石棉檢測(cè)方法
【專利摘要】為了提供一種不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、且與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比可以更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉的方法，使帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸，之后將相差顯微鏡和熒光顯微鏡組合使用，從而檢測(cè)受檢物中所含的石棉。
【專利說(shuō)明】石棉檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種石棉檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]最近，石棉(纖維狀硅酸鹽、也稱作“石綿”)給人體帶來(lái)的不良影響正成為問題。即，由企業(yè)公布了過去從事石棉的制造或使用業(yè)務(wù)的人常發(fā)生肺癌、間皮瘤等健康損害，據(jù)報(bào)道，通過吸入石棉粉塵，主要有可能發(fā)生石棉肺、肺癌、惡性間皮瘤等健康障礙。
[0003]石棉肺是肺發(fā)生纖維化的肺纖維癥(塵肺)的疾病之一。引起肺纖維化的原因有其他礦物性粉塵等多種原因，但因暴露于石棉而發(fā)生的肺纖維癥特別作為石棉肺來(lái)區(qū)別。石棉纖維導(dǎo)致的肺癌是由攝入到肺泡內(nèi)的石棉纖維主要通過物理刺激而發(fā)生的。致癌性的強(qiáng)度根據(jù)石棉的種類而不同，此外還與石棉的粗度、長(zhǎng)度有關(guān)。惡性間皮瘤是在包圍肺的胸膜、或包圍肝臟或胃等臟器的腹膜等中發(fā)生的惡性腫瘤。
[0004]石棉包括溫石棉(白石棉，chrysotile)、青石棉(青石棉，crocidolite)、鐵石棉(茶石棉，amosite)、直閃石(anthophyllite)、透閃石(tremolite)、陽(yáng)起石(actinolite)等。作為石棉的用途，90%以上用于建材，剩下的10%用于化學(xué)工廠設(shè)備用的密封材料、摩擦材料等工業(yè)制品等。需要說(shuō)明的是，自平成16 (2004)年10月I日起，以石棉為原料的建材、摩擦材料、粘合劑的制造等已被禁止，但由于過去存在著大量使用石棉的原委，因此現(xiàn)實(shí)狀況是許多建筑物中都留有石棉。
[0005]作為石棉的檢測(cè)方法，例如，檢查大氣中的石棉時(shí)，用泵吸入大氣時(shí)將石棉捕集到濾器中，使用丙酮等將該濾器無(wú)色化(透明化)，之后使用相差顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)測(cè)大氣中的總纖維濃度。總纖維濃度為I根/L以上時(shí)，使用電子顯微鏡判定通過相差顯微鏡觀察到的纖維實(shí)際上是否是石棉(參照非專利文獻(xiàn)I)。
[0006]但是，使用相差顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)需要熟練的技能，還需要相當(dāng)?shù)臅r(shí)間，因此難以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)處理。另外，電子顯微鏡是非常昂貴的器械，所以并非誰(shuí)都可以簡(jiǎn)便地實(shí)施。而且，利用電子顯微鏡進(jìn)行的判定，不但需要進(jìn)行樣品的繁雜的預(yù)處理等，而且還要通過能量分散型X射線分析裝置分析由相差顯微鏡觀察到的纖維，是非常需要時(shí)間和耐性的作業(yè)。
[0007]因此，在現(xiàn)有的使用相差顯微鏡和電子顯微鏡的方法(以下，稱作“相差顯微鏡-電子顯微鏡法”)中，無(wú)法快速檢測(cè)石棉。因此，無(wú)法應(yīng)對(duì)需要快速檢測(cè)的解體現(xiàn)場(chǎng)的石棉風(fēng)險(xiǎn)。在解體現(xiàn)場(chǎng)，快的情況下用2?3天完成解體，因此檢查結(jié)果出來(lái)時(shí)，往往是在石棉已經(jīng)擴(kuò)散到周圍之后。這樣，與其說(shuō)日本的石棉發(fā)生源是工場(chǎng)，不如說(shuō)已經(jīng)向地點(diǎn)在短期內(nèi)變動(dòng)的解體現(xiàn)場(chǎng)轉(zhuǎn)移，因此開發(fā)可以快速檢測(cè)石棉的方法是當(dāng)務(wù)之急。
[0008]然而，本發(fā)明人等獨(dú)立發(fā)現(xiàn)了與石棉特異性結(jié)合的蛋白(稱作“石棉結(jié)合蛋白”)，并提倡利用所述蛋白的石棉的生物測(cè)定系統(tǒng)(稱作“生物熒光法”)(例如參照專利文獻(xiàn)I)。生物熒光法是指，通過用熒光物質(zhì)修飾石棉結(jié)合蛋白，制成生物探針，使用所述生物探針在熒光顯微鏡下檢測(cè)石棉的方法。在生物熒光法中，就連用相差顯微鏡非常難以看到的更微細(xì)的石棉纖維，也可以高靈敏度地檢測(cè)出來(lái)。具體而言，在生物熒光法中，已知就連寬(直徑)30納米的微細(xì)的溫石棉單纖維也可以檢測(cè)出來(lái)。而且，在生物熒光法中，可以確認(rèn)石棉纖維的理化性質(zhì)和形狀這兩者。因此，生物熒光法作為有效率、簡(jiǎn)便且精度高的石棉檢測(cè)方法而受到關(guān)注。
[0009]另外，本發(fā)明人等報(bào)道了:來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)的DksA蛋白即使在石棉中也特別與溫石棉(白石棉)強(qiáng)力結(jié)合(非專利文獻(xiàn)2)。
[0010]而且，本發(fā)明人等還就石棉結(jié)合蛋白的篩選方法、以及使用通過該篩選方法得到的石棉結(jié)合蛋白并利用生物熒光法檢測(cè)各種試樣中所含的石棉的方法進(jìn)行了公開(專利文獻(xiàn)2)。
[0011]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0012]專利文獻(xiàn)
[0013]專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第2007/055243號(hào)小冊(cè)子(國(guó)際
【公開日】:2007年5月18日)
[0014]專利文獻(xiàn)2:日本國(guó)公開專利公報(bào)“日本特開2010-32271號(hào)(2010年2月12日公開)，，
[0015]非專利文獻(xiàn)
[0016]非專利文獻(xiàn)I 石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(7 η卜? 二夕丨J >夕'' 二二 7卟)(第4.0版)”環(huán)境省水.大氣環(huán)境局大氣環(huán)境課、平成22年6月
[0017]非專利文獻(xiàn)2 !“Detection of Chrysotile Asbestos by Using aChrysotiIe-Binding Protein，，，Biotechnology and Bioengineering,第 99卷，N0.2，F(xiàn)ebruaryI, 2008，第 285-289 頁(yè).
【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明所要解決的課題
[0019]如上所述，生物熒光法還可以檢測(cè)用相差顯微鏡無(wú)法檢測(cè)的微細(xì)的石棉纖維。即，通過生物熒光法檢測(cè)到的石棉的總數(shù)有可能多于通過相差顯微鏡檢測(cè)到的總數(shù)。因此，在現(xiàn)有技術(shù)的計(jì)測(cè)者中，存在著“是不是與通過現(xiàn)有的相差顯微鏡-電子顯微鏡法取得的過去的數(shù)據(jù)沒有了延續(xù)性”、“是不是改變了石棉的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)”的懸念。因此，在生物熒光法中，存在著如何以不改變現(xiàn)有的相差顯微鏡-電子顯微鏡法的標(biāo)準(zhǔn)的方式計(jì)測(cè)石棉的技術(shù)課題。
[0020]這里，根據(jù)非專利文獻(xiàn)1，現(xiàn)有方法的標(biāo)準(zhǔn)是指，首先，使用相差顯微鏡計(jì)測(cè)長(zhǎng)5 μ m以上、寬(直徑)不足3 μ m、且長(zhǎng)與寬的比例(長(zhǎng)徑比)為3:1以上的纖維狀物質(zhì)，算出總纖維數(shù)。再通過任一種方法判定該總纖維數(shù)中有百分之多少是石棉。作為該石棉的判定(鑒定)方法，例如，使用電子顯微鏡(分析掃描電子顯微鏡或分析透射電子顯微鏡)的方法是相差顯微鏡-電子顯微鏡法。在該方法中，對(duì)于使用相差顯微鏡計(jì)測(cè)到的纖維，根據(jù)電子顯微鏡下的X射線光譜進(jìn)行判定，判定石棉。
[0021]另一方面，如上所述，相差顯微鏡-電子顯微鏡法存在著無(wú)法簡(jiǎn)便且快速地檢測(cè)石棉的課題。
[0022]本發(fā)明是鑒于上述問題而提出的，其目的在于提供:不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，能夠更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉的方法。
[0023]解決課題的方法
[0024]本發(fā)明人等為了達(dá)到上述目的反復(fù)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):按照常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)在相差顯微鏡下縮小檢測(cè)對(duì)象物后，通過生物熒光法確認(rèn)該檢測(cè)對(duì)象物的理化性質(zhì)，從而不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，能夠更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉，從而完成了本發(fā)明。
[0025]按照相差顯微鏡-電子顯微鏡法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)在相差顯微鏡下縮小檢測(cè)對(duì)象物，之后通過生物熒光法確定該檢測(cè)對(duì)象物的理化性質(zhì)(即是否是石棉)，從而檢測(cè)石棉，這種設(shè)想本身前所未有，是本發(fā)明人等首次在此公開的。
[0026]即，本發(fā)明所涉及的石棉檢測(cè)方法，其特征在于，包括下述步驟:接觸步驟，使帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸；第I檢測(cè)步驟，在經(jīng)過上述接觸步驟后，使用相差顯微鏡檢測(cè)上述受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)；以及第2檢測(cè)步驟，使用熒光顯微鏡檢測(cè)與在上述第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的上述纖維狀物質(zhì)結(jié)合的上述石棉結(jié)合蛋白，其中，上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟在同一視野中進(jìn)行。
[0027]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，首先，在第I檢測(cè)步驟中，在相差顯微鏡下從受檢物中檢測(cè)纖維狀物質(zhì)，對(duì)于第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)到的各纖維狀物質(zhì)，在接下來(lái)的采用生物熒光法的第2檢測(cè)步驟中，判定其是否是石棉。當(dāng)然在第2檢測(cè)步驟中會(huì)觀察到用相差顯微鏡無(wú)法檢測(cè)的微細(xì)的石棉纖維，但這樣的微細(xì)的石棉纖維在第I檢測(cè)步驟中被排除在外。即，通過本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法最終檢測(cè)到的石棉總數(shù)不可能多于通過相差顯微鏡檢測(cè)同一樣品時(shí)檢測(cè)到的石棉總數(shù)。因此，不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即可檢測(cè)石棉。這樣，在本 發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，其特征在于:為了檢測(cè)石棉，將相差顯微鏡和熒光顯微鏡組合使用。
[0028]另外，在第2檢測(cè)步驟中，通過生物熒光法確定第I檢測(cè)步驟中在相差顯微鏡下縮小的檢測(cè)對(duì)象物的理化性質(zhì)(即是否是石棉)，即，根據(jù)熒光的有無(wú)判定帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白是否與上述檢測(cè)對(duì)象物結(jié)合，因此可以非常簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉。
