目標(biāo)粒子的檢測方法
【專利摘要】該目標(biāo)粒子的檢測方法具有：(a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、和與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的1種或2種以上的發(fā)光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每1分子前述目標(biāo)粒子與2分子以上的前述發(fā)光探針結(jié)合的工序；和(b)以每1粒子的光信號的強(qiáng)度作為指標(biāo)通過掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)算工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)的工序；前述發(fā)光探針為結(jié)合有同種發(fā)光物質(zhì)的1種或2種以上的探針。
【專利說明】目標(biāo)粒子的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測到來自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)來檢測被發(fā)光探針標(biāo)記的粒子的方法。本申請基于2011年8月11日在日本提交的日本特愿2011-175862號主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著近年來光學(xué)測量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術(shù)，能夠檢測/測定單光子或單分子熒光的微弱光。提出了使用前述微弱光的檢測技術(shù)，進(jìn)行生物分子等分子間相互作用或者結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測的各種裝置或方法。提出有例如，熒光相關(guān)光譜分析(FluorescenceCorrelation Spectroscopy:FCS。例如,參照專利文獻(xiàn)1、2和非專利文獻(xiàn)I?3)。上述方法中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測定來自在試樣溶液中的微小區(qū)域(顯微鏡的激光聚光而成的焦點(diǎn)區(qū)域，被稱為共焦體積。)內(nèi)出入的熒光分子或進(jìn)行了熒光標(biāo)記的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度。另外，基于由該測定的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值確定的、微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)以及滯留的分子的個(gè)數(shù)的平均值，能夠取得熒光分子等的運(yùn)動(dòng)速度或大小、濃度這類信息。此外，能夠檢測到分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集的各種現(xiàn)象。此外，提出有利用突光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專利文獻(xiàn)3)或光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如，專利文獻(xiàn)4)。上述方法中，生成與FCS同樣檢測到的出入共焦體積內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，對于該直方圖的分布擬合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型式。由此，算出熒光分子等固有的明亮度的平均值和滯留于共焦體積內(nèi)的分子的個(gè)數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息，推測分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此外，專利文獻(xiàn)5、6中提出了:基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測定出的試樣溶液的熒光信號的時(shí)程來檢測熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7中提出了一種信號運(yùn)算處理技術(shù)，其用于:使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測量在流式細(xì)胞儀內(nèi)流過的熒光微粒或固定在基板上的熒光微粒所發(fā)出的微弱光，檢測液流中或基板上存在的熒光粒子。
[0003]特別的是，通過應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測定技術(shù)的方法，測定所必需的試樣的濃度與現(xiàn)有的方法相比較，低濃度和微量就足夠(每次測定使用的量為數(shù)十另外，根據(jù)上述方法，其測定時(shí)間也大幅地縮短(每次測定中可重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的秒數(shù)量級時(shí)間的測定。)。因此，特別在對于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價(jià)的試樣進(jìn)行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待能夠低廉且迅速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或檢測。
[0004]另一方面，將作為檢測對象的目標(biāo)粒子用發(fā)光探針進(jìn)行標(biāo)記并通過FIDA等檢測的方法中，試樣溶液中與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針以及不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針共存的情況下，重要的是能夠?qū)烧邊^(qū)別而檢測。例如，專利文獻(xiàn)8中公開有，使用用容易與自由基反應(yīng)而褪色的熒光色素標(biāo)記的發(fā)光探針，在防褪色劑的存在下進(jìn)行FIDA。由此，在由與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針檢測到的熒光強(qiáng)度、由不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針檢測到的熒光強(qiáng)度之間設(shè)置差異、將兩者區(qū)別而檢測的方法。
[0005]其他的，專利文獻(xiàn)9中，作為放大來自發(fā)光探針的信號的方法，公開有例如利用配體與受體的結(jié)合反應(yīng)，使多個(gè)發(fā)光探針結(jié)合到一個(gè)目標(biāo)粒子的方法。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876號公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371號公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)3:日本專利第4023523號公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)4:日本國際公開2008-080417號公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)5:日本特開2007-20565號公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)6:日本特開2008-116440號公報(bào)
[0014]專利文獻(xiàn)7:日本特開平4-337446號公報(bào)
[0015]專利文獻(xiàn)8:日本特開2009-250721號公報(bào)
[0016]專利文獻(xiàn)9:日本特開2000-106876號公報(bào)
[0017]非專利文獻(xiàn)
[0018]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號、第1431?1438 頁。
[0019]非專利文獻(xiàn)2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler著、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁。
[0020]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號、第271?277 頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]發(fā)明要解決的問題
[0022]上述的FCS、FIDA和PCH等光分析技術(shù)中，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算所測量的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)的大小。另外，基于該波動(dòng)的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的突光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度需要調(diào)制成在平衡狀態(tài)下在秒數(shù)量級長度的一次檢測時(shí)間內(nèi)有能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)。試樣溶液中的成為觀測對象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度優(yōu)選調(diào)制成在微小區(qū)域內(nèi)經(jīng)常地存在一個(gè)左右的熒光分子等(典型地，共焦體積的體積為IfL左右，所以熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。)。即，試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度大幅地低于能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的程度時(shí)(例如，大幅地低于InM時(shí))，產(chǎn)生測量時(shí)間內(nèi)只有稀少的觀測對象物進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)。因此，在熒光強(qiáng)度的測量結(jié)果中長期包括著觀測對象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)，顯著的熒光強(qiáng)度的觀測量變少。因此，通過如上述的基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)的光分析技術(shù)難以獲得有意義的或精度良好的分析結(jié)果。[0023]專利文獻(xiàn)5、6中記載的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測方法中，不進(jìn)行如上述的涉及熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。專利文獻(xiàn)5和6中公開有，根據(jù)數(shù)秒的測量時(shí)間內(nèi)有無顯著強(qiáng)度的熒光信號的產(chǎn)生，判斷試樣中的成為觀測對象的熒光分子等的有無，而得到顯著強(qiáng)度的熒光信號的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專利文獻(xiàn)6中，提出了產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機(jī)流動(dòng)時(shí)，檢測靈敏度提高。然而，即便是這些方法，也只停留在檢測通過擴(kuò)散或隨機(jī)的流動(dòng)概率地進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子行為。因此，專利文獻(xiàn)5和6中，沒有實(shí)現(xiàn)例如粒子的計(jì)數(shù)、定量地算出粒子的濃度或數(shù)密度。此外，專利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)是逐個(gè)檢測流式細(xì)胞儀的液流中的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘５拇嬖诘募夹g(shù)，而不是用于檢測試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等的粒子，即不是用于對于在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測的技術(shù)。即，專利文獻(xiàn)7中，并沒有實(shí)現(xiàn)定量地計(jì)算在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包含流式細(xì)胞儀中的測量或者熒光粒子向基板上的固定化處理的過程。因此，檢測所需要的試樣量遠(yuǎn)大于FCS、FIDA、和PCH等光分析技術(shù)所需要的試樣量，并且對實(shí)施者要求復(fù)雜的高難度的操作技術(shù)。
