)光探針標(biāo)記的目標(biāo)粒子與分離回收用粒子結(jié)合之后，通過固液分離處理回收分離回收用粒子，對于該被回收的分離回收用粒子利用掃描分子計數(shù)法進行檢測。被發(fā)光探針標(biāo)記的目標(biāo)粒子與分離回收用粒子結(jié)合，所以通過固液分離處理與分離回收用粒子一起被回收，而不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針從分離回收用粒子中分離而被去除。即，因為在去除了游離的發(fā)光探針之后利用掃描分子計數(shù)法進行檢測，所以由游離的發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測被有效地抑制，能夠高精度地檢測目標(biāo)粒子。
[0140]具體而言，本實施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法具有下述工序(a)~(C)。
[0141](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有前述發(fā)光探針的前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序；
[0142](b)在前述工序(a)之后，從前述溶液中通過固液分離處理回收前述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；
[0143](C)算出前述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的前述復(fù)合體的分子數(shù)的工序。
[0144]以下，對于每個工序進行說明。 [0145]首先，作為工序(a)，調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含與前述發(fā)光探針結(jié)合的前述目標(biāo)粒子和前述分離回收用粒子的溶液；在該溶液中，形成由前述目標(biāo)粒子、前述發(fā)光探針和前述分離回收用粒子形成的復(fù)合體。
[0146]本實施方式和本說明書中，“在溶液中分散并隨機運動的粒子”是指在溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的或不發(fā)光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進行布朗運動的粒子。
[0147]目標(biāo)粒子為在溶液中分散并隨機運動的、以檢測為目的的粒子。作為目標(biāo)粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細胞等粒子狀的生物學(xué)的對象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴增的核酸。核酸類似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置換的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA，HexitolNucleic Acid)、妝核酸(PNA)等。
[0148]另外，本實施方式中使用的發(fā)光探針為與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)，只要是在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下發(fā)出光的物質(zhì)，就沒有特別的限定。另外，發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的結(jié)合任選可逆的結(jié)合、或者共價鍵等不可逆的結(jié)合。例如，發(fā)光探針任選為發(fā)光物質(zhì)自身，或者為使發(fā)光物質(zhì)結(jié)合在與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或者吸附的物質(zhì)上而成的物質(zhì)。作為發(fā)光物質(zhì)，典型地為熒光性物質(zhì)，但也可以為通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的物質(zhì)。作為熒光物質(zhì)，只要是由特定波長的光照射就發(fā)出熒光的物質(zhì)即可，沒有特別的限定，可以從用于FCS或FIDA等的熒光色素中適當(dāng)?shù)倪x擇使用。
[0149]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，發(fā)光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、與核酸結(jié)合的色素分子等。作為該寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴增物質(zhì)?？梢允遣糠只蛉堪怂犷愃莆镔|(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對。另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)或低分子化合物等的情況下，作為發(fā)光探針，可以使用用熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)對目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體、或者將像生物素和抗生物素蛋白那樣與目標(biāo)粒子特異性結(jié)合的物質(zhì)進行標(biāo)記而得到的物質(zhì)。需要說明的是，與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)與發(fā)光物質(zhì)的結(jié)合可以通過常規(guī)方法進行。