[0029]而且，與利用現(xiàn)有的電子顯微鏡法確定理化性質(zhì)相比，能夠用極短的時(shí)間簡(jiǎn)便地確定檢測(cè)對(duì)象物的理化性質(zhì)。具體而言，在電子顯微鏡法中，若還包括樣品的預(yù)處理，則到確定檢測(cè)對(duì)象物的理化性質(zhì)為止，花費(fèi)大約15小時(shí)(例如參照山田真里等人，“環(huán)境中的石棉粉塵濃度測(cè)定中的分析方法的研究(環(huán)境中O石綿粉C ^濃度測(cè)定1: ^ ^分析方法O検討)”，櫪木縣保險(xiǎn)環(huán)境中心年報(bào)，第12號(hào)(2006年版)，記載頁(yè)62~68)，相比之下，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，大約I小時(shí)即可完成接觸步驟~第2檢測(cè)步驟。
[0030]另外，在相差顯微鏡-電子顯微鏡法中，雖然通過電子顯微鏡可以確認(rèn)受檢物中含有石棉，但由于在兩種顯微鏡間移動(dòng)載物臺(tái)，所以觀察同一視野是非常困難的。即，對(duì)于在相差顯微鏡下檢測(cè)到的各個(gè)纖維，幾乎不可能逐一判別哪個(gè)纖維是石棉，因此用電子顯微鏡判定統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的數(shù)，用該比例乘以通過相差顯微鏡得到的總纖維數(shù)，從而推定石棉數(shù)。
[0031]相比之下，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，通過使用具備相差顯微鏡用電容器和落射熒光裝置的顯微鏡(稱作“相差/熒光顯微鏡”)或具備兩者的偏光顯微鏡作為顯微鏡，從而只需將光路從相差觀察用的透射光切換到落射熒光，即可不改變視野而進(jìn)行第I檢測(cè)步驟和第2檢測(cè)步驟。因此，在第I檢測(cè)步驟中，在相差顯微鏡下縮小檢測(cè)對(duì)象物后，只需在此狀態(tài)下直接將顯微鏡的光路由相差模式切換成熒光模式，即可在同一視野中進(jìn)行第2檢測(cè)步驟。由此，對(duì)于第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)，可以立即判別每一個(gè)纖維狀物質(zhì)是否是石棉。
[0032]因此，根據(jù)本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法，可以在不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的情況下，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉。
[0033]需要說(shuō)明的是，在上述非專利文獻(xiàn)2中，僅僅是根據(jù)接觸了 GFP標(biāo)記的DksA蛋白的溫石棉(白石棉)的相差顯微鏡像和熒光顯微鏡像，確認(rèn)了在溫石棉(白石棉)的纖維上觀察到由上述GFP發(fā)出的熒光。即，僅僅是為了確認(rèn)DksA蛋白確實(shí)與溫石棉(白石棉)結(jié)合，而進(jìn)行相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡像的觀察。
[0034]同樣，在上述專利文獻(xiàn)2中，也記載著進(jìn)行相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察這兩者，但在該專利文獻(xiàn)中，也不過是記載著進(jìn)行這兩種觀察。
[0035]這樣，在非專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)2記載的方法中，雖然對(duì)受檢物進(jìn)行相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察這兩種觀察，但石棉的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)有的生物熒光法相同。即，在非專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)2記載的方法中，判斷為觀察到熒光的物質(zhì)均為石棉，因此采用現(xiàn)有的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法正確地檢測(cè)石棉。
[0036]另外，專利文獻(xiàn)2中記載著:在濾器上觀察熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與石棉的結(jié)合體時(shí)，將濾器無(wú)色化(透明化)，但這只是為了能夠進(jìn)行相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察這兩種觀察，根據(jù)上述理由，僅憑將濾器透明化，還無(wú)法采用現(xiàn)有的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)正確地檢測(cè)石棉。
[0037]具體而言，在專利文獻(xiàn)2的實(shí)施例(例如實(shí)施例3)中，根據(jù)相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察這兩種觀察，識(shí)別與石棉結(jié)合的石棉結(jié)合蛋白。但是，在上述技術(shù)中，在進(jìn)行相差顯微鏡觀察時(shí)，沒有選擇出應(yīng)該關(guān)注的纖維(具體而言，具有規(guī)定的大小的纖維)，因此將通過熒光顯微鏡觀察到的所有熒光信號(hào)(從大信號(hào)到小信號(hào)的所有熒光信號(hào))均計(jì)數(shù)為石棉。其結(jié)果，通過上述技術(shù)得到的判定結(jié)果大大偏離了基于現(xiàn)有的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的判定結(jié)果O
[0038]另外，在專利文獻(xiàn)2的實(shí)施例(例如實(shí)施例4、5、7、8、9、10)中，在分散于液體中的狀態(tài)下使石棉與石棉結(jié)合蛋白結(jié)合，同時(shí)在分散于液體中的狀態(tài)下檢測(cè)與石棉結(jié)合蛋白連接的標(biāo)記的酶活性。即，上述的技術(shù)并不是根據(jù)相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察這兩種觀察來(lái)識(shí)別石棉的技術(shù)。
[0039]另外，在專利文獻(xiàn)2的實(shí)施例(例如實(shí)施例6)中，將石棉捕捉到薄膜濾器中，使石棉結(jié)合蛋白與該石棉結(jié)合，之后對(duì)薄膜濾器施行透明化處理(例如參照專利文獻(xiàn)2的實(shí)施例6)。而且，之后根據(jù)相差顯微鏡觀察和熒光顯微鏡觀察這兩種觀察來(lái)識(shí)別石棉。但是，該技術(shù)也和上述的實(shí)施例3 —樣，在進(jìn)行相差顯微鏡觀察時(shí)沒有選擇出應(yīng)該關(guān)注的纖維(具體是指具有規(guī)定的大小的纖維)，因此將通過熒光顯微鏡觀察到的所有熒光信號(hào)(從大信號(hào)到小信號(hào)的所有熒光信號(hào))計(jì)數(shù)為石棉。其結(jié)果，通過上述技術(shù)得到的判定結(jié)果大大偏離了基于現(xiàn)有的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的判定結(jié)果。
[0040]如上所述，通過專利文獻(xiàn)2的實(shí)施例等中記載的技術(shù)得到的判定結(jié)果，大大偏離了基于現(xiàn)有的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的判定結(jié)果。以下對(duì)這一點(diǎn)進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0041 ] 在熒光顯微鏡中，還可以檢測(cè)非常細(xì)的纖維(例如直徑為30nm的溫石棉纖維)。即，在熒光顯微鏡中，以暗視野為背景，看到觀察對(duì)象發(fā)亮，因此還可以觀察非常細(xì)的纖維。熒光顯微鏡到底也是光學(xué)顯微鏡的一種，因此光的分辨率有限(250nm~300nm)。但是，在熒光顯微鏡中，例如即使是30nm的纖維，看起來(lái)也較實(shí)際大小大，粗達(dá)300nm左右，觀察起來(lái)模糊不清。
[0042]即，在熒光顯微鏡中，還能看到光的分辨率的界限以下的纖維，因此與相差顯微鏡相比數(shù)出更多纖維的風(fēng)險(xiǎn)高。另外，光的分辨率的界限附近的測(cè)定值存在著包含該測(cè)定值以下的值的風(fēng)險(xiǎn)，缺乏可靠性。
[0043]本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法提供確實(shí)解決上述問題的方法。[0044]具體而言，在本發(fā)明中，先使用相差顯微鏡檢測(cè)滿足現(xiàn)有的石棉的尺寸條件的纖維，再根據(jù)熒光圖像只判定處于該條件的纖維是否是石棉，從而可以解決上述問題。
[0045]發(fā)明效果
[0046]根據(jù)本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法，可以在不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的情況下，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，發(fā)揮可以更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉的效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0047]圖1是顯示相差熒光法的石棉的顯微鏡觀察結(jié)果的圖。
[0048]圖2是顯示相差熒光法的石棉的顯微鏡觀察結(jié)果的圖。
[0049]圖3是顯示相差熒光法的石棉的顯微鏡觀察結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050]以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。但本發(fā)明并不限于此，可以以在記述范圍內(nèi)加入各種變形的方式實(shí)施。另外，本說(shuō)明書中記載的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)均作為參考而引用到本說(shuō)明書中。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，只要沒有特別說(shuō)明，則表示數(shù)值范圍的“A~B”是指“A以上、B以下”。
[0051]本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法的構(gòu)成如下，即包括下述步驟:接觸步驟，使帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸；
[0052]第I檢測(cè)步驟，在經(jīng)過上述接觸步驟后，使用相差顯微鏡檢測(cè)上述受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)；以及
[0053]第2檢測(cè)步驟，使用熒光顯微鏡檢測(cè)與上述第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的上述纖維狀物質(zhì)結(jié)合的上述石棉結(jié)合蛋白，其中
[0054]上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟在同一視野中進(jìn)行。
[0055]上述“受檢物”是指有待檢測(cè)是否包含石棉的對(duì)象物。作為受檢物，可以列舉砂漿、巖棉等建材、蛇紋石等礦石、采集想要檢測(cè)石棉的環(huán)境中的空氣而得到的物質(zhì)等。
[0056]空氣(大氣)中的受檢物可以通過用濾器過濾待測(cè)環(huán)境中的空氣來(lái)捕集。將受檢物捕集到濾器中的方法沒有特別限定，只要可以用濾器過濾待測(cè)環(huán)境中的空氣來(lái)捕集受檢物即可。例如，可以按照“石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(卜? 二夕U >夕'' 7 二二 (第4.0版)”(非專利文獻(xiàn)I)中記載的方法進(jìn)行受檢物的捕集。作為上述“濾器”，沒有特別限定，但通常使用纖維素酯制薄膜濾器或聚碳酸酯濾器等。
[0057]這樣，上述受檢物可以是被捕集到濾器中的物質(zhì)。此時(shí)，優(yōu)選進(jìn)一步包含將經(jīng)過接觸步驟后的上述濾器透明化的透明化步驟，并且在經(jīng)過上述透明化步驟后進(jìn)行第I檢測(cè)步驟。
[0058]即，對(duì)捕集到濾器中的受檢物進(jìn)行石棉檢測(cè)時(shí)，本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法可以是如下的構(gòu)成，即包括下述步驟:接觸步驟，使帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與捕集到濾器中的受檢物接觸；
[0059]透明化步驟，將經(jīng)過上述接觸步驟后的上述濾器透明化；
[0060]第I檢測(cè)步驟，在經(jīng)過上述透明化步驟后，使用相差顯微鏡檢測(cè)上述受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)；以及
[0061]第2檢測(cè)步驟，使用熒光顯微鏡檢測(cè)與上述第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的上述纖維狀物質(zhì)結(jié)合的上述石棉結(jié)合蛋白，其中