[0024]另外，將試樣溶液中的目標(biāo)粒子用發(fā)光探針標(biāo)記并使用熒光測定技術(shù)進(jìn)行檢測的方法中，不需要在測定前預(yù)先從試樣溶液中去除游離的發(fā)光探針。因此，優(yōu)選能夠?qū)⑴c目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針、和不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針區(qū)別而進(jìn)行檢測。然而，專利文獻(xiàn)8記載的方法中，存在能夠使用的熒光物質(zhì)受限的問題。
[0025]本發(fā)明的方式目的在于提供:即便在試樣溶液中與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針以及不與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針共存的情況下也能夠檢測目標(biāo)粒子的方法。本發(fā)明的方式的方法使用具有以下所示的特征的新型的光分析技術(shù)。即，本光分析技術(shù)不包含如FCS、FIDA、PCH等現(xiàn)有的光分析技術(shù)中實(shí)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，本光分析技術(shù)能夠檢測觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度低于這些現(xiàn)有的光分析技術(shù)中處理水準(zhǔn)的試樣溶液中的觀測對象粒子的狀態(tài)或特性。
[0026]用于解決問題的方案
[0027]本發(fā)明人等為了解決上述問題進(jìn)行深入研究，結(jié)果完成了以下這樣的本發(fā)明。在由與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針發(fā)出的光作為指標(biāo)間接地檢測試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的情況下，使用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行結(jié)合有發(fā)光探針的粒子的檢測。由此，在試樣溶液中的觀測對象的粒子的濃度非常低的情況下，也能夠靈敏度良好地檢測結(jié)合有發(fā)光探針的粒子。進(jìn)一步，使觀測對象粒子上結(jié)合多個(gè)發(fā)光探針。由此，不必從試樣溶液中預(yù)先去除不與目標(biāo)粒子結(jié)合的游離的發(fā)光探針，也能夠?qū)⑴c目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針和游離的發(fā)光探針區(qū)別檢測。
[0028]掃描分子計(jì)數(shù)法是日本特愿2010-044714中由本申請的 申請人:提出的新型光分析技術(shù)。
[0029]S卩，本發(fā)明中具有以下的方式。
[0030](I) 一種目標(biāo)粒子的檢測方法，其為檢測在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具有:
[0031](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、和與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的I種或2種以上的發(fā)光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每I分子前述目標(biāo)粒子與2分子以上的前述發(fā)光探針結(jié)合的工序；和
[0032](b)計(jì)算前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)的工序，
[0033]前述發(fā)光探針為結(jié)合有同種發(fā)光物質(zhì)的I種或2種以上的探針，
[0034]前述工序(b)中的結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)的計(jì)算具備:使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的工序；
[0035]一邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置，一邊檢測由前述光檢測區(qū)域中的粒子發(fā)出的熒光的工序；
[0036]由前述檢測到的光逐個(gè)檢測來自每個(gè)粒子的光信號而逐個(gè)檢測粒子的工序；
[0037]以前述逐個(gè)檢測到的粒子的光信號的強(qiáng)度作為指標(biāo)，只計(jì)數(shù)每I粒子包含有2分子以上前述發(fā)光探針的粒子而計(jì)數(shù)前述光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測到的前述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
[0038](2)根據(jù)前述⑴所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，在前述移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測區(qū)域的位置以規(guī)定的速度移動(dòng)。
[0039](3)根據(jù)前述⑴或(2)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，在前述移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的工序中，前述光檢測區(qū)域的位置以比前述結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)。
[0040](4)根據(jù)(I)?(3)的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，在由前述檢測到的光檢測來自每個(gè)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的光信號而逐個(gè)檢測前述結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的工序中，根據(jù)檢測到的按照時(shí)間順序的光信號的形狀來檢測一個(gè)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子進(jìn)入了前述光檢測區(qū)域。
[0041](5)根據(jù)前述⑴?⑷的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，前述發(fā)光探針包含與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的標(biāo)記用探針、和與每I分子前述標(biāo)記用探針結(jié)合的I或2分子以上的發(fā)光物質(zhì)。
[0042]發(fā)明的效果
[0043]本發(fā)明方式的目標(biāo)粒子的檢測方法中應(yīng)用的掃描分子計(jì)數(shù)法不實(shí)行計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，通過本發(fā)明的方式的目標(biāo)粒子的檢測方法，即便試樣中僅極微量地存在作為解析對象的目標(biāo)粒子時(shí)，也能夠檢測試樣中的前述目標(biāo)粒子。進(jìn)而，本發(fā)明的方式的目標(biāo)粒子的檢測方法中，每I分子與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的發(fā)光強(qiáng)度大于每I分子游離的發(fā)光探針的發(fā)光強(qiáng)度。因此，在利用掃描分子計(jì)數(shù)法測定前不預(yù)先從試樣溶液中去除游離的發(fā)光探針也能夠?qū)⑴c目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針與游離的發(fā)光探針區(qū)別而檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1A是用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0045]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0046]圖1C是改變鏡的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。[0047]圖2A是說明基于用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測原理的示意圖。
[0048]圖2B是圖2A中測量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0049]圖3A是觀測對象粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的模式圖。
[0050]圖3B是表示圖3A的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0051]圖4A是以快于觀測對象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置、從而觀測對象粒子橫穿光檢測區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0052]圖4B是表示圖4A的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0053]圖5是以流程圖的形式顯示根據(jù)掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理次序的圖。
[0054]圖6A是說明在根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0055]圖6B是說明在根據(jù)通過掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測信號的信號處理工序的例子的圖。
[0056]圖7表示通過掃描分子計(jì)數(shù)法測量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測例(柱狀圖)、和將數(shù)據(jù)平滑化后獲得的曲線(虛線)、和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。圖中，帶有“噪音”的信號作為由噪音或雜質(zhì)帶來的信號被無視。
【具體實(shí)施方式】
[0057]首先，對掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說明。一邊通過微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)出光的粒子(以下，稱為“發(fā)光粒子”。)橫穿微小區(qū)域內(nèi)。此時(shí)檢測由微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光。由此，能夠一個(gè)一個(gè)逐個(gè)檢測試樣溶液中的發(fā)光粒子，獲得與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的相關(guān)信息。上述技術(shù)中，與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，檢測所需的試樣可以是微量(例如，數(shù)十UL左右)。另外，測定時(shí)間短。另外，與FIDA等光分析技術(shù)相比，對于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，可以定量檢測其濃度或數(shù)密度等特性。
[0058]需要說明的是，發(fā)光粒子是指通過熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光以及光散射等發(fā)出光的粒子。本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法中，目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而成的物質(zhì)為發(fā)光粒子。