[0150]另外，本實施方式中使用的發(fā)光探針任選為能夠通過合成反應(yīng)等與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)自身。例如，可以使熒光色素等發(fā)光物質(zhì)中的官能團與目標(biāo)粒子中的官能團通過各種合成反應(yīng)而結(jié)合。作為該合成反應(yīng)，可列舉出例如:用水溶性碳化二亞胺使羧酸與氨基結(jié)合的EDAC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽)反應(yīng)，預(yù)先將1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)與N-羥基丁二酰亞胺(NHS)混合而使羧酸和氨基結(jié)合的反應(yīng)，使活性化的醛基、甲苯磺?；c目標(biāo)粒子中的官能團結(jié)合的反應(yīng)等。另外，使用具有雙極性的連接體將目標(biāo)物質(zhì)中的氨基與發(fā)光物質(zhì)中的氨基交聯(lián)的反應(yīng)也可以。[0151]本實施方式中使用的發(fā)光探針也可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，從目標(biāo)粒子的檢測/定量的精度的觀點出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等物質(zhì)。需要說明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的發(fā)光探針，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可，不需要與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，作為發(fā)光探針使用的被發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與該目標(biāo)粒子的堿基序列完全地互補的堿基序列，也可以具有與該目標(biāo)粒子的堿基序列錯配的堿基序列。
[0152]本實施方式中，供于利用掃描分子計數(shù)法的檢測的試樣溶液中，不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針(單獨存在的發(fā)光探針)的大部分被去除。因此，與目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的發(fā)光探針、和單獨存在狀態(tài)的發(fā)光探針，即便發(fā)光特性相同，也能夠高精度地檢測出目標(biāo)粒子。
[0153]本實施方式中，也可以使用在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)、和單獨存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同的發(fā)光探針。在發(fā)光探針單獨存在的狀態(tài)以及與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下，使特定波長的光的強度不同(例如，使熒光強度不同)，由此能夠更高精度地檢測出目標(biāo)粒子。需要說明的是，在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨存在的狀態(tài)下，發(fā)光探針的發(fā)光特性不同是指:在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨存在的狀態(tài)下，特定的波長的光強度不同。
[0154]例如，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，與蛋白質(zhì)結(jié)合且改變周圍環(huán)境時熒光強度、熒光波長變化的色素(例如，疏水性探針ANS、MANS、TNS這類的熒光色素)可以作為發(fā)光探針使用。另外，發(fā)光探針也可以其自身不發(fā)光。例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，使用與該目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸作為發(fā)光探針，通過使與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，結(jié)合在由目標(biāo)粒子與發(fā)光探針形成的締合體上，能夠使在發(fā)光探針單獨存在的狀態(tài)以及在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下的發(fā)光特性不同。作為與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，可列舉出熒光性嵌入劑或結(jié)合了熒光物質(zhì)的溝結(jié)合劑
坐寸ο
[0155]其他的，可以使用例如:由至少兩個構(gòu)成要素形成的、通過與目標(biāo)粒子結(jié)合而使前述的至少兩個構(gòu)成要素的相互位置變化而發(fā)出熒光的物質(zhì)作為發(fā)光探針。作為這樣的物質(zhì)的例子，可列舉出:與某粒子結(jié)合時結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出強的熒光的熒光性蛋白質(zhì)、或者與某粒子結(jié)合時聚集而形成熒光性金屬絡(luò)合物的分子(絡(luò)合物的配體)。通過所述的構(gòu)成，在所有情況下，單獨的發(fā)光探針或不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針均幾乎不發(fā)光，或者即便發(fā)光也與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體的波長不同，所以能夠選擇地檢測由目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體發(fā)出的光。