[0062]上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟在同一視野中進(jìn)行。
[0063]需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書中使用的“石棉”與“石綿”同義。
[0064]本發(fā)明人等將該新的石棉檢測(cè)方法命名為“相差熒光法”。
[0065]〔1.接觸步驟〕
[0066]“接觸步驟”是使帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與受檢物(或捕集到濾器中的受檢物)接觸的步驟。
[0067]上述“帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白”可以是用熒光物質(zhì)修飾的石棉結(jié)合蛋白，也可以是熒光蛋白與石棉結(jié)合蛋白的融合蛋白。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，有時(shí)將上述“帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白”僅稱作“石棉結(jié)合蛋白”。關(guān)于“熒光標(biāo)記”和“石棉結(jié)合蛋白”，將在后面進(jìn)行闡述。
[0068]對(duì)使石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸的方法沒有特別限定，從可以使兩者高效率地進(jìn)行接觸的角度考慮，優(yōu)選使石棉結(jié)合蛋白和受檢物在液體中接觸。例如，可以在包含石棉結(jié)合蛋白的溶液中添加受檢物，將其充分混和；反之，可以在包含受檢物的懸浮液中添加石棉結(jié)合蛋白，將其充分混和。另外，還可以混合包含石棉結(jié)合蛋白的溶液和包含受檢物的懸浮液，將其充分混和。受檢物被捕集到濾器中時(shí)，可以通過在濾器的捕集有受檢物的面(捕捉面)上滴加包含石棉結(jié)合蛋白的溶液，使受檢物和石棉結(jié)合蛋白在液體中接觸。需要說(shuō)明的是，關(guān)于使石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸的條件(例如溫度、時(shí)間等)，只要是兩者可以充分接觸的條件即可，沒有特別限定，在適當(dāng)研究后，采用優(yōu)選的條件即可。
[0069]對(duì)與受檢物接觸的石棉結(jié)合蛋白的量沒有特別限定，但若相對(duì)于受檢物的量石棉結(jié)合蛋白的量過少，則有可能無(wú)法充分檢測(cè)受檢物中所含的石棉。另一方面，若相對(duì)于受檢物的量石棉結(jié)合蛋白的量過剩，則有可能發(fā)生石棉以外的物質(zhì)與石棉結(jié)合蛋白的非特異性結(jié)合，精度降低。因此，優(yōu)選使難以與石棉以外的物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合、且能夠與受檢物充分接觸的量的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸。例如，在濾器的捕集面上滴加包含石棉結(jié)合蛋白的溶液時(shí)，優(yōu)選在濾器的捕集面上滴加含有0.5nM?5 μ Μ、優(yōu)選5ηΜ?500ηΜ的濃度的石棉結(jié)合蛋白的溶液，使其達(dá)到33?98 μ 1/cm2、優(yōu)選33?49 μ 1/cm2。
[0070]作為上述“液體”，只要不是抑制或降低石棉結(jié)合蛋白與受檢物的結(jié)合、或者降低石棉結(jié)合蛋白與受檢物的結(jié)合特異性的液體即可，沒有特別限定。作為這樣的液體，例如可以列舉磷酸緩沖液、碳酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0071]另外，在接觸步驟中，使石棉結(jié)合蛋白與受檢物在液體中接觸時(shí)，為了避免非特異性的結(jié)合，該液體中可以含有表面活性劑(Tween20 (注冊(cè)商標(biāo))、Triton X-100等)。在后述的實(shí)施例中，使用0.3M的磷酸緩沖液(pH8.0),0.3M的NaCU0.5%的Tween80 (注冊(cè)商標(biāo))的組成的緩沖液作為液體，進(jìn)行接觸步驟。
[0072]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，在接觸步驟中，可以使作為石棉結(jié)合蛋白的兩種以上的不同的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸。此時(shí)，上述兩種以上的不同的石棉結(jié)合蛋白優(yōu)選為與互不相同的種類的石棉特異性結(jié)合的蛋白、并且?guī)в邪l(fā)出互不相同的波長(zhǎng)的熒光的熒光標(biāo)記。當(dāng)為所述構(gòu)成時(shí)，在接下來(lái)的第2檢測(cè)步驟中，根據(jù)熒光顏色的不同，可以容易地判別不同種類的石棉。
[0073]具體說(shuō)明如下:作為石棉結(jié)合蛋白，例如將與溫石棉特異性結(jié)合的蛋白(例如DksA蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank、檢索號(hào):AAC73256))和與角閃石系石棉特異性結(jié)合的蛋白(例如H-NS6chxi蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank、檢索號(hào):AAC74319))組合使用，并且使各石棉結(jié)合蛋白帶有發(fā)生互不相同的波長(zhǎng)的熒光的熒光標(biāo)記(例如，其中一種石棉結(jié)合蛋白用Cy3進(jìn)行標(biāo)記，另一種石棉結(jié)合蛋白用DyLight488進(jìn)行標(biāo)記),從而在接下來(lái)的第2檢測(cè)步驟中，根據(jù)熒光顏色的不同，可以分別檢測(cè)溫石棉和角閃石系石棉。需要說(shuō)明的是，兩種以上不同的石棉結(jié)合蛋白的組合、以及發(fā)出互不相同的波長(zhǎng)的熒光的熒光標(biāo)記的組合并不限于上述組合，根據(jù)想要檢測(cè)的石棉的種類等，可以從所有的石棉結(jié)合蛋白和熒光標(biāo)記中選擇適當(dāng)?shù)慕M合。
[0074]例如，其中一種石棉結(jié)合蛋白用綠色熒光色素進(jìn)行標(biāo)記、另一種石棉結(jié)合蛋白用紅色熒光色素進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，根據(jù)熒光顏色的不同，可以分別檢測(cè)溫石棉和角閃石系石棉。作為上述“綠色熒光色素”，例如可以列舉熒光素、DyLight488、Alexa488、ATT0488、CF488A等。另外，作為上述“紅色熒光色素”，例如可以列舉Cy3、DyLight550、CF555等。可以從這些“綠色熒光色素”和“紅色熒光色素”中各選擇一種進(jìn)行組合。
[0075]這里，以下對(duì)“石棉結(jié)合蛋白”和“熒光標(biāo)記”進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0076](1-1.石棉結(jié)合蛋白)
[0077]在本說(shuō)明書中，“石棉結(jié)合蛋白”是指具有與石棉特異性結(jié)合的性質(zhì)的蛋白。關(guān)于蛋白是否與石棉特異性結(jié)合，這可以通過在至少包含0.1M以上的氯化鈉的溶液中探討研究對(duì)象的蛋白與石棉是否結(jié)合來(lái)判斷。即，在包含0.1M以上的氯化鈉的溶液中混合蛋白和石棉，洗脫與石棉結(jié)合的蛋白，之后利用SDS-PAGE等方法檢測(cè)蛋白。如果檢測(cè)到蛋白，則可以說(shuō)該蛋白是與石棉特異性結(jié)合的蛋白(石棉結(jié)合蛋白)(具體參照專利文獻(xiàn)I)。需要說(shuō)明的是，當(dāng)?shù)鞍自谥辽侔?.1M以上的氯化鈉的溶液中與石棉結(jié)合時(shí)，可以說(shuō)該蛋白是與石棉特異性結(jié)合的蛋白，但在包含0.3M以上的氯化鈉的溶液中，蛋白難以與石棉結(jié)合，因此優(yōu)選在包含0.1M?0.3M、優(yōu)選0.2M?0.3M的氯化鈉的溶液中探討研究對(duì)象的蛋白與石棉是否結(jié)合。當(dāng)然，也可以在包含0.3M以上的氯化鈉(例如0.3M?0.5M、0.3M?1M、0.5M?1M、或IM以上)的溶液中探討研究對(duì)象的蛋白與石棉是否結(jié)合。氯化鈉的濃度越高，可以說(shuō)蛋白與石棉的結(jié)合特異性越高。
[0078]作為這樣的石棉結(jié)合蛋白，例如可以列舉H-NS蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC74319)、DksA蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC73256)、GatZ蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC75156)、DnaK 蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC73125)、HlpA蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank、檢索號(hào):AAC73289)、YgiW蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank、檢索號(hào):AAC76060)、CspA蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAN68075)、Cgl0974蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):BAB98367)、0mpC 蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC75275)、0mpA 蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC74043)、SI蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC73997)、S4蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank、檢索號(hào):AAC76321)、LI蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank、檢索號(hào):AAC76958)、L5蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC76333)、L7蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC76960)、TTC0984蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:NCB1、檢索號(hào):YP — 004953)等，但本發(fā)明并不限于這些蛋白。這些石棉結(jié)合蛋白可以單獨(dú)使用I種，也可以將多種組合使用。
[0079]上述“H-NS蛋白”的第I位~第57位的氨基酸區(qū)(SEQ ID NO: 7)即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。另外，第60位~第90位的氨基酸區(qū)(SEQ ID Ν0:8)即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)、直閃石、透閃石、陽(yáng)起石特異性
結(jié)合?
[0080]上述“DksA蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。
[0081]上述“GatZ蛋白”即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)、直閃石、透閃石、陽(yáng)起石特異性結(jié)合。
[0082]上述“DnaK蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。
[0083]上述“HlpA蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。
[0084]上述“YgiW蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。
[0085]上述“CspA蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。
[0086]上述“Cgl0974蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)特異性結(jié)合。
[0087]上述“S4蛋白”即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性
結(jié)合 ?
[0088]上述“LI蛋白”即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性
結(jié)合 ?
[0089]上述“L5蛋白”即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性
結(jié)合 ?
[0090]上述“L7蛋白”即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性
結(jié)合?