[0059]本實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測區(qū)域”是指在這些顯微鏡中檢測光的微小區(qū)域。當(dāng)由物鏡提供照明光時(shí)，“光檢測區(qū)域”相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。需要說明的是，在共聚焦顯微鏡中，前述區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔之間的位置關(guān)系確定。
[0060]邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置、即通過光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測。當(dāng)移動(dòng)的光檢測區(qū)域包含了與隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時(shí)，檢測到來自發(fā)光探針的光。由此，檢測到一個(gè)粒子的存在(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，也包含如下情況:發(fā)光探針與希望檢測的粒子(目標(biāo)粒子)暫時(shí)結(jié)合后，在進(jìn)行光的檢測時(shí)與粒子解離。)。接著，在逐次檢測到的光中逐個(gè)檢測來自發(fā)光探針的光信號。由此，一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)逐次地檢測(結(jié)合有發(fā)光探針的)粒子的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在上述構(gòu)成中，可以計(jì)數(shù)逐個(gè)檢測到的粒子，從而計(jì)數(shù)在光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)中檢測到的粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)前述構(gòu)成，通過組合粒子的個(gè)數(shù)與光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是通過任意手法例如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置等來確定光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，并不是直接確定絕對數(shù)密度值或濃度值，也可以計(jì)算相對于多個(gè)試樣溶液、或者相對于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對的數(shù)密度或濃度之比。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的構(gòu)成。由此，光檢測區(qū)域的移動(dòng)是迅速的，并且在試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用。因此，作為檢測對象的粒子不受力學(xué)的作用的影響，能夠在穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測量(試樣溶液中受到振動(dòng)或流動(dòng)作用時(shí)，粒子的物理性質(zhì)存在變化的可能性。)。并且，使試樣溶液流通的構(gòu)成不是必要的。所以，與FCS、FIDA等情況同樣地，能夠以微量(I?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進(jìn)行測量和分析。
[0061]在上述的逐個(gè)地檢測粒子的工序中，由逐次檢測到的光信號判斷與一個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針(包括:一個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；多個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)方式的、與一個(gè)粒子結(jié)合之后從粒子解離的發(fā)光探針的情況。以下同樣)是否進(jìn)入光檢測區(qū)域，可以根據(jù)按照時(shí)間順序檢測到的光信號的形狀而進(jìn)行。本實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測到具有比規(guī)定閾值大的強(qiáng)度的光信號時(shí)，可以檢測到與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針進(jìn)入了光檢測區(qū)域。
[0062]此外，在上述移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變試樣溶液內(nèi)部的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，由與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針?biāo)鶛z測到的光的形態(tài)，可能會(huì)根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，光檢測區(qū)域的移動(dòng)速度過快時(shí)，由與一個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針得到的光量降低。因此，為了精度良好或靈敏度良好地測量來自與一個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的光，優(yōu)選適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0063]進(jìn)一步，在上述移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的工序中，優(yōu)選將試樣溶液內(nèi)的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與作為檢測對象的粒子結(jié)合后的發(fā)光探針(即，本發(fā)明的目標(biāo)粒子的檢測方法中，與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針)的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)造成的粒子的平均移動(dòng)速度)。如前所述，掃描分子計(jì)數(shù)法中，當(dāng)光檢測區(qū)域通過存在有與一個(gè)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的存在位置時(shí)，檢測由該發(fā)光探針發(fā)出的光而逐個(gè)檢測發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)移動(dòng)，在光檢測區(qū)域中出入多次時(shí)，多次檢測到來自一個(gè)發(fā)光探針(表示希望檢測的粒子存在)的光信號。因此，難以將檢測到的光信號與一個(gè)希望檢測的粒子的存在對應(yīng)起來。因此，將光檢測區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度(具體而言，設(shè)定為以比與目標(biāo)粒子結(jié)合后的狀態(tài)的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng))。由此，能夠使與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針對應(yīng)于一個(gè)(表示粒子的存在的)光信號。需要說明的是，擴(kuò)散移動(dòng)速度根據(jù)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針而變化。因此，優(yōu)選根據(jù)與粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的特性(特別是，擴(kuò)散常數(shù))適宜變更光檢測區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0064]可以以任意方式，進(jìn)行用于移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0065]例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡改變光路，使光檢測區(qū)域的位置發(fā)生變化。光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定，也可以選自例如圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0066]掃描分子計(jì)數(shù)法，對于其光檢測機(jī)理自身，與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對來自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測區(qū)域的光進(jìn)行檢測的構(gòu)成。因此，試樣溶液的量同樣可以為微量。然而，掃描分子計(jì)數(shù)法中，不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)可以適用于粒子的數(shù)密度或濃度比FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平大幅地低的試樣溶液。
[0067]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，在溶液中分散或溶解的每個(gè)粒子被逐個(gè)檢測出。因此，使用該信息，可以定量地進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過掃描分子計(jì)數(shù)法使通過光檢測區(qū)域的粒子與檢測到的光信號一一對應(yīng)而一個(gè)一個(gè)地檢測粒子。因此，能夠計(jì)數(shù)溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子。另外，與現(xiàn)有方法相比較，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。實(shí)際上，根據(jù)逐個(gè)檢測與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的發(fā)光探針并計(jì)數(shù)其數(shù)目、確定粒子濃度的本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法，即使試樣溶液中的與目標(biāo)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的濃度是比通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測量的熒光強(qiáng)度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠檢測目標(biāo)粒子。
[0068]進(jìn)一步，根據(jù)改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、利用光檢測區(qū)域掃描試樣溶液中的方式，不對試樣溶液產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)作用，使試樣溶液內(nèi)部在均勻的狀態(tài)或試樣溶液機(jī)械上穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行觀察。因此，與例如使試樣產(chǎn)生流動(dòng)的情況(賦予流動(dòng)的情況下難以恒常地賦予同樣的流速，并且裝置構(gòu)成變得復(fù)雜，還有需要的試樣量大幅地增大，并且由于流動(dòng)導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用，溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)存在變質(zhì)或變性的可能性。)相比較，定量的檢測結(jié)果的可靠性提高。另外，對于試樣溶液中的成為檢測對象的粒子，能夠在沒有力學(xué)作用的影響下或沒有人為影響的狀態(tài)下進(jìn)行測量。
[0069]<用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0070]可以通過在基本的構(gòu)成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測器而構(gòu)成的光分析裝置實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法。如圖1A所示，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得數(shù)據(jù)、分析該數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣。上述光學(xué)系統(tǒng)中，自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光，通過準(zhǔn)直儀4成為平行光，在分色鏡