[0156]另外，通過利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)，能夠使單獨存在的發(fā)光探針、和與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的發(fā)光特性不同。例如，作為發(fā)光探針可以使用如下物質(zhì):使在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)(熒光物質(zhì)、猝滅物質(zhì))按照在發(fā)光探針單獨存在的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)上結(jié)合而形成的物質(zhì)。與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針不再產(chǎn)生FRET，所以由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。另一方面，從單獨存在的發(fā)光探針中，檢測不到由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，或檢測到的熒光是減弱的。因此，通過檢測由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，能夠與單獨存在的發(fā)光探針區(qū)別地檢測到結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。
[0157]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，可以優(yōu)選使用分子信標(biāo)探針作為發(fā)光探針；該分子信標(biāo)探針如下形成:使FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)按照單鏈核酸分子的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、與其他單鏈核酸分子雜交形成締合體的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在當(dāng)為單鏈核酸分子的狀態(tài)時形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體的寡核苷酸上結(jié)合?？闪信e出例如，3’末端側(cè)結(jié)合有成為能量供體的熒光物質(zhì)或成為能量受體的物質(zhì)、5’末端側(cè)結(jié)合有剩余的另一者并且3’末端側(cè)區(qū)域和5’末端側(cè)具有彼此互補的堿基序列，這些堿基序列形成堿基對由此形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(所謂的莖-環(huán)結(jié)構(gòu))的物質(zhì)。需要說明的是，分子信標(biāo)探針的形成分子內(nèi)堿基對的彼此互補的區(qū)域，可以夾著與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域而存在；3’末端側(cè)的區(qū)域和5’末端側(cè)的區(qū)域既可以為分別包含3’末端或5’末端的區(qū)域，也可以為不包含3’末端或5’末端的區(qū)域。此外，就形成堿基對的區(qū)域的堿基數(shù)或堿基序列而言，為所形成的堿基對的穩(wěn)定性低于與目標(biāo)粒子的締合體、且在檢測條件下能夠形成堿基對的程度即可。
[0158]另外，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，使用與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，即便該熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生FRET，也能夠區(qū)別單獨存在的發(fā)光探針和與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針。即，熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記了發(fā)光探針的熒光物質(zhì)中的任一者成為FRET的能量供體，另一者成為FRET的能量受體。由單獨存在的發(fā)光探針，檢測到由標(biāo)記該發(fā)光探針的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。與此相對，與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，所以能夠檢測到由FRET發(fā)出的熒光，結(jié)果能夠與單獨存在的發(fā)光探針區(qū)別而檢測。
[0159]此外，當(dāng)進入發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體的堿基對之間的熒光性嵌入劑的量過多時，檢測自FRET發(fā)出的熒光時的背景變得過高，存在影響檢測精度的擔(dān)心。因此，優(yōu)選將發(fā)光探針設(shè)計成在發(fā)光探針與目標(biāo)粒子的締合體中形成雙鏈的區(qū)域為400bp以下。
[0160]其他的，本實施方式中，也可以使用兩種發(fā)光探針。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，將兩種發(fā)光探針設(shè)計成相對于目標(biāo)粒子相互鄰接而雜交，將一者的發(fā)光探針用FRET中的成為能量供體的熒光物質(zhì)標(biāo)記，將另一者的發(fā)光探針用該FRET中的成為能量受體的物質(zhì)標(biāo)記。該情況下，單獨存在的發(fā)光探針不產(chǎn)生FRET，而通過與目標(biāo)粒子結(jié)合，該兩種發(fā)光探針相互接近而產(chǎn)生FRET。因此，通過檢測自該FRET發(fā)出的熒光，能夠檢測出與發(fā)光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0161]目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，可以使用2種發(fā)光探針，利用猝滅自動連接(Quenched Autoligation, QUAL)反應(yīng)，使與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針發(fā)出光(J.AM.CHEM.S0C.，2002，(10)，p2096)。
[0162]具體而言，設(shè)計并制作:與目標(biāo)粒子雜交并且具有特殊的3’末端修飾堿基的核酸探針(N探針)；和與該N探針的3’末端側(cè)相鄰且與目標(biāo)粒子雜交并且在5’末端側(cè)修飾有猝滅色素和熒光色素的核酸探針(E探針)。如果2個探針與目標(biāo)粒子雜交，則發(fā)生非酶連接(Autoligation)反應(yīng),此時,粹滅色素從E探針脫離。S卩，只在2個探針與目標(biāo)粒子雜交時才產(chǎn)生熒光。