[0091]上述“OmpC蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)、鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性結(jié)合。
[0092]上述“OmpA蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)、鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性結(jié)合。
[0093]上述“SI蛋白”即使在石棉中也能夠與溫石棉(白石棉)、鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)特異性結(jié)合。
[0094]上述“TTC0984蛋白”即使在石棉中也能夠與鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)結(jié)合。
[0095]對(duì)捕集到濾器中的受檢物進(jìn)行石棉檢測(cè)時(shí)，需要將濾器透明化，因此此時(shí)使用的石棉結(jié)合蛋白優(yōu)選為經(jīng)過后述的透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合的蛋白。由于該石棉結(jié)合蛋白具有這樣的性質(zhì)，因此即使在經(jīng)過透明化步驟后也可以檢測(cè)石棉。這里，上述“經(jīng)過透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合”可以通過研究透明化步驟前后的石棉結(jié)合蛋白在石棉上的結(jié)合量的變化來(lái)進(jìn)行判斷。例如，以與石棉結(jié)合的熒光標(biāo)記蛋白(帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白)的熒光的強(qiáng)度(熒光強(qiáng)度)為基準(zhǔn)，以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持在優(yōu)選20%以上、更優(yōu)選50%以上、進(jìn)一步優(yōu)選80%以上時(shí)，可以說(shuō)經(jīng)過透明化步驟后維持著與石棉的結(jié)合。關(guān)于熒光強(qiáng)度，可以使用熒光顯微鏡等，按照公知的方法進(jìn)行測(cè)定。
[0096]需要說(shuō)明的是，如下所述，根據(jù)熒光標(biāo)記的種類，有時(shí)通過經(jīng)過透明化步驟而使熒光強(qiáng)度受到影響，因此用于研究石棉結(jié)合蛋白與石棉的結(jié)合量的熒光標(biāo)記只要使用在經(jīng)過透明化步驟后通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的熒光標(biāo)記即可。然后，研究通過經(jīng)過透明化步驟熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度受到何種程度的影響，最終可以判斷石棉結(jié)合蛋白與石棉的結(jié)合量。
[0097]作為經(jīng)過透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合的石棉結(jié)合蛋白，例如可以列舉H-NS蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank>檢索號(hào):AAC74319)、DksA蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank>檢索號(hào):AAC73256)、GatZ蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名:GenBank、檢索號(hào):AAC75156)等，但本發(fā)明并不限于這些蛋白。這些石棉結(jié)合蛋白可以單獨(dú)使用I種，也可以將多種組合使用。
[0098]對(duì)石棉結(jié)合蛋白的來(lái)源沒有特別限定，可以是來(lái)自細(xì)菌、酵母、植物、動(dòng)物等任一種生物的蛋白。
[0099]需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，“蛋白” 一詞可以和“多肽”或“肽”交換使用?！暗鞍住卑ǖ鞍椎牟糠制?片段)。另外，“蛋白”包括融合蛋白?！叭诤系鞍住笔侵竷煞N以上的異種蛋白的一部分(片段)或全部結(jié)合得到的蛋白。
[0100]另外，作為本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白，還可以使用由在上述例示的蛋白的氨基酸序列中有I個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代和/或添加的氨基酸序列構(gòu)成、且能夠與石棉結(jié)合的蛋白。
[0101]這里，上述“I個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代和/或添加”是指，利用位點(diǎn)特異性誘變法等公知的突變肽制作法，使可以缺失、取代和/或添加的程度的數(shù)(例如，總氨基酸數(shù)的5%以下)的氨基酸被缺失、取代和/或添加。I個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代和/或添加的數(shù)為總氨基酸數(shù)的5%以下，并且氨基酸被缺失、取代和/或添加后的蛋白只要具有與石棉結(jié)合的活性即可，可以是幾種蛋白。
[0102]關(guān)于有I個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺失、取代和/或添加的位點(diǎn)，只要氨基酸被缺失、取代和/或添加后的蛋白具有與石棉結(jié)合的活性即可，可以是該氨基酸序列中的任何位點(diǎn)。
[0103]這樣的突變多肽并不限于具有利用公知的突變多肽制作法人為導(dǎo)入的突變的多肽，可以是將天然存在的同樣的突變多肽分離純化而得到的多肽。
[0104]蛋白的氨基酸序列中的若干個(gè)氨基酸在不顯著影響該蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的情況下可以容易地被修飾，這在該領(lǐng)域眾所周知。而且，不僅是人為的修飾，在天然蛋白中還存在著不使該蛋白的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生顯著變化的突變體，這也是眾所周知的。
[0105]優(yōu)選的突變體具有保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。優(yōu)選為沉默取代、添加和缺失，特別優(yōu)選為保守性取代。這些取代不會(huì)改變本發(fā)明的多肽活性。[0106]被看作是代表性的保守性取代的取代有:脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的I個(gè)氨基酸取代成其他氨基酸、羥基殘基Ser和Thr的交換、酸性殘基Asp和Glu的交換、酰胺殘基Asn和Gln間的取代、堿性殘基Lys和Arg的交換、以及芳族殘基Phe、Tyr間的取代。
[0107]另外，本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白可以是包含加成的肽的蛋白。作為加成的肽，例如可以列舉聚精氨酸標(biāo)記(Arg-tag)或聚組氨酸標(biāo)記(His-tag)或Myc、Flag等的表位標(biāo)記肽。
[0108]作為本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白，只要是能夠與石棉特異性結(jié)合的蛋白即可，因此即使是上述例示的以外的蛋白，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過確認(rèn)其是否能夠與石棉特異性結(jié)合，即可容易地理解該蛋白是否是本發(fā)明中使用的蛋白。
[0109]同樣，關(guān)于經(jīng)過透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合的蛋白，即使是上述例示的以外的蛋白，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過確認(rèn)在經(jīng)過透明化步驟后是否能夠維持與石棉的結(jié)合，即可容易地理解其是否是經(jīng)過該透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合的蛋白。
[0110]本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白，可以是石棉結(jié)合蛋白的氨基酸序列全長(zhǎng)中包含有助于與石棉的結(jié)合的部分的氨基酸序列的部分肽。例如，在后述的實(shí)施例中，使用H-NS蛋白的第60位?第90位的氨基酸區(qū)的部分肽。通過使用這樣的部分肽，可以提高石棉結(jié)合蛋白與石棉(特別是鐵石棉(茶石棉)、青石棉(青石棉)、直閃石、透閃石、陽(yáng)起石)的結(jié)合特異性。
[0111]另外，本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白，從使石棉與石棉結(jié)合蛋白的結(jié)合變得更強(qiáng)的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選為多聚化的蛋白。即，本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白可以優(yōu)選是多聚蛋白。
[0112]這里，上述“多聚蛋白”是指，2個(gè)以上的蛋白(多肽)通過二硫鍵等共價(jià)鍵、或非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白。蛋白是二聚體以上的多聚體，由此可以經(jīng)由多個(gè)蛋白與石棉結(jié)合，因此與經(jīng)由I個(gè)蛋白與石棉結(jié)合時(shí)相比，石棉結(jié)合蛋白與石棉間的結(jié)合力變高。
[0113]對(duì)多聚蛋白的制作方法沒有特別限定，可以采用公知的方法。例如，在后述的實(shí)施例中，制作H-NS蛋白的第60位?第90位的氨基酸區(qū)的部分肽與鏈霉親和素(streptavidin)的融合蛋白，利用鏈霉親和素形成四聚體的性質(zhì),將這些融合蛋白四聚體化。
[0114]本發(fā)明中使用的石棉結(jié)合蛋白，可以通過培養(yǎng)作為其供給源的細(xì)胞，并進(jìn)行分離、純化來(lái)生產(chǎn)。另外，還可以利用公知的基因工程學(xué)方法構(gòu)建重組表達(dá)載體，將其導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，使其以重組蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，從而生產(chǎn)石棉結(jié)合蛋白。另外，還可以使用氨基酸合成儀等進(jìn)行化學(xué)合成。
[0115](1-2.熒光標(biāo)記)
[0116]在本說(shuō)明書中，“熒光標(biāo)記”是指，在使用石棉結(jié)合蛋白檢測(cè)石棉時(shí)，以熒光為指標(biāo)，用于檢測(cè)與石棉結(jié)合的蛋白的物質(zhì)。熒光標(biāo)記由于其存在而顯示出熒光，因此通過在熒光顯微鏡下觀察，可以簡(jiǎn)單地判定是否存在石棉結(jié)合蛋白。因此，可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)石棉。
[0117]上述“熒光標(biāo)記”只要是通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的標(biāo)記即可，沒有特別限定，可以從現(xiàn)有的熒光物質(zhì)、熒光蛋白等中適當(dāng)選擇。
[0118]在本說(shuō)明書中，上述“熒光物質(zhì)”特別是指非蛋白的低分子熒光化合物。只要是通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的物質(zhì)即可，對(duì)熒光物質(zhì)的種類沒有特別限定，例如可以列舉 Cy3、DyLight488、熒光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550、CF555 等。除此以夕卜，還可以列舉綠色熒光色素(例如Cy2、羅丹明綠色)、紅色熒光色素(例如羅丹明、Cy5、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、CF568、CF594、DY547)等，但本發(fā)明并不限于這些。這些熒光物質(zhì)可以單獨(dú)使用I種，也可以將多種組合使用。
[0119]另外，作為上述“熒光蛋白”，可以列舉綠色熒光蛋白(GFP)等。需要說(shuō)明的是，對(duì)上述“熒光蛋白”的來(lái)源沒有特別限定。
[0120]對(duì)捕集到濾器中的受檢物進(jìn)行石棉檢測(cè)時(shí)，需要將濾器透明化，因此此時(shí)使用的“熒光標(biāo)記”只要是經(jīng)過后述的透明化步驟后通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的標(biāo)記即可，沒有特別限定。從提高石棉的檢測(cè)靈敏度的觀點(diǎn)考慮，以透明化步驟前的熒光標(biāo)記發(fā)出的熒光的強(qiáng)度(熒光強(qiáng)度)為100%時(shí)，優(yōu)選使用經(jīng)過透明化步驟后的熒光標(biāo)記發(fā)出的熒光強(qiáng)度維持在優(yōu)選20%以上、更優(yōu)選50%以上、進(jìn)一步優(yōu)選80%以上的熒光標(biāo)記。