5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測對象物的粒子、與前述粒子結(jié)合的發(fā)光探針、以及帶有發(fā)光標(biāo)記(典型地為熒光色素等)的分子。與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，與粒子暫時(shí)結(jié)合后從粒子解離的發(fā)光探針)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針就在其間被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光。之后，聚光的光(Em)通過小孔13，透過二次濾片14 (此處，只選擇特定的波長頻帶的光成分。)被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測器16，轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號。之后，轉(zhuǎn)換的電信號被輸入至計(jì)算機(jī)18，之后按照后面說明的方式實(shí)施用于光分析的處理。需要說明的是，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上。由此，如圖1B所示，僅自激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過小孔13，而來自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有I?IOfL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛倫茲型分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為l/e2的面為界面的略橢球體的體積。)。上述焦點(diǎn)區(qū)域被稱為共焦體積。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測到來自一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來自發(fā)光探針的光，例如，來自一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光色素分子的微弱光。因此，光檢測器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測器。此外，為了改變成為觀測對象的孔10，在顯微鏡的平臺(tái)(沒有圖示)上可以設(shè)有用于移動(dòng)微孔板9的水平方向位置的平臺(tái)位置變化裝置17a。可以通過計(jì)算機(jī)18控制平臺(tái)位置變化裝置17a的動(dòng)作。通過前述構(gòu)成，即使被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測量。
[0071]進(jìn)一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部的、即用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域(即，光檢測區(qū)域)的位置的機(jī)構(gòu)。該用于移動(dòng)前述光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C所示，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。鏡轉(zhuǎn)向器17也可以是裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置。另外，為了實(shí)現(xiàn)所希望的光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)模式，鏡轉(zhuǎn)向器17是在計(jì)算機(jī)18的控制下，與通過光檢測器16的光檢測協(xié)調(diào)而被驅(qū)動(dòng)。光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計(jì)算機(jī)18的程序中的各種移動(dòng)模式中選擇。)。需要說明的是，圖中沒有顯示但也可以通過上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測區(qū)域的位置沿上下方向移動(dòng)。根據(jù)不移動(dòng)試樣溶液而改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的構(gòu)成，試樣溶液內(nèi)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用。因此，能夠排除對于觀測對象物的力學(xué)作用的影響，能夠進(jìn)行穩(wěn)定的測量。
[0072]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過吸收多光子而發(fā)光時(shí)，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測區(qū)域)中發(fā)出光，所以可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴激發(fā)光發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。進(jìn)而，光分析裝置I中可以設(shè)置多個(gè)激發(fā)光源2。另外，也可以根據(jù)用于將粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者發(fā)光探針激發(fā)的光的波長適宜選擇激發(fā)光的波長。同樣地，也可以具備多個(gè)光檢測器16。另外，當(dāng)試樣中包含波長不同的多種粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針時(shí)，可以根據(jù)波長分別檢測來自它們的光。
[0073]<掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0074]FIDA等分光分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)分析技術(shù)相比,必需的試樣量非常少這一點(diǎn)以及可以快速實(shí)施檢查這一點(diǎn)優(yōu)異。然而，在FIDA等分光分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強(qiáng)度波動(dòng)計(jì)算觀測對象粒子的濃度或特性。因此，為了獲得精度良好的檢測結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強(qiáng)度測量中，在光檢測區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測對象粒子，在測量時(shí)間內(nèi)總是檢測到顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果當(dāng)觀測對象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述時(shí)，例如，當(dāng)觀測對象粒子只是偶爾進(jìn)入光檢測區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，僅在一部分測量時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。因而難以以良好的精度計(jì)算光強(qiáng)度的波動(dòng)。此外，在觀測對象粒子的濃度大幅地低于測量中通常在光檢測區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)左右的觀測對象粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的運(yùn)算易受背景的影響。由此，為了獲得對運(yùn)算而言為充分量的顯著的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，測量時(shí)間延長。與此相對，即使當(dāng)觀測對象粒子的濃度低于FIDA等分光分析技術(shù)要求的水平時(shí)，用掃描分子計(jì)數(shù)法也能夠檢測觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0075]掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)中，作為實(shí)行的處理，驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路,一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測區(qū)域CV的位置一邊實(shí)施光檢測。即，一邊利用光檢測區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)一邊實(shí)施光檢測。該情況下,例如，如圖2A所示，在光檢測區(qū)域CV移動(dòng)期間(圖中，時(shí)間t0?t2)，當(dāng)通過存在有I個(gè)粒子(圖中，發(fā)光探針結(jié)合有熒光色素。)的區(qū)域時(shí)(tl)，檢測到如圖2B所示的顯著的光強(qiáng)度(Em)。實(shí)行上述的光檢測區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測從而一個(gè)一個(gè)地檢測在此期間出現(xiàn)的顯著的光強(qiáng)度。由此，逐個(gè)檢測出結(jié)合有發(fā)光探針的粒子，計(jì)數(shù)其個(gè)數(shù)。結(jié)果，能夠得到與存在于所測量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個(gè)數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。前述掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，粒子一個(gè)一個(gè)地被檢測出且不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算這類統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算處理。因此，即便是欲觀測的粒子濃度低至無法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0076]另外，通過掃描分子計(jì)數(shù)法這類逐個(gè)檢測、計(jì)數(shù)試樣溶液中的粒子的方法，與由通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測量的熒光強(qiáng)度來檢測被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)相比，能夠測定至更低的濃度。當(dāng)通過熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來檢測被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)，通常假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度充分地降低時(shí)，噪音信號的量相對于由被突光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號量變大(S/N比惡化)，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號量之間的比例關(guān)系瓦解。結(jié)果，確定的濃度值的精度惡化。掃描分子計(jì)數(shù)法在由被檢測的光信號檢測對應(yīng)于各個(gè)粒子的信號的工序中，從檢測結(jié)果中排除了噪音信號，只將對應(yīng)于各個(gè)粒子的信號進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)算濃度。因此，與通過假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時(shí)相比較，能夠檢測至更低的濃度。