[0163]本實施方式中使用的分離回收用粒子，與目標(biāo)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體特異地或非特異地結(jié)合或吸附，并且能夠懸浮于水中，能夠通過通常的固液分離處理與液體分離。作為分離回收用粒子，可以使用例如:使能夠懸浮于水中并且通過通常的固液分離處理能夠與液體分離的粒子，與特異地或者非特異地結(jié)合或吸附目標(biāo)粒子的物質(zhì)結(jié)合而成的粒子。其他的，也可以使用如下粒子作為分離回收用粒子:表面具有不與未和目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針結(jié)合而能夠結(jié)合與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針的部位，能夠懸浮于水中并且能夠通過通常的固液分離處理與液體分離。
[0164]分離回收用粒子在通過掃描分子計數(shù)法的測定中，需要在試樣溶液中維持懸浮狀態(tài)。因為在測定中，在試樣溶液中沉淀的粒子難以通過掃描分子計數(shù)法進行正確的檢測。因此，本實施方式中使用的分離回收用粒子在試樣溶液中的沉降速度優(yōu)選為lX10_6m/s以下，更優(yōu)選為lX10_7m/s以下。
[0165]需要說明的是，粒子的沉降速度通常通過Stokes式而求出。下述式(8)中， 為珠半徑，P P為珠密度，Pf為溶液密度，g為重力加速度，η為溶液的粘度。
【權(quán)利要求】
1.一種目標(biāo)粒子的檢測方法，其特征在于， 其為檢測在溶液中分散并隨機運動的粒子的方法，具有: (a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針和分離回收用粒子的溶液、或者包含結(jié)合有所述發(fā)光探針的所述目標(biāo)粒子、所述發(fā)光探針和所述分離回收用粒子的溶液，在該溶液中，形成由所述目標(biāo)粒子、所述發(fā)光探針和所述分離回收用粒子形成的復(fù)合體的工序； (b)在所述工序(a)之后，從所述溶液中通過固液分離處理回收所述分離回收用粒子，調(diào)制包含該分離回收用粒子的試樣溶液的工序；和 (C)算出所述工序(b)中調(diào)制的試樣溶液中存在的所述復(fù)合體的分子數(shù)的工序， 所述分離回收用粒子與由所述目標(biāo)粒子和所述發(fā)光探針形成的結(jié)合體結(jié)合，如下進行所述工序(C)的所述復(fù)合體的分子數(shù)的計數(shù): 使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，移動所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內(nèi)移動所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置，一邊檢測由該光檢測區(qū)域中的所述復(fù)合體發(fā)出的光的工序； 由所述檢測到的光逐個檢測來自每個復(fù)合體的光信號而逐個檢測復(fù)合體的工序；和 對所述逐個檢測到的復(fù)合體的個數(shù)進行計數(shù)而計數(shù)所述光檢測區(qū)域的位置的移動中檢測到的所述目標(biāo)粒子的個數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，所述分離回收用粒子在所述試樣溶液中的沉降速度為lX10_6m/s以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，在所述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測區(qū)域的位置沿著第二路徑移動，所述第二路徑的位置沿著第一路徑移動。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，所述第一路徑以及第二路徑為循環(huán)路徑；沿著所述第二路徑的所述光檢測區(qū)域的位置的移動周期短于沿著所述第一路徑的所述第二路徑的位置的移動周期。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中， 所述光檢測區(qū)域的位置的移動周期τ 1、所述第二路徑的位置的移動速度ν2、和所述光檢測區(qū)域的直徑d滿足:
ν2.τ 1 > d0
6.根據(jù)權(quán)利要求3~5的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，通過改變所述光學(xué)系統(tǒng)的光路而使所述光檢測區(qū)域的位置沿著所述第二路徑移動；通過移動所述試樣溶液的位置而使所述試樣溶液內(nèi)的所述第二路徑的位置沿著所述第一路徑移動。
7.根據(jù)權(quán)利要求3~6的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，所述第二路徑為圓形或橢圓形，所述第一路徑為圓形、橢圓形或直線。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，在所述移動光檢測區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測區(qū)域的位置以比所述復(fù)合體的擴散移動速度更快的速度移動。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，在由所述檢測到的光逐個檢測來自每個復(fù)合體的光信號而逐個檢測復(fù)合體的工序中，根據(jù)檢測到的按照時間順序的光信號的形狀，檢測到一個復(fù)合體進入了所述光檢測區(qū)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9的任一項所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，所述分離回收用粒子為 磁性粒子。
【文檔編號】G01N21/64GK103765194SQ201280041270
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月30日
【發(fā)明者】葉梨拓哉 申請人:奧林巴斯株式會社