[0121]熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度可以利用公知的方法進(jìn)行測(cè)定。例如，通過測(cè)定亮度，可以評(píng)價(jià)熒光強(qiáng)度。具體而言，使用圖像分析軟件VH Analyzer (KEYENCE)測(cè)定亮度，可以算出熒光強(qiáng)度的維持率。通過使用具有所述熒光強(qiáng)度的熒光標(biāo)記，即使在經(jīng)過透明化步驟后，也可以高精度地檢測(cè)石棉。
[0122]經(jīng)過透明化步驟后通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的熒光標(biāo)記，可以從現(xiàn)有的熒光物質(zhì)、突光蛋白等中適當(dāng)選擇。例如，可以列舉Cy3、DyLight488、突光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550、CF555等，但本發(fā)明并不限于這些。這些熒光物質(zhì)可以單獨(dú)使用I種，也可以將多種組合使用。
[0123]即使是上述例示的以外的熒光標(biāo)記，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過確認(rèn)經(jīng)過透明化步驟后能否通過熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)熒光，可以容易地理解該熒光標(biāo)記是否是經(jīng)過透明化步驟后通過突光顯微鏡可以檢測(cè)突光的突光標(biāo)記。
[0124]上述熒光標(biāo)記只要通過符合該物質(zhì)的標(biāo)記方法與石棉結(jié)合蛋白結(jié)合即可。例如，可以使用用于標(biāo)記蛋白的市售試劑盒等來(lái)標(biāo)記石棉結(jié)合蛋白。
[0125]用熒光物質(zhì)標(biāo)記石棉結(jié)合蛋白時(shí)，可以利用化學(xué)鍵在石棉結(jié)合蛋白上標(biāo)記熒光物質(zhì)。
[0126]用熒光蛋白標(biāo)記石棉結(jié)合蛋白時(shí)，通過利用公知的基因工程學(xué)方法，可以使熒光蛋白與石棉結(jié)合蛋白的融合蛋白以重組蛋白的形式表達(dá)。此時(shí)，可以采用下述方法:制作將編碼石棉結(jié)合蛋白的基因和編碼熒光蛋白的基因進(jìn)行人工連接而得到的融合基因，將該融合基因插入表達(dá)載體的啟動(dòng)子的下游,再導(dǎo)入大腸桿菌等宿主細(xì)胞中使其表達(dá)。
[0127]由于石棉結(jié)合蛋白，有時(shí)熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白呈不溶性。認(rèn)為分子量變得過大也許是其原因之一。此時(shí)，使用分子量較小的熒光物質(zhì)作為熒光標(biāo)記是有效的。
[0128]為了進(jìn)一步提高石棉的檢測(cè)感度，作為熒光標(biāo)記，優(yōu)選熒光強(qiáng)度強(qiáng)、穩(wěn)定性高的物質(zhì)。通過使用這樣的熒光標(biāo)記，可以通過石棉的檢測(cè)感度，因此即使在受檢物中所含的石棉量少的情況下，也可以進(jìn)行石棉的檢測(cè)。
[0129]〔2.檢測(cè)步驟〕
[0130]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，檢測(cè)步驟的構(gòu)成如下:
[0131](i)第I檢測(cè)步驟，在經(jīng)過接觸步驟后(根據(jù)情況，在經(jīng)過透明化步驟后)，使用相差顯微鏡檢測(cè)受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)；以及
[0132](?)第2檢測(cè)步驟，使用熒光顯微鏡檢測(cè)與第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)結(jié)合的石棉結(jié)合蛋白。
[0133]在本說(shuō)明書中，將上述的第I檢測(cè)步驟和第2檢測(cè)步驟統(tǒng)稱為“檢測(cè)步驟”。本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法，根據(jù)需要可以無(wú)數(shù)次地切換相差顯微鏡和熒光顯微鏡以確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象。因此，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，可以至少重復(fù)進(jìn)行I次第I檢測(cè)步驟和第2檢測(cè)步驟。即，可以在第I檢測(cè)步驟后進(jìn)行第2檢測(cè)步驟，并再次進(jìn)行第I檢測(cè)步驟。
[0134]具體而言，例如，在第2檢測(cè)步驟后，再一次進(jìn)行第I檢測(cè)步驟，可以通過熒光顯微鏡再次確認(rèn)檢測(cè)到石棉結(jié)合蛋白的結(jié)合的纖維狀物質(zhì)的形狀(長(zhǎng)、寬、以及長(zhǎng)與寬的比例)。這樣，通過至少重復(fù)進(jìn)行I次第I檢測(cè)步驟和第2檢測(cè)步驟，可以更準(zhǔn)確地檢測(cè)石棉。
[0135]另外，例如，可以每檢測(cè)一種受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)就進(jìn)行第2檢測(cè)步驟，檢測(cè)與該纖維狀物質(zhì)結(jié)合的石棉結(jié)合蛋白，再次返回到第I檢測(cè)步驟，檢測(cè)受檢物中所含的其他纖維狀物質(zhì)。這樣，通過在第I檢測(cè)步驟中每檢測(cè)一種纖維狀物質(zhì)就進(jìn)行第2檢測(cè)步驟，可以在同一視野中高效率地檢測(cè)石棉。
[0136]這樣當(dāng)然可以，但在第I檢測(cè)步驟中，粗略地檢測(cè)完受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)后，對(duì)于檢測(cè)到的纖維狀物質(zhì)，可以進(jìn)行第2檢測(cè)步驟。
[0137]這樣，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，以在熒光顯微鏡下檢測(cè)后又一次在相差顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)的方式，根據(jù)需要可以無(wú)數(shù)次地切換相差顯微鏡和熒光顯微鏡以確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象，因此可以更準(zhǔn)確地檢測(cè)石棉。
[0138]但是，第2檢測(cè)步驟必須在第I檢測(cè)步驟之后進(jìn)行。通過在第I檢測(cè)步驟之后進(jìn)行第2檢測(cè)步驟，在第I檢測(cè)步驟中首先將用相差顯微鏡無(wú)法檢測(cè)的微細(xì)的石棉纖維排除在外，因此在第2檢測(cè)步驟中不可能將這樣的石棉纖維作為石棉來(lái)觀察。即，通過本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法最終檢測(cè)到的石棉總數(shù)不可能多于通過相差顯微鏡檢測(cè)同一樣品時(shí)檢測(cè)到的石棉總數(shù)。`
[0139]另外，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟在同一視野中進(jìn)行。
[0140]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，通過使用相差/熒光顯微鏡等作為顯微鏡，只需將光路從相差觀察用的透射光切換到落射熒光，即可不改變視野而進(jìn)行第I檢測(cè)步驟和第2檢測(cè)步驟。因此，通過在同一視野中進(jìn)行第I檢測(cè)步驟和第2檢測(cè)步驟，即在第I檢測(cè)步驟中，在相差顯微鏡下縮小檢測(cè)對(duì)象物后，只需在此狀態(tài)下直接將顯微鏡的光路從相差模式切換成熒光模式，不改變視野，即可進(jìn)行第2檢測(cè)步驟。由此，對(duì)于第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)，可以立即判別每一個(gè)纖維狀物質(zhì)是否是石棉。
[0141]這里，對(duì)“第I檢測(cè)步驟”和“第2檢測(cè)步驟”進(jìn)行說(shuō)明。
[0142](2-1.第I檢測(cè)步驟)
[0143]“第I檢測(cè)步驟”是指，在經(jīng)過接觸步驟后(根據(jù)情況，經(jīng)過透明化步驟后)，使用相差顯微鏡檢測(cè)受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)的步驟。
[0144]這里，上述“纖維狀物質(zhì)”只要是具有纖維狀的部分的物質(zhì)即可，可以是纖維狀部分分枝出來(lái)的物質(zhì)，也可以是在纖維狀部分附著顆粒的物質(zhì)。上述“纖維狀物質(zhì)”的判斷標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)節(jié)記載在“石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(卜? 二夕'J >夕'' 7 二 Λ Τ?)(第4.0版)”(非專利文獻(xiàn)I)中。
[0145]在第I檢測(cè)步驟中，只要根據(jù)相差顯微鏡法中的纖維狀物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)上述“纖維狀物質(zhì)”即可。與相差顯微鏡法中的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)一致的纖維狀物質(zhì)是指，例如滿足長(zhǎng)5μπι以上、寬不足3μπκ且長(zhǎng)與寬的比例為3:1以上的條件的纖維狀物質(zhì)(參照“石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(7 X 7卜? 二夕U >夕'' 7 二二 7?)(第4.0版)”(非專利文獻(xiàn)I))。即，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，根據(jù)現(xiàn)行的相差顯微鏡法中的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，在第I檢測(cè)步驟中，優(yōu)選檢測(cè)長(zhǎng)5μπι 以上、寬不足3μπκ且長(zhǎng)與寬的比例為3:1以上的纖維狀物質(zhì)。
[0146]這里，纖維狀物質(zhì)的“長(zhǎng)度”例如使用安裝在接眼透鏡上的目鏡分劃板的刻度可以比較容易地進(jìn)行判斷，但纖維狀物質(zhì)的“長(zhǎng)度”的判定方法并不限于此。
[0147]纖維狀物質(zhì)的“寬”也可說(shuō)成是纖維狀物質(zhì)的“直徑”。上述“直徑”是指纖維狀物質(zhì)所內(nèi)切的圓的直徑。纖維狀物質(zhì)的“寬”例如利用安裝在接眼透鏡上的目鏡分劃板的刻度可以比較容易地進(jìn)行判斷，但纖維狀物質(zhì)的“寬”的判定方法并不限于此。
[0148]纖維狀物質(zhì)的“長(zhǎng)與寬的比例”也可說(shuō)成是纖維狀物質(zhì)的“長(zhǎng)徑比”。
[0149]關(guān)于纖維狀物質(zhì)的“長(zhǎng)”、“寬”和“長(zhǎng)與寬的比例”，在“石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(了 K”:e 二夕U 7 二二 (第4.0版)”(非專利文獻(xiàn)I)中有詳細(xì)的規(guī)定，按照該文獻(xiàn)中規(guī)定的方法，可以進(jìn)行纖維狀物質(zhì)的“長(zhǎng)”、“寬”和“長(zhǎng)與寬的比例”的判定。
[0150]但是，本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中的纖維狀物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并不限于上述標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)變更相差顯微鏡法中的纖維狀物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，也可以根據(jù)變更后的相差顯微鏡法中的纖維狀物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)纖維狀物質(zhì)即可。這樣，在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，在第I檢測(cè)步驟中，根據(jù)相差顯微鏡法中的纖維狀物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)纖維狀物質(zhì)，因此不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即可檢測(cè)石棉。