[0077]另外，當(dāng)一個(gè)觀測對象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針時(shí)，與傳統(tǒng)的假定熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而確定濃度的現(xiàn)有方法相比，掃描分子計(jì)數(shù)法這類對試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測、計(jì)數(shù)的方法，粒子濃度高一側(cè)的粒子濃度的測量精度提高。在一個(gè)觀測對象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針的情況下，向試樣溶液添加規(guī)定量的發(fā)光探針時(shí)，觀測對象粒子的濃度升高時(shí)，相對而言與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的個(gè)數(shù)降低。在此情況下，由于每一個(gè)觀測對象粒子的熒光強(qiáng)度降低，因此，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解。結(jié)果，確定的濃度值的精度惡化。掃描分子計(jì)數(shù)法在由檢測到的光信號檢測對應(yīng)于各個(gè)粒子的信號的工序中，每個(gè)粒子的熒光強(qiáng)度的降低的影響少，由粒子數(shù)計(jì)算濃度。因此，與通過假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測濃度時(shí)相比較，能夠檢測至更高的濃度。
[0078]<通過掃描分子計(jì)數(shù)法的試樣溶液的光強(qiáng)度的測定>
[0079]就掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測定而言，在測定中驅(qū)動(dòng)鏡轉(zhuǎn)向器17，在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)。其他的處理，可以按照與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度的測定工序同樣的方式實(shí)施。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺(tái)上。之后，使用者對計(jì)算機(jī)18輸入測定開始的指示，計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲(chǔ)裝置(沒有圖示)存儲(chǔ)的程序(將用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的光路進(jìn)行改變的次序、和在光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測來自光檢測區(qū)域的光的次序)，開始試樣溶液內(nèi)光檢測區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測量。前述測量中，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18的程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動(dòng)鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)。與此同時(shí)，光檢測器16將逐次檢測到的光轉(zhuǎn)換為電信號，傳送給計(jì)算機(jī)18。計(jì)算機(jī)18以任意方式由送達(dá)的光信號生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。需要說明的是，典型地光檢測器16為能夠檢測到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測器。因此，光的檢測是以如下方式實(shí)施的光子計(jì)數(shù):在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時(shí)間(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10 μ秒逐次地測量到達(dá)光檢測器的光子的個(gè)數(shù)。另外，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0080]光強(qiáng)度測量中的光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)速度可以是任意的，可以為按照適合例如實(shí)驗(yàn)或分析目的的方式設(shè)定的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測到的觀測對象粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的大小或體積是必需的。因此，以移動(dòng)距離受掌握的方式進(jìn)行光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)。需要說明的是，測量中的經(jīng)過時(shí)間與光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測定結(jié)果。因此，移動(dòng)速度基本上優(yōu)選為恒定速度，但并非僅限于此。
[0081]此外，對于光檢測區(qū) 域的位置移動(dòng)的速度，為了以良好的精度由測量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測觀測對象粒子、或定量實(shí)施觀測對象粒子數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將前述的移動(dòng)速度設(shè)定為比觀測對象粒子(更嚴(yán)密地，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針、本實(shí)施方式中為結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)即布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)速度更快的值。掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測對象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子。因此，由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置伴隨著時(shí)間而移動(dòng)。因此，光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)慢時(shí)，如圖3Α所示，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)。由此，如圖3Β所示，光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(光檢測區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。)，難以確定對應(yīng)于各個(gè)觀測對象粒子的顯著的光強(qiáng)度的變化。因此，優(yōu)選如圖4Α所示那樣粒子略直線地橫穿光檢測區(qū)域。由此，如圖4Β例示，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，對應(yīng)于各個(gè)粒子的光強(qiáng)度變化的分布圖大致一致(粒子略直線地通過光檢測區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的曲線與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同。)。即，將光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的平均的移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)以使每個(gè)觀測對象粒子與光強(qiáng)度的對應(yīng)能夠容易地確定。
[0082]具體而言，由于布朗運(yùn)動(dòng)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的觀測對象粒子(更嚴(yán)密的是，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體，或與粒子結(jié)合后再分解、游離的發(fā)光探針)通過半徑Wo的光檢測區(qū)域(共焦體積)時(shí)所需的時(shí)間At是由均方位移的關(guān)系式、下述式(I)和(2)得到的。
[0083](2Wo)2=6D.At...(I)
[0084]At=(2ffo)2/6D— (2)
[0085]觀測對象粒子通過布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif由下述式(3)得到。[0086]Vdif = 2ffo/ Δ t=3D/Wo…(3)
[0087]光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參考Vdif而設(shè)定為比之更快的值。例如，假定觀測對象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0 X 10^10m2/s左右的情況下，當(dāng)Wo為0.62 μ m左右時(shí)，則Vdif為1.0X10_3m/s。因此，光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其大約10倍的15mm/s即可。需要說明的是，當(dāng)觀測對象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，為了找到使在光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)速度的各種設(shè)定下的光強(qiáng)度變化曲線成為預(yù)期曲線(典型的是與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果是可以確定合適的光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0088]<通過掃描分子計(jì)數(shù)法的光強(qiáng)度的分析>
[0089]經(jīng)上述處理獲得試樣溶液的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可以在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序進(jìn)行處理(由檢測到的光逐個(gè)檢測來自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號的次序)，由此實(shí)施下述的光強(qiáng)度的分析。 [0090](i) 一個(gè)觀測對象粒子的檢測
[0091]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個(gè)觀測對象粒子通過光檢測區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4A所示的幾乎直線狀時(shí)，與該粒子相對應(yīng)的光強(qiáng)度變化如圖6A所示，具有(由光學(xué)系統(tǒng)確定的)反映光檢測區(qū)域的光強(qiáng)度分布的曲線(通常略呈鐘形)。觀測對象粒子的檢測手法之一中，對于光強(qiáng)度設(shè)定閾值Ιο。超過閾值1的光強(qiáng)度持續(xù)時(shí)間寬度△ τ在規(guī)定的范圍時(shí)，也可以判定為該光強(qiáng)度的分布圖與一個(gè)粒子通過光檢測區(qū)域相對應(yīng)，檢測到一個(gè)觀測對象粒子。針對光強(qiáng)度的閾值1以及針對時(shí)間寬度△ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)觀測對象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后再分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強(qiáng)度而預(yù)想的曲線確定的；所述觀測對象粒子相對于光檢測區(qū)域以規(guī)定的速度相對地移動(dòng)。具體的值可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)任意地設(shè)定，此外也可以根據(jù)觀測對象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇確定。
[0092]此外，作為觀測對象粒子的檢測的其他方法，光檢測區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布時(shí)滿足下述式(4)。
[0093]I=A.exp (_2t2/a2)...(4)
[0094]對顯著的光強(qiáng)度的曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)，擬合式⑷計(jì)算強(qiáng)度A和寬度a。計(jì)算的強(qiáng)度A和寬度a在規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，該光強(qiáng)度的曲線可判斷為對應(yīng)一個(gè)觀測對象粒子通過了光檢測區(qū)域，可以進(jìn)行一個(gè)觀測對象粒子的檢測(強(qiáng)度A和寬度a在規(guī)定范圍外時(shí)，可以在分析中作為噪音或異物而無視。)。
[0095](ii)觀測對象粒子的計(jì)數(shù)
[0096]觀測對象粒子的計(jì)數(shù)可以如下進(jìn)行:通過任意方法計(jì)數(shù)通過上述觀測對象粒子的檢測方法檢測到的粒子的個(gè)數(shù)。然而，當(dāng)粒子的個(gè)數(shù)較大時(shí)，也可以通過例如圖5和圖6B所示的處理來進(jìn)行。
[0097]如圖5和圖6B所示，在根據(jù)按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)粒子數(shù)的方法的一個(gè)例子中，在通過上述說明的光強(qiáng)度測定、即用光檢測區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，獲得按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)，對前述按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)(圖6B的“檢測結(jié)果(未處理)”)，進(jìn)行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B的“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，所以在微小的時(shí)間內(nèi)存在數(shù)據(jù)值產(chǎn)生欠缺。因此，通過前述平滑化處理，可以無視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過移動(dòng)平均法而進(jìn)行。需要說明的是，可以根據(jù)獲得光信號數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)、BIN --ΜΕ，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)(例如，在移動(dòng)平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)或移動(dòng)平均的次數(shù)等)。
[0098]然后，為了檢測在平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)中存在顯著信號的時(shí)間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，對平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)對時(shí)間進(jìn)行一階微分值運(yùn)算(步驟120)。按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值如圖6B的“時(shí)間微分”所示，信號值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大。因此，通過參照前述時(shí)間微分值，能夠有利地確定顯著的信號(峰信號)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0099]之后，在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)中，逐次檢測顯著的信號(峰信號)，判斷檢測到的峰信號是否是與觀測對象粒子相對應(yīng)的信號。
[0100]具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索、確定一個(gè)峰信號的起點(diǎn)和終點(diǎn)，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。一旦確定了一個(gè)峰存在區(qū)域，就對該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)進(jìn)行鐘形函數(shù)擬合(圖6B的“鐘形函數(shù)擬合”)。結(jié)果，計(jì)算鐘形函數(shù)的峰強(qiáng)度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum))W、和擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。需要說明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。由此，判斷計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過光檢測區(qū)域時(shí)檢測到的光信號所描述的鐘形曲線參數(shù)的規(guī)定范圍內(nèi)。即，峰強(qiáng)度、峰寬度、和相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。如圖7左側(cè)所示，計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個(gè)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對應(yīng)的光信號規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，則該信號判定為與一個(gè)觀測對象粒子對應(yīng)的信號。由此，判斷為檢測到一個(gè)觀測對象粒子，計(jì)數(shù)為一個(gè)粒子(粒子數(shù)的計(jì)數(shù)增加。工序160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)沒有在預(yù)定范圍內(nèi)的峰信號作為噪音而無視。
`[0101]上述的步驟130~160的處理中的峰信號的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進(jìn)行，每檢測到一個(gè)觀測對象粒子則作為粒子而計(jì)數(shù)。并且，在結(jié)束對按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)全部區(qū)域的峰信號搜索后(步驟170)，可以將目前為止所獲得的粒子計(jì)數(shù)值作為在按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)中檢測到的觀測對象粒子的個(gè)數(shù)。
[0102](iii)觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0103]進(jìn)行了觀測對象粒子的計(jì)數(shù)后，使用在獲得按照時(shí)間順序的光信號數(shù)據(jù)的過程中光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，確定觀測對象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測區(qū)域的實(shí)際體積依賴于激發(fā)光或檢測光的波長、透鏡的開口數(shù)、或者光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變。因此，通常難以由設(shè)計(jì)值計(jì)算光檢測區(qū)域的實(shí)際體積。另外，計(jì)算光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積也不簡單。因此，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測定相同的條件下，對已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進(jìn)行上文說明的光強(qiáng)度測定、粒子的檢測和計(jì)數(shù)。根據(jù)檢測到的粒子的個(gè)數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域的總體積，即確定觀測對象粒子的檢測數(shù)和濃度之間的關(guān)系。[0104]作為參照溶液的粒子，可以優(yōu)選為與觀測對象粒子所形成的粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測對象粒子結(jié)合后再游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對于粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測數(shù)為N時(shí)，光檢測區(qū)域所通過的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)下述式(5)求出。
[0105]Vt = N/C...(5)
[0106]另外，準(zhǔn)備多個(gè)不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對其實(shí)施測定，將計(jì)算的Vt的平均值作為光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的總體積Vt而采用即可。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度C就根據(jù)下述式(6)求出。
[0107]c = n/Vt …(6)
[0108]需要說明的是，可以不通過上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測區(qū)域的體積、光檢測區(qū)域所通過區(qū)域的總體積。此外，本實(shí)施方式的光分析裝置中，對于規(guī)定的光檢測區(qū)域的移動(dòng)模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(5))的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中。由此，裝置的使用者在實(shí)施光分析時(shí)可以適當(dāng)利用存儲(chǔ)的關(guān)系信息。
[0109]<目標(biāo)粒子的檢測方法>
[0110]本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法為檢測試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的目標(biāo)粒子的方法。按照使試樣溶液中的目標(biāo)粒子每I分子的發(fā)光強(qiáng)度大于游離的發(fā)光探針的方式使試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合而進(jìn)行標(biāo)記。之后，通過掃描分子計(jì)數(shù)法檢測結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。掃描分子計(jì)數(shù)法為能夠在分子離散的狀況下測定每一粒發(fā)光粒子的測定方法。即，對于PM級以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進(jìn)行測定。因此，通過本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠高靈敏度地計(jì)數(shù)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子。進(jìn)而，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的檢測方法中，每I分子與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的發(fā)光強(qiáng)度大于每I分子游離的發(fā)光探針的發(fā)光強(qiáng)度。因此，在利用掃描分子計(jì)數(shù)法測定前不預(yù)先從試樣溶液中去除游離的發(fā)光探針也能夠?qū)⑴c目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針以及游離的發(fā)光探針區(qū)別而檢測。
[0111]具體而言，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的定量方法具備下述工序(a)~(b)。
[0112](a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、和與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的I種或2種以上的發(fā)光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每I分子前述目標(biāo)粒子與2分子以上的前述發(fā)光探針結(jié)合的工序；