[0151]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，首先，在第I檢測(cè)步驟中，通過在相差顯微鏡下從捕集到濾器中的受檢物中檢測(cè)規(guī)定的纖維狀物質(zhì)，縮小在接下來(lái)的第2檢測(cè)步驟中檢測(cè)的對(duì)象物，因此在采用生物熒光法的第2檢測(cè)步驟中，不可能檢測(cè)出通過相差顯微鏡-電子顯微鏡法無(wú)法檢測(cè)的微細(xì)的石棉纖維。即，通過本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法最終檢測(cè)到的石棉總數(shù)不會(huì)多于按照相差顯微鏡-電子顯微鏡法檢測(cè)同一樣品時(shí)檢測(cè)到的石棉總數(shù)。因此，不改變現(xiàn)有方法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即可檢測(cè)石棉。
[0152](2-2.第2檢測(cè)步驟)
[0153]“第2檢測(cè)步驟”是使用熒光顯微鏡檢測(cè)與第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)結(jié)合的石棉結(jié)合蛋白的步驟。
[0154]在第2檢測(cè)步驟中，使用熒光顯微鏡檢測(cè)石棉結(jié)合蛋白所帶有的熒光標(biāo)記，從而可以容易地檢測(cè)與第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)結(jié)合的石棉結(jié)合蛋白。即，在第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)中，若在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)到熒光，則可以判斷為該纖維狀物質(zhì)中結(jié)合有石棉結(jié)合蛋白，若無(wú)法確認(rèn)到熒光，則可以判斷為該纖維狀物質(zhì)中沒有結(jié)合石棉結(jié)合蛋白。而且，可以判斷石棉結(jié)合蛋白所結(jié)合的纖維狀物質(zhì)是石棉，并可以判斷石棉結(jié)合蛋白未結(jié)合的纖維狀物質(zhì)不是石棉。
[0155]對(duì)使用熒光顯微鏡的熒光標(biāo)記的檢測(cè)方法沒有特別限定，只要在適當(dāng)研究符合該熒光標(biāo)記的檢測(cè)方法(激發(fā)波長(zhǎng)等)后采用優(yōu)選的條件即可。
[0156]對(duì)用于進(jìn)行各檢測(cè)步驟的相差顯微鏡和熒光顯微鏡的構(gòu)成沒有特別限定，例如，通過使用具備相差顯微鏡用電容器和落射熒光裝置的顯微鏡(相差/熒光顯微鏡)或者具備兩者的偏光顯微鏡作為顯微鏡，只需將光路從相差觀察用的透射光切換到落射熒光，即可不改變視野而進(jìn)行各檢測(cè)步驟。即，通過使用相差/熒光顯微鏡這樣的顯微鏡，在第I檢測(cè)步驟中，在相差顯微鏡下縮小檢測(cè)對(duì)象物后，只要在此狀態(tài)下直接將顯微鏡的光路從相差模式切換成熒光模式，即可進(jìn)行第2檢測(cè)步驟。由此，在第2檢測(cè)步驟中，對(duì)于第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的纖維狀物質(zhì)，立即可以判別每一個(gè)纖維狀物質(zhì)是否是石棉。
[0157]〔3.透明化步驟〕
[0158]“透明化步驟”是將經(jīng)過接觸步驟后的濾器透明化的步驟。通過在透明化步驟中將濾器透明化，當(dāng)受檢物被捕集到濾器中時(shí)，在接下來(lái)的第I檢測(cè)步驟中，可以在相差顯微鏡下檢測(cè)受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)。因此，濾器的透明化(無(wú)色化)方法只要是能夠?qū)V器透明化至在接下來(lái)的第I檢測(cè)步驟中在相差顯微鏡下可以檢測(cè)纖維狀物質(zhì)的程度的方法即可，沒有特別限定。例如，可以列舉向?yàn)V器噴灑丙酮蒸氣直至濾器變得透明的方法。該方法具體記載在“石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(7 ^ 卜? 二夕U二二 7 (第4.0版)”(非專利文獻(xiàn)I)中。作為其他的透明化方法，可以列舉使用DMF溶液[35%的DMF (二甲基甲酰胺)、50%的水、15%的乙酸]的方法。該方法具體記載在“石棉監(jiān)測(cè)手冊(cè)(7 ^ 卜? 二夕U)"二 H (第4.0版)”(非專利文獻(xiàn)I)中。
[0159]需要說(shuō)明的是，經(jīng)過透明化步驟后，捕集到濾器中的受檢物處于無(wú)法與石棉結(jié)合蛋白接觸的狀態(tài)，因此進(jìn)行透明化步驟時(shí)，必須在接觸步驟之后進(jìn)行透明化步驟。
[0160]〔4.其他〕
[0161]本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法可以包含上述步驟以外的步驟。例如，在接觸步驟前，可以包含用濾器過濾測(cè)定環(huán)境中的空氣以捕集受檢物的捕集步驟。另外，還可以包含根據(jù)通過一系列的檢測(cè)步驟得到的結(jié) 果，算出受檢物中的石棉濃度的步驟或算出測(cè)定環(huán)境中的石棉濃度的步驟。
[0162]如上所述，根據(jù)本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法，不改變現(xiàn)有方法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，可以更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉。
[0163]本發(fā)明還可以如下構(gòu)成。
[0164]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，優(yōu)選進(jìn)一步包括透明化步驟，即，將上述受檢物捕集到濾器中，并將經(jīng)過上述接觸步驟后的上述濾器透明化，并且在經(jīng)過上述透明化步驟后進(jìn)行上述第I檢測(cè)步驟。
[0165]如上所述，本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法，其特征在于:為了檢測(cè)石棉而將相差顯微鏡和熒光顯微鏡組合使用，更具體而言，在第I檢測(cè)步驟中，首先，在相差顯微鏡下檢測(cè)規(guī)定的纖維狀物質(zhì)，之后對(duì)于所述的纖維狀物質(zhì)在第2檢測(cè)步驟中進(jìn)行生物熒光法，但是當(dāng)為檢測(cè)大氣中的石棉的情形等、受檢物被捕集到濾器中的情形時(shí)，通過在透明化步驟中將捕集到受檢物的濾器透明化，可以將相差顯微鏡和熒光顯微鏡組合使用。所述透明化步驟必須在上述接觸步驟之后進(jìn)行。這是由于經(jīng)過透明化步驟后的濾器無(wú)法使溶液通過，無(wú)法進(jìn)行濾器的清洗，因此無(wú)法充分進(jìn)行接觸步驟的緣故。
[0166]因此，當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，可以更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)大氣中的石棉。
[0167]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，優(yōu)選至少重復(fù)進(jìn)行I次上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟。
[0168]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，根據(jù)需要可以無(wú)數(shù)次地切換相差顯微鏡和熒光顯微鏡以確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象。因此，以在熒光顯微鏡下的檢測(cè)后又一次在相差顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)的方式，根據(jù)需要可以無(wú)數(shù)次地切換相差顯微鏡和熒光顯微鏡以確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象。其結(jié)果，可以更準(zhǔn)確地檢測(cè)石棉。
[0169]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，在上述第I檢測(cè)步驟中，優(yōu)選檢測(cè)長(zhǎng)5 μ m以上、寬不足3μπκ且長(zhǎng)與寬的比例為3:1以上的纖維狀物質(zhì)。
[0170]當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，按照現(xiàn)行的相差顯微鏡法的標(biāo)準(zhǔn)，在第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)長(zhǎng)5 μ m以上、寬不足3 μ m、且長(zhǎng)與寬的比例為3:1以上的纖維狀物質(zhì)，因此通過本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法最終檢測(cè)到的石棉總數(shù)不可能多于通過相差顯微鏡檢測(cè)同一樣品時(shí)檢測(cè)到的石棉總數(shù)。因此，不改變現(xiàn)行的相差顯微鏡-電子顯微鏡法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，即可檢測(cè)石棉。
[0171]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，優(yōu)選上述石棉結(jié)合蛋白是經(jīng)過上述透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合的蛋白，且上述熒光標(biāo)記為經(jīng)過上述透明化步驟后通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的標(biāo)記，
[0172]當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，即使在經(jīng)過透明化步驟后，也可以高精度地檢測(cè)石棉。
[0173]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，上述石棉結(jié)合蛋白可以是選自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一種以上的蛋白。
[0174]當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，即使在經(jīng)過透明化步驟后，也可以高精度地檢測(cè)石棉。
[0175]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，上述熒光標(biāo)記可以是選自Cy3、DyLight488、熒光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550、CF555 的一種以上的熒光物質(zhì)。
[0176]當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，即使在經(jīng)過透明化步驟后，也可以高精度地檢測(cè)石棉。
[0177]在本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法中，上述石棉結(jié)合蛋白優(yōu)選為選自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一種以上的蛋白的多聚物。
[0178]由于石棉結(jié)合蛋白為多聚蛋白，因此與經(jīng)由I個(gè)蛋白與石棉結(jié)合時(shí)相比，可以使石棉與石棉結(jié)合蛋白的結(jié)合力變得更強(qiáng)。因此，當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，即使在經(jīng)過透明化步驟后，也可以高感度地檢測(cè)石棉。
[0179]本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法可以是如下的構(gòu)成:在上述接觸步驟中，使作為上述石棉結(jié)合蛋白的兩種以上的不同的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸，上述兩種以上的不同的石棉結(jié)合蛋白是與互不相同的種類的石棉特異性結(jié)合的蛋白，并且可以帶有發(fā)出互不相同的波長(zhǎng)的突光的突光標(biāo)記。
[0180]當(dāng)為上述構(gòu)成時(shí)，根據(jù)熒光的顏色的不同，可以容易地判別不同種類的石棉。
[0181]本發(fā)明并不限于上述各實(shí)施方式，在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)可以進(jìn)行各種變更，關(guān)于將不同實(shí)施方式中分別公開的技術(shù)手段適當(dāng)組合得到的實(shí)施方式，也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0182]實(shí)施例
[0183]以下，通過實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受實(shí)施例的限定。
[0184]〔實(shí)施例1:石棉結(jié)合蛋白H-NS6ch9ci的制備和熒光標(biāo)記〕