[0113](b)計(jì)算前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)的工序。
[0114]以下，對于每個(gè)工序進(jìn)行說明。
[0115]首先，作為工序(a)，調(diào)制包含目標(biāo)粒子、和與前述目標(biāo)粒子結(jié)合的I種或2種以上的發(fā)光探針的試樣溶液，在前述試樣溶液中，使每I分子前述目標(biāo)粒子與2分子以上的前述發(fā)光探針結(jié)合。
[0116]本實(shí)施方式中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子”是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的或不發(fā)光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子。
[0117]目標(biāo)粒子為在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，是在前述試樣溶液中成為檢測目標(biāo)的粒子。作為目標(biāo)粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增的核酸。核酸類似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子取代的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羥基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(Hexitol Nucleic Acid, HNA)、或肽核酸(PNA)等。
[0118]另外，本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針為具有與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或吸附的部位并且發(fā)光的物質(zhì)。發(fā)光探針可以通過例如使與目標(biāo)粒子特異地或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)(標(biāo)記用探針)結(jié)合發(fā)光物質(zhì)而制造。作為發(fā)光物質(zhì)，典型地為熒光性物質(zhì)，但也可以為通過磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、或者光散射等發(fā)出光的物質(zhì)。
[0119]作為熒光物質(zhì)，只要是由特定波長的光照射就發(fā)出熒光的物質(zhì)即可，沒有特別的限定。可以從用于FCS或FIDA等的熒光色素、量子點(diǎn)中適當(dāng)?shù)倪x擇使用。本實(shí)施方式中，從能夠更高靈敏度地檢測的優(yōu)點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用熒光物質(zhì)作為發(fā)光物質(zhì)。
[0120]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，發(fā)光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、或者與核酸結(jié)合的色素分子等。作為前述寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)，還可以為包含部分或全部核酸類似物質(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對。另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，作為發(fā)光探針，可以使用將目標(biāo)粒子的抗原或抗體、或者目標(biāo)粒子的配體或受體用熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記了的物質(zhì)。需要說明的是，與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)與發(fā)光物質(zhì)的結(jié)合可以通過常規(guī)方法進(jìn)行。
[0121]發(fā)光探針既可以為標(biāo)記用探針與發(fā)光物質(zhì)通過共價(jià)鍵等直接結(jié)合而成的物質(zhì)，也可以為標(biāo)記用探針與發(fā)光物質(zhì)通過抗原抗體反應(yīng)、或配體與受體的結(jié)合反應(yīng)等特異的結(jié)合反應(yīng)結(jié)合而成的物質(zhì)。例如，可以將使與生物素結(jié)合的標(biāo)記用探針、與和鏈親合素結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)通過生物素-鏈親合素結(jié)合反應(yīng)結(jié)合而成的物質(zhì)用作發(fā)光探針。更具體而言，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，可以將與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸與生物素結(jié)合的物質(zhì)、與和鏈親合素結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)結(jié)合而成的物質(zhì)用作發(fā)光探針。另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，可以將對應(yīng)于目標(biāo)粒子的配體或受體與生物素結(jié)合的物質(zhì)、與和鏈親合素結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)結(jié)合而成的物質(zhì)用作發(fā)光探針。
[0122]發(fā)光探針可以為I分子的標(biāo)記用探針與I分子的發(fā)光物質(zhì)通過特異的結(jié)合反應(yīng)結(jié)合的物質(zhì)，也可以為I分子的標(biāo)記用探針與2分子以上的發(fā)光物質(zhì)通過特異的結(jié)合反應(yīng)結(jié)合的物質(zhì)。例如，作為發(fā)光探針，可以是使具有I處生物素部位的標(biāo)記用探針與和鏈親合素結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)通過生物素-鏈親合素結(jié)合反應(yīng)結(jié)合而成的物質(zhì)。另外，作為發(fā)光探針，也可以是具有2處以上生物素部位的標(biāo)記用探針與和鏈親合素結(jié)合的發(fā)光物質(zhì)結(jié)合而成的物質(zhì)。
[0123]本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針也可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，從目標(biāo)粒子的檢測/定量的精度的優(yōu)點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等的物質(zhì)。需要說明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的發(fā)光探針，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可。即，前述發(fā)光探針不需要是與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，被作為發(fā)光探針使用的發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與前述目標(biāo)粒子的堿基序列完全地互補(bǔ)的堿基序列，也可以具有與如述目標(biāo)粒子的喊基序列包含錯(cuò)配的喊基序列。
[0124]本實(shí)施方式中使用的發(fā)光探針可以為一種也可以為兩種以上。其中，試樣溶液中所添加的全部發(fā)光探針通過同種發(fā)光物質(zhì)而發(fā)光。例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，可以一起使用:與目標(biāo)粒子雜交的第I寡核苷酸與熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)結(jié)合而成的第I發(fā)光探針；以及在與前述第I寡核苷酸不同的區(qū)域與前述目標(biāo)粒子雜交的第2寡核苷酸、與和前述第I發(fā)光探針同種的發(fā)光物質(zhì)結(jié)合而成的第2發(fā)光探針。該情況下，試樣溶液中的目標(biāo)粒子以第I發(fā)光探針和第2發(fā)光探針與目標(biāo)粒子結(jié)合而成的粒子形式存在。即，包含目標(biāo)粒子的粒子中含有每I粒子2分子的發(fā)光物質(zhì)。因此，通過掃描計(jì)數(shù)法，由包含目標(biāo)粒子的粒子能夠檢測到比游離的第I發(fā)光探針和第2發(fā)光探針強(qiáng)的光信號。
[0125]具體而言，工序(a)首先向適當(dāng)?shù)娜軇┲刑砑幽繕?biāo)粒子和I種或2種以上的發(fā)光探針而調(diào)制試樣溶液。前述溶劑只要是不阻礙由與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針發(fā)出的光的檢測、以及不阻礙利用掃描分子計(jì)數(shù)法的與目標(biāo)粒子結(jié)合后的發(fā)光探針的檢測的溶劑，就沒有特別的限定。作為前述溶劑，可以從前述【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的緩沖液中適宜選擇而使用。作為前述緩沖液，有例如:PBS(磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0126]只是使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針共存于相同的溶液中就能夠使兩者結(jié)合的情況下，調(diào)制試樣溶液之后，根據(jù)需要以規(guī)定時(shí)間孵育試樣溶液。只進(jìn)行上述方法就能使目標(biāo)粒子與發(fā)光探針在前述試樣溶液中結(jié)合。
[0127]另一方面，目標(biāo)粒子、發(fā)光探針為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸或者核酸類似物質(zhì)的情況下，優(yōu)選使試樣溶液中的核酸等變性之后使兩者締合。需要說明的是，“使核酸或核酸類似物質(zhì)變性”是指使堿基對解離。例如，使分子信標(biāo)探針中彼此互補(bǔ)的堿基序列所形成的堿基對解離，解開分子內(nèi)結(jié)構(gòu)成為單鏈結(jié)構(gòu)，或使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。需要說明的是，當(dāng)發(fā)光探針是包含PNA等核酸類似物質(zhì)的寡核苷酸時(shí)，即使目標(biāo)粒子是雙鏈核酸分子，有時(shí)不進(jìn)行特別的變性處理也可以形成包含前述發(fā)光探針和目標(biāo)粒子的締合體。
[0128]作為變性處理，可列舉出:利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。作為前述變性處理，從對于熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)的影響比較小且操作簡便的優(yōu)點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選進(jìn)行熱變性。具體而言，熱變性通過將前述試樣溶液進(jìn)行高溫處理而使前述試樣溶液中的核酸等變性。通常地，可以通過使DNA在90°C、RNA在70°C下進(jìn)行數(shù)秒鐘至2分鐘左右的保溫而使之變性。然而，根據(jù)目標(biāo)粒子的堿基的長度等變性的溫度不同。因此，只要能夠變性，對于該溫度就沒有限定。另一方面，通過低鹽濃度處理進(jìn)行變性可以是例如利用純水等稀釋，將前述試樣溶液的鹽濃度調(diào)整至足夠低，從而進(jìn)行。
[0129]根據(jù)需要使之變性之后，使前述試樣溶液中的目標(biāo)粒子與發(fā)光探針締合。
[0130]當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí)，在高溫處理后，使前述試樣溶液的溫度降至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的溫度。由此能夠使前述試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。另外，當(dāng)通過低鹽濃度處理進(jìn)行變性時(shí)，通過添加鹽溶液等，使前述試樣溶液的鹽濃度升高至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的濃度。由此能夠使前述試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。
[0131]需要說明的是，可以根據(jù)兩者的締合體的熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如可以使僅含有兩者的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測定前述溶液的吸光度或熒光強(qiáng)度來求出熔解曲線。根據(jù)所獲得的熔解曲線，從變性的兩條單鏈核酸分子開始形成締合體的溫度，至幾乎全部成為締合體的溫度這一范圍內(nèi)的溫度，都可以作為兩者能夠特異地雜交的溫度。也可以用使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化來代替溫度，同樣地確定熔解曲線，能夠求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0132]通?？梢杂肨m值(熔解溫度)，代替兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如，利用普遍使用的引物/探針設(shè)計(jì)軟件等。由此，根據(jù)發(fā)光探針的堿基序列信息，能夠計(jì)算與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)。
[0133]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時(shí)，優(yōu)選使試樣溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使試樣溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性后，可以按0.05°C /秒以上的降溫速度，降低前述試樣溶液的液溫。
[0134]此外，為了抑制非特異地雜交，優(yōu)選預(yù)先在試樣溶液中添加表面活性劑、甲酰胺、二甲亞砜或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過添加這些化合物，在較低溫度環(huán)境下也能夠使非特異的雜交難以發(fā)生。
[0135]之后，作為工序(b)，通過掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)調(diào)制的試樣溶液中存在的、結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)。具體而言，將目標(biāo)粒子與發(fā)光探針結(jié)合后的試樣溶液設(shè)置于用于前述的掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置，通過前述的手法檢測由與目標(biāo)粒子結(jié)合狀態(tài)的發(fā)光探針發(fā)出的光并解析，由此計(jì)數(shù)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。計(jì)數(shù)的目標(biāo)粒子數(shù)為測定試樣中所含的目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。
[0136]試樣溶液中的目標(biāo)粒子每I分子結(jié)合有2分子以上的發(fā)光探針。因此，結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的每I粒子的光信號的強(qiáng)度強(qiáng)于游離的發(fā)光探針(即，具有每I粒子I分子的發(fā)光探針的粒子)。因此，將光信號的強(qiáng)度作為指標(biāo)，能夠區(qū)別檢測到的每個(gè)粒子是結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子、還是游離的發(fā)光探針。通過只將每I粒子包含2分子以上發(fā)光探針的粒子計(jì)數(shù)，能夠計(jì)數(shù)目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)。例如，預(yù)先調(diào)制只包含發(fā)光探針的溶液，利用掃描分子計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)前述溶液中的發(fā)光探針的分子數(shù)。由此，測定每一分子游離的發(fā)光探針的光信號的強(qiáng)度，以不包含由游離的發(fā)光探針檢測到的光信號強(qiáng)度的方式設(shè)定適當(dāng)?shù)拈撝?，而能夠只?jì)數(shù)目標(biāo)粒子。
[0137]實(shí)施例
[0138]接著，以下示出實(shí)施例等，進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于下列實(shí)施例。
[0139](實(shí)施例1)
[0140]使用每I分子具有多個(gè)生物素化部位的物質(zhì)作為目標(biāo)粒子、使用結(jié)合有鏈親合素的量子點(diǎn)作為發(fā)光探針，利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測試樣溶液中的目標(biāo)粒子。
[0141]<將雙鏈核酸分子作為目標(biāo)粒子的情況>
[0142]將每I分子具有多個(gè)生物素化部位的雙鏈核酸分子作為目標(biāo)粒子。
[0143]具體而言，使用包含生物素標(biāo)記dCTP的dNTP、和作為模板的質(zhì)粒pUC19進(jìn)行PCR，使用800bp的PCR產(chǎn)物作為目標(biāo)粒子。更詳細(xì)而言，前述PCR使用TaKaRa ExTaq (TAKARABIO INC.制)作為耐熱性聚合酶，在如下溫度循環(huán)條件下進(jìn)行:95°C下進(jìn)行5分鐘處理之后，進(jìn)行在95°C下30秒、50°C下30秒、68°C下I分鐘的熱循環(huán)40循環(huán)，進(jìn)而在68°C下進(jìn)行10分鐘處理。得到的PCR產(chǎn)物使用Wizard SV Clean Up Kit (promega公司制)進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物使用電泳系統(tǒng)(Agilent公司制)進(jìn)行電泳，以換算的濃度為基礎(chǔ)，將被檢體調(diào)制成2nM。
[0144]將得到的PCR產(chǎn)物與20nM的鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655溶液(將鏈親合素結(jié)合型的Qdot (注冊商標(biāo))655 (Invitrogen公司制)用STEP緩沖液稀釋。)以1:1 (體積比)進(jìn)行混合而調(diào)制試樣溶液。將前述試樣溶液靜置30分鐘之后使用STEP緩沖液稀釋50倍之后再稀釋20倍，對其利用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行測定。
[0145]另外，以將前述鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655溶液用STEP緩沖液同樣地稀釋而成的溶液作為對照進(jìn)行測定。
[0146]具體而言，在檢測中，使用具備共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的I分子突光測定裝置MF20 (Olympus Corporation)作為光分析裝置,對于上述的各試樣溶液，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此時(shí)，激發(fā)光使用488nm的激光以300 μ W進(jìn)行照射，檢測光波長使用帶通濾波器設(shè)為650nm~690nm。從雪崩光電二極管獲得的信號的BIN TIME設(shè)為10 μ秒,測定時(shí)間為20秒。
[0147]用Savinzky-Golay算法將由測定獲得的按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑化以后，通過微分進(jìn)行峰檢測。從被視為峰的區(qū)域中，提取可以擬合為高斯函數(shù)的區(qū)域作為信號。
[0148]將測定結(jié)果示于表1。表1中，“Qdot Ref”為僅鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655溶液的測定結(jié)果；“xBiotin-PCR”為測定包含前述PCR產(chǎn)物與鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655的試樣溶液的結(jié)果。其結(jié)果，I分子中具有多個(gè)生物素化部位且每I分子與多個(gè)鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655結(jié)合的前述PCR產(chǎn)物，與游離的鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655相比較，能夠得到強(qiáng)的信號，觀察到兩者存在明顯的強(qiáng)度差。SP，可知能夠區(qū)別地檢測游離的鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655、和結(jié)合有鏈親合素結(jié)合型Qdot (注冊商標(biāo))655的前述PCR產(chǎn)物。
[0149][表 I]
[0150]
【權(quán)利要求】
1.一種目標(biāo)粒子的檢測方法， 其為檢測在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的方法，具備: (a)調(diào)制包含目標(biāo)粒子、和結(jié)合有同種發(fā)光物質(zhì)的與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的I種或2種以上的發(fā)光探針的試樣溶液，在所述試樣溶液中，使每I分子所述目標(biāo)粒子與2分子以上的所述發(fā)光探針結(jié)合的工序； (b)計(jì)算所述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的、結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)的工序； 所述工序(b)中的結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的分子數(shù)的計(jì)算包括:使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置的工序； 一邊在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測區(qū)域的位置，一邊檢測由所述光檢測區(qū)域中的粒子發(fā)出的熒光的工序； 由所述檢測到的光逐個(gè)檢測來自每個(gè)粒子的光信號而逐個(gè)檢測粒子的工序； 以所述逐個(gè)檢測到的粒子的光信號的強(qiáng)度作為指標(biāo)，只計(jì)數(shù)每I粒子包含有2分子以上所述發(fā)光探針的粒子而計(jì)數(shù)所述光檢測區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測到的所述目標(biāo)粒子的個(gè)數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測區(qū)域的位置以規(guī)定的速度移動(dòng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，在所述移動(dòng)光檢測區(qū)域的位置的工序中，所述光檢測區(qū)域的位置以比所述結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，在由所述檢測到的光檢測來自結(jié)合有發(fā)光探針的每個(gè)目標(biāo)粒子的光信號而逐個(gè)檢測所述結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子的工序中，根據(jù)檢測到的按照時(shí)間順序的光信號的形狀來檢測一個(gè)結(jié)合有發(fā)光探針的目標(biāo)粒子進(jìn)入了所述光檢測區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4的任一項(xiàng)所述的目標(biāo)粒子的檢測方法，其中，所述發(fā)光探針包含與所述目標(biāo)粒子結(jié)合的標(biāo)記用探針、和與每I分子前述標(biāo)記用探針結(jié)合的I或2分子以上的發(fā)光物質(zhì)。
【文檔編號】G01N21/64GK103733047SQ201280038339
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月11日
【發(fā)明者】西川和孝 申請人:奧林巴斯株式會(huì)社