[0185]利用生物素-鏈霉親和素(str印tavidin)相互作用，使生物素修飾的石棉結(jié)合蛋白與熒光標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，制作熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白。[0186]首先,制作生物素化的石棉結(jié)合蛋白。以蛋白表達(dá)載體pET21_b (Novagen公司)為模板，使用寡核苷酸引物 Pl (GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACACCACCACCACCACCACTGAACTA:SEQ ID NO:1)和寡核苷酸引物 P2 (CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC:SEQ ID NO:2)進(jìn)行反向PCR，由此在pET21_b的HisTag前插入生物素化尾端。反向PCR反應(yīng)使用KOD-plus-誘變?cè)噭┖?TOYOBO公司)，按照該公司的方案來(lái)進(jìn)行。將該生物素化蛋白表達(dá)載體命名為“pET21-AviTag-C”。
[0187]接著，以大腸桿菌K-12 株(Escherichia coli K12, ATCC700926)的基因組 DNA 為模板，使用寡核苷酸引物P3 (CATATGCAATATCGCGAAATGCTGATC:SEQ ID NO: 3)和寡核苷酸引物 P4 (GGATCCAAACAACGTTTAGCTTTGGTGCC:SEQ ID N0:4)進(jìn)行 PCR，從而擴(kuò)增編碼作為石棉結(jié)合蛋白的H-NS蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank，檢索號(hào):AAC74319)的第60位~第90位的氨基酸區(qū)(SEQ ID N0:8)的基因。PCR反應(yīng)使用KOD-plus Neo DNA聚合酶(TOYOBO公司)，按照該公司的方案來(lái)進(jìn)行。
[0188]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和生物素化蛋白表達(dá)載體pET21-AviTag-C用限制酶NdeI和BamHI在37°C下處理I小時(shí)，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)于從凝膠中切出的DNA片段，使用Ligation High (TOYOBO公司)在16°C下連接30分鐘，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109株中。從得到的集落中提取插入有目標(biāo)DNA片段的質(zhì)粒，將其命名為“pET-H-NS6(l_9(l-AViTag-C”。
[0189]使用2XYT培養(yǎng)基，將用pET-H-NS6Q_9Q-AViTag-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)pBirA (Novagen公司)在37°C下培養(yǎng)一夜，以1% (v/v)接種在200ml的TYH培養(yǎng)基[20g/I的胰蛋白胨、10g/l的酵母提取 物、llg/1的HEPES、5g/l的NaClUg/Ι的硫酸鎂、0.5%的葡萄糖、用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至PH7.2~7.4]中。在37 °C下培養(yǎng)直至0D_達(dá)到0.6，之后添加IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷，isopropyl- β -D-thioglactopyranoside)(終濃度為0.5mM)和D-生物素(終濃度為10(^10，在281:下培養(yǎng)4小時(shí)。通過離心分離培養(yǎng)液來(lái)集菌。
[0190]向得到的菌體團(tuán)塊中加入IOml的緩沖液A[0.05M的Tris-HCl (pH8.3),0.05M的NaCl、10%的甘油]進(jìn)行懸浮，通過超聲波進(jìn)行破碎。將得到的細(xì)胞破碎液供給Histrap FF柱(GE Healthcare Bioscience公司),使C末端具有組氨酸的生物素化H-NS6chxi蛋白吸附在該柱上，用緩沖液B[0.05M的Tris-HCl (pH8.3),0.05M的NaCl,10%的甘油、0.5M的咪唑]洗脫。對(duì)于取得的生物素化H-NS6chxi蛋白，通過聚丙烯酰胺電泳確認(rèn)純度時(shí)，純度為95%以上。
[0191]接下來(lái)，進(jìn)行石棉結(jié)合蛋白(H-NS6tl,蛋白)的熒光標(biāo)記。進(jìn)行熒光修飾時(shí)，利用生物素-鏈霉親和素的相互作用，使熒光標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素修飾的石棉結(jié)合蛋白結(jié)合。將2.7 μ I的生物素化H-NS6ch9ci蛋白(495 μ Μ)和4 μ I的熒光修飾鏈霉親和素溶液(lmg/ml)混合，在室溫下培養(yǎng)I小時(shí)使之結(jié)合，對(duì)H-NS6ch9ci蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記。通過該操作，得到H-NS6ch9ci蛋白與熒光標(biāo)記鏈霉親和素的復(fù)合體。將使用經(jīng)熒光色素Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素(invitrogen公司)進(jìn)行了熒光修飾的H-NS6chxi蛋白命名為“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素_Cy3”，將使用經(jīng)突光色素DyLight488標(biāo)記的鏈霉親和素(Thermo Scientific公司)進(jìn)行了突光修飾的H-NS6chxi蛋白命名為“H-NS6(i_9(1-鏈霉親和素-DyLight488”，將使用經(jīng)熒光色素DyLight550標(biāo)記的鏈霉親和素(Thermo Scientific公司)進(jìn)行了突光修飾的H-NS6chx!蛋白命名為“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素_DyLight550”，將使用經(jīng)熒光色素CF555標(biāo)記的鏈霉親和素(Biotium公司)進(jìn)行了熒光修飾的H-NS6ch9ci蛋白命名為“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素-CF555”，將使用經(jīng)熒光色素CF488A標(biāo)記的鏈霉親和素(Biotium公司)進(jìn)行了熒光修飾的H-NS6ch9q蛋白命名為“H-NS6ch9q-鏈霉親和素-CF488A”。
[0192]需要說(shuō)明的是，“H-NS6tl,-鏈霉親和素_Cy3”、“H-NS6chx1-鏈霉親和素-DyLight488”、“H-NS6ch90-鏈霉親和素-DyLight550”、“H-NS6ch90-鏈霉親和素-CF555，，和“H-NS6Q_9Q-鏈霉親和素-CF488A”由于利用鏈霉親和素與石棉結(jié)合蛋白的融合蛋白，因此通過鏈霉親和素的作用形成四聚體。即，“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素-Cy3”、“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素-DyLight488”、“H-NS6ch90-鏈霉親和素-DyLight550”、“H-NS6ch90-鏈霉親和素-CF555，，和"H-NS60^90-鏈霉親和素-CF488A”是將4個(gè)H-NS6chxi蛋白聚合的四聚體蛋白用熒光色素進(jìn)行標(biāo)記的。
[0193]〔實(shí)施例2:利用相差熒光法進(jìn)行的石棉顯微鏡觀察(I)〕
[0194]將捕集了作為受檢物的鐵石棉(茶石棉)(JAWE231)的薄膜濾器切成1/8片，將捕集面朝上，滴加3次20 μ I的緩沖液C[0.3Μ的磷酸緩沖液(pH8.0),0.3M的NaCU0.5%的Tween80 (注冊(cè)商標(biāo))]。
[0195]然后，滴加5次20 μ I的含有作為熒光蛋白的H-NS6ch9c1-鏈霉親和素_Cy3(12.5nM)、H-NS6chx1-鏈霉親和素 _DyLight488 (50nM)、H-NS60^90-鏈霉親和素 _DyLight550(12.5nM)、H-NS6chx1-鏈霉親和素-CF555 (12.5nM)或 H-NS6chx1-鏈霉親和素-CF488A (50nM)的緩沖液C，使熒光蛋白與鐵石棉結(jié)合。之后，滴加3次20 μ I的緩沖液C，以除去未結(jié)合的熒光蛋白。最后，滴加3次20 μ I的水，除去來(lái)自緩沖液的表面活性劑或鹽。
[0196]接著，將濾器捕集面朝上放在載玻片(MATSUNAMI制、MICRO SLIDE GLASS白緣磨，Imm厚)上，使其充分干燥。干燥后，捕集面朝上沐浴丙酮蒸氣，以將濾器透明化，之后將封入液夾在蓋玻片(MATSUNAMI制、18 X 18mm)與濾器之間，得到觀察用的標(biāo)本。
[0197]使用相差/熒光顯微鏡(落射熒光顯微鏡BX-60、奧林巴斯公司制)觀察所得的標(biāo)本。首先，用相差顯微鏡進(jìn)行觀察，確認(rèn)鐵石棉纖維后，將光路切換成熒光模式，觀察相同的視野。
[0198]圖1是顯示相差熒光法的石棉的顯微鏡觀察結(jié)果的圖。圖1 (A)表示使用“H-NS6(I_9(1-鏈霉親和素-Cy3”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果，圖1 (B)表示使用“H-NS6(I_9(1-鏈霉親和素_DyLight488”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果，圖1 (C)表示使用“H-NS6(I_9(1-鏈霉親和素_DyLight550”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果，圖1 (D)表示使用“H-NS6ch9q-鏈霉親和素-CF555”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果，圖1 (E)表示使用“H-NS6chx1-鏈霉親和素-CF488A”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果。在圖1 (A)~(E)的各圖中，左圖表示相差顯微鏡圖像，右圖表示與相差顯微鏡圖像在同一視野中的熒光顯微鏡圖像。如圖1所示，在相差顯微鏡下觀察的鐵石棉纖維中，在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)到熒光蛋白的結(jié)合。
[0199]需要說(shuō)明的是，在熒光色素Cy3、DyLight550和CF555的觀察中，使用U-MNG立方體(二向色鏡:DM570、激發(fā)濾光片:BP530-550、吸收濾光片:BA590)，在熒光色素DyLight488和CF488A的觀察中，使用U-NIBA立方體(二向色鏡:DM505、激發(fā)濾光片:BP470-490、吸收濾光片:BA515-550)。圖像的采集使用顯微鏡數(shù)碼相機(jī)DP_70(奧林巴斯公司制)。
[0200]需要說(shuō)明的是，透明化步驟前后的纖維的熒光強(qiáng)度(=蛋白結(jié)合量+熒光物質(zhì)強(qiáng)度)通過測(cè)定亮度來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體而言，在透明化步驟前后使用圖像分析軟件VHAnalyzer (KEYENCE)測(cè)定圖像中的纖維的亮度，算出熒光強(qiáng)度的維持率。其結(jié)果，以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素_Cy3”在經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持90%。以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素-DyLight488”在經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持90%。以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，"H-NS6Q_9(l-Neutravidin-DyLight550”在經(jīng)過透明化步驟后的突光強(qiáng)度維持80%。以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，“H-NS6ch9c1-鏈霉親和素-CF555”在經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持80%。以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，“H-NS6chx1-鏈霉親和素-CF488A”在經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持90%。
[0201 ] 由以上的結(jié)果確認(rèn):通過使用H-NS6ch9ci蛋白作為石棉結(jié)合蛋白、使用Cy 3、DyLight488、DyLight550、CF555或CF488A作為熒光標(biāo)記，在相差熒光法中能夠檢測(cè)鐵石棉。
[0202]〔實(shí)施例3:利用相差熒光法進(jìn)行的石棉顯微鏡觀察(2)〕
[0203]除了使用捕集了作為受檢物的鐵石棉(茶石棉)(JAWE231)和巖棉(JFM標(biāo)準(zhǔn)纖維樣品)的薄膜濾器、并只使用“H-NS6(i_9(1-鏈霉親和素-Cy3”作為熒光法蛋白以外，利用與實(shí)施例2相同的方法制作標(biāo)本。
[0204]使用相差/熒光顯微鏡(落射熒光顯微鏡BX-60、奧林巴斯公司制)觀察所得的標(biāo)本。首先，用相差顯微鏡進(jìn)行觀察，確認(rèn)纖維狀物質(zhì)后，將光路切換成熒光模式，觀察相同的視野。
[0205]圖2是顯示相差熒光法的石棉的顯微鏡觀察結(jié)果的圖。圖2 (A)表示相差顯微鏡圖像，(B)表示與(A)的相差顯微鏡圖像在同一視野中的熒光顯微鏡圖像，(C)表示將(A)的相差顯微鏡圖像和(B)的熒光顯微鏡圖像疊加的圖。如圖2所示，在相差顯微鏡下觀察的纖維狀物質(zhì)2和3中，在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)熒光蛋白的結(jié)合。而在相差顯微鏡下觀察的纖維狀物質(zhì)I和4中，在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)熒光蛋白的結(jié)合。其結(jié)果，判定纖維狀物質(zhì)2和3是石棉，判定纖維狀物質(zhì)I和4不是石棉。
[0206]由以上的結(jié)果確認(rèn):采用相差熒光法時(shí)，能夠非常高效地、簡(jiǎn)便且高精度地判定在相差顯微鏡下觀察的纖維狀物質(zhì)是否是石棉。
[0207]〔實(shí)施例4:石棉結(jié)合蛋白DksA的制備和熒光標(biāo)記〕
[0208]接著，以大腸桿菌K-12 株(Escherichia coli K12，ATCC700926)的基因組 DNA 為模板，使用寡核苷酸引物 P5 (GGAATTCGCTAGCATGCAA—GAAGGGCAAAACCG:SEQ ID NO: 5)和寡核苷酸引物 P6(GTTGGATCCCCGCAGCCAGCCATCTGTTTTTCGC:SEQ ID NO: 6)進(jìn)行 PCR，從而擴(kuò)增編碼作為石棉結(jié)合蛋白的DksA蛋白(數(shù)據(jù)庫(kù)名=GenBank，檢索號(hào):AAC73256)的基因。PCR反應(yīng)使用KOD-plus DNA聚合酶(TOYOBO公司)，按照該公司的方案來(lái)進(jìn)行。
[0209]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和蛋白表達(dá)載體pET21_b用限制酶NheI和BamHI在37°C下處理I小時(shí)，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用Ligation High，將從凝膠中切出的DNA片段在16°C下連接30分鐘，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109株中。從得到的集落中提取插入有目標(biāo)DNA片段的質(zhì)粒，將其命名為“ ρΕΤ-DksA ”。
[0210]使用2XYT 培養(yǎng)基，將用 pET-DksA 轉(zhuǎn)化的 Rosetta? (DE3) pLysS (Novagen 公司)在37°C下培養(yǎng)一夜，以1% (v/v)接種在200ml LB培養(yǎng)基[10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物、5g/l的NaCl]中。在37 °C下培養(yǎng)直至0D_達(dá)到0.6，之后添加IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)使終濃度達(dá)到0.5mM,在28°C下培養(yǎng)4小時(shí)。通過離心分離培養(yǎng)液來(lái)集菌。在得到的菌體團(tuán)塊中加入IOml緩沖液A[0.05M的Tris-HCl (pH8.3)、
0.05M的NaCl、10%的甘油]進(jìn)行懸浮，通過超聲波進(jìn)行破碎。
[0211]將得到的細(xì)胞破碎液供給Histrap FF柱，使C末端具有組氨酸的DksA蛋白吸附在該柱上，用緩沖液B[0.05M的Tris-HCl (pH8.3),0.05M的NaCl,10%的甘油、0.5M的咪唑]洗脫。對(duì)于得到的DksA蛋白，通過聚丙烯酰胺電泳確認(rèn)純度時(shí)，純度為95%以上。
[0212]接下來(lái),進(jìn)行DksA蛋白的突光標(biāo)記。首先，用突光素標(biāo)記DksA蛋白。將5nmol的DksA蛋白溶解于400 μ I的包含50mM的NaCl和10%甘油的25mM的HEPES-NaOH緩沖液(PH7.4)中。在上述溶液中添加4.3μ 110mg/ml的熒光素_5_馬來(lái)酰亞胺(ThermoScientfic公司)/二甲基甲酰胺，之后在暗處、于室溫下靜置2小時(shí)。上述的反應(yīng)溶液經(jīng)凝膠過濾除去未結(jié)合的熒光素來(lái)進(jìn)行純化。將該用熒光素標(biāo)記的DksA命名為“DksA-熒光素”。
[0213]接下來(lái)，用Alexa488標(biāo)記DksA。將5nmol的DksA蛋白溶解于400 μ I包含50mM的NaCl和10%甘油的25mM的HEPES-NaOH緩沖液(pH7.4)中。在上述溶液中添加6.4 μ 11Omg/ml的Alexa488_5_馬來(lái)酰亞胺(invitrogen公司)/ 二甲基甲酰胺，之后在暗處、于室溫下靜置2小時(shí)。上述反應(yīng)溶液經(jīng)凝膠過濾除去未結(jié)合的Alexa488來(lái)進(jìn)行純化。將該用Alexa488標(biāo)記的DksA蛋白命名為“DksA-Alexa488”。
[0214]〔實(shí)施例5:利用相差熒光法進(jìn)行的石棉顯微鏡觀察(3)〕
[0215]除了使用捕集了作為受檢物的溫石棉(白石棉)(JAWE111)的薄膜濾器、使用DksA-熒光素(350nM)或DksA-Alexa488 (200nM)作為熒光法蛋白、并使用緩沖液D[0.1M的碳酸緩沖液(PH9.4)、1.0%的TWeen80 (注冊(cè)商標(biāo))]作為緩沖液以外，按照與實(shí)施例2相同的方法制作標(biāo)本。
[0216]使用相差/熒光顯微鏡(落射熒光顯微鏡BX-60、奧林巴斯公司制)觀察得到的標(biāo)本。首先，用相差顯微鏡進(jìn)行觀察，確認(rèn)溫石棉纖維后，將光路切換成熒光模式，觀察相同視野。
[0217]圖3是顯示相差熒光法的石棉的顯微鏡觀察結(jié)果的圖。圖3(A)表示使用“DksA-熒光素”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果，圖3 (B)表示使用“DksA-AleXa488”作為熒光蛋白時(shí)的結(jié)果。在圖3 (A)和(B)的各圖中，左圖表示相差顯微鏡圖像，右圖表示與相差顯微鏡圖像在同一視野中的熒光顯微鏡圖像。如圖3所示，在相差顯微鏡下觀察的溫石棉纖維中，在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)熒光蛋白的結(jié)合。
[0218]關(guān)于物質(zhì)1，如圖3 (A)所示，在相差顯微鏡下可以確認(rèn)到纖維，進(jìn)一步在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)到熒光蛋白的結(jié)合。而關(guān)于物質(zhì)2，如圖3 (A)所示，在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)到熒光蛋白的結(jié)合，但由于是寬(直徑)不足0.25 μ m的微細(xì)纖維，所以通常在相差顯微鏡下不能作為石棉而被檢測(cè)出來(lái)。在相差熒光法中，由于在相差顯微鏡下檢測(cè)規(guī)定的纖維狀物質(zhì)的第I檢測(cè)步驟中將這樣的微細(xì)石棉纖維排除在外，所以象物質(zhì)2這樣的不能作為石棉而被相差顯微鏡檢測(cè)出來(lái)的纖維不可能包含在最終檢測(cè)到的石棉總數(shù)中。
[0219]需要說(shuō)明的是,在突光色素突光素和突光色素Alexa488的觀察中，使用U-NIBA立方體(二向色鏡:DM505、激發(fā)濾光片:BP470-490、吸收濾光片:BA515_550)。圖像的采集使用顯微鏡數(shù)碼相機(jī)DP-70 (奧林巴斯公司制)。
[0220]需要說(shuō)明的是，按照與實(shí)施例2相同的方法，評(píng)價(jià)透明化步驟前后的纖維的熒光強(qiáng)度(=蛋白結(jié)合量+熒光物質(zhì)強(qiáng)度)時(shí)，在以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%的情況下，“DksA-熒光素”經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持80%。另外，以透明化步驟前的熒光強(qiáng)度為100%時(shí)，“DksA-Alexa488”經(jīng)過透明化步驟后的熒光強(qiáng)度維持80%。
[0221]由以上的結(jié)果確認(rèn):通過使用DksA蛋白作為石棉結(jié)合蛋白、并使用熒光素和Alexa488作為突光標(biāo)記,在相差突光法中可以檢測(cè)溫石棉。
[0222]產(chǎn)業(yè)實(shí)用件
[0223]如上所述，根據(jù)本發(fā)明的石棉檢測(cè)方法，不改變相差顯微鏡-電子顯微鏡法等現(xiàn)有方法的石棉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，與相差顯微鏡-電子顯微鏡法相比，可以更有效率地、簡(jiǎn)便且高精度地檢測(cè)石棉。因此，本發(fā)明作為應(yīng)對(duì)石棉的檢測(cè)要求迅速性的解體現(xiàn)場(chǎng)等中的石棉風(fēng)險(xiǎn)的手段極為重要。
[0224]因此，本發(fā)明可以在使用石棉的產(chǎn)業(yè)、進(jìn)行石棉檢測(cè)的產(chǎn)業(yè)等各種廣泛的產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種石棉檢測(cè)方法，其特征在于，包括下述步驟: 接觸步驟，使帶有熒光標(biāo)記的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸； 第I檢測(cè)步驟，在經(jīng)過上述接觸步驟后，使用相差顯微鏡檢測(cè)上述受檢物中所含的纖維狀物質(zhì)；以及 第2檢測(cè)步驟，使用熒光顯微鏡檢測(cè)與上述第I檢測(cè)步驟中檢測(cè)的上述纖維狀物質(zhì)結(jié)合的上述石棉結(jié)合蛋白，其中 上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟在同一視野中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于: 上述受檢物被捕集到濾器中， 進(jìn)一步包含透明化步驟，該步驟將經(jīng)過上述接觸步驟后的上述濾器透明化，并且 在經(jīng)過上述透明化步驟后進(jìn)行上述第I檢測(cè)步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于:至少重復(fù)進(jìn)行I次上述第I檢測(cè)步驟和上述第2檢測(cè)步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于:在上述第I檢測(cè)步驟中，檢測(cè)長(zhǎng)5μπι以上、寬不足3μπκ且長(zhǎng)與寬的比例為3:1以上的纖維狀物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2?4中任一項(xiàng)所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于: 上述石棉結(jié)合蛋白是經(jīng)過上述透明化步驟后維持與石棉的結(jié)合的蛋白， 上述熒光標(biāo)記是經(jīng)過上述透明化步驟后通過熒光顯微鏡可以檢測(cè)熒光的標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于:上述石棉結(jié)合蛋白是選自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一種以上的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于:上述熒光標(biāo)記是選自Cy3、DyLight488、熒光素、Alexa488、ATT0488、CF488A、DyLight550 和 CF555 的一種以上的熒光物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于:上述石棉結(jié)合蛋白是選自H-NS蛋白、DksA蛋白和GatZ蛋白的一種以上的蛋白的多聚體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的石棉檢測(cè)方法，其特征在于: 在上述接觸步驟中，使作為上述石棉結(jié)合蛋白的兩種以上的不同的石棉結(jié)合蛋白與受檢物接觸， 上述兩種以上的不同的石棉結(jié)合蛋白是與互不相同的種類的石棉特異性結(jié)合的蛋白，并且?guī)в邪l(fā)出互不相同的波長(zhǎng)的熒光的熒光標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103733048SQ201280039165
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月12日
【發(fā)明者】黑田章夫, 石田丈典, 西村智基 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人廣島大學(xué)