專利名稱：基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學發(fā)光免疫分析領(lǐng)域，特別涉及基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法。
背景技術(shù)：
化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)是將化學發(fā)光分析與免疫反應結(jié)合起來建立的方法，它既具有化學發(fā)光分析的高靈敏度，又具有免疫分析的高特異性。早在1977年，Halman等就創(chuàng)建了 CLIA，并用于檢測抗原或抗體。由于CLIA具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便、檢測迅速，并且容易實現(xiàn)自動化檢測，替代了放射性同位素，避免了放射性污染等優(yōu)勢，在臨床診斷、環(huán)境檢測、食品安全等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應用。隨著免疫分析技術(shù)的高速發(fā)展，對單一組分的檢測往往不能滿足對復雜生物樣品檢測的實際需要，多組分免疫分析的出現(xiàn)引起了人們的廣泛關(guān)注。目前，已有的多組分免疫分析方法主要可歸為兩大類陣列模式和多標記物模式。陣列模式通常是在免疫反應器的不同陣列區(qū)域來實現(xiàn)多個組分的同時檢測，如采用陣列芯片或傳感器陣列。該方法需要復雜的儀器做支撐，并且通常需采用昂貴的陣列型檢測器，如C⑶和多通道電化學工作站。多標記物模式是另一種常見的多組分免疫分析模式，其基本原理是以不同的信號探針標記不同組分，通過識別不同探針的信號來檢測不同組分如在光譜法中以波長識別，電化學法中以電位識別，質(zhì)譜法中以荷質(zhì)比識別，放射法中以射線能量識別。時間分辨突光多組分免疫分析是一種典型的基于多標記物模式的技術(shù)，該技術(shù)米用具有不同熒光壽命的稀土金屬配合物作為探針，分別標記不同組分，然后通過熒光壽命的差異在不同時間窗口實現(xiàn)不同組分的檢測。由于熒光壽命短，利用時間分辨熒光需要精密的熒光壽命測量系統(tǒng)，價格昂貴?；瘜W發(fā)光反應中存在著類似現(xiàn)象，很多化學發(fā)光反應有著截然不同的動力學特征有的是閃光型化學發(fā)光反應，即信號迅速達到峰值，之后迅速衰減，發(fā)光時間很短，只有零點幾秒到幾秒；有的是輝光型化學發(fā)光反應，即發(fā)光試劑混合時初始發(fā)光信號極低，但隨著時間延長發(fā)光信號逐漸增強，發(fā)光時間從幾分鐘到幾十分鐘，或幾小時至更久；有的還是震蕩反應，即隨時間變化，化學發(fā)光信號發(fā)生周期性增強和衰減。但是，目前尚未見到有報道將這種現(xiàn)象用于化學發(fā)光免疫分析，以實現(xiàn)多種組分的免疫測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，以實現(xiàn)通過時間分辨化學發(fā)光的多組分。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，包括如下步驟
(I)用化學發(fā)光反應動力學性質(zhì)不同的化學發(fā)光標記物分別標記不同的抗原或抗體，然后與待測物同時加入包被有相應抗體或抗原的酶標板反應孔中進行免疫反應； (2)向所述反應孔中加入引發(fā)化學發(fā)光的共反應劑，然后在不同時間窗口分別檢測不同的化學發(fā)光信號。本發(fā)明中，由于不同的化學發(fā)光標記物具有不同的化學發(fā)光反應動力學性質(zhì)，因此加入共反應劑后在不同的時間窗口呈現(xiàn)出不同組分的光信號。優(yōu)選的，所述步驟(I)是用閃光型化學發(fā)光標記物和輝光型化學發(fā)光標記物分別標記不同的抗原或抗體，然后與待測物同時加入包被有相應抗體或抗原的酶標板反應孔中進行免疫反應。優(yōu)選的，所述步驟(I)是用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶分別標記克倫特羅和萊克多巴胺，然后與克倫特羅和萊克多巴胺同時加入到包被有克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體的酶標板反應孔中進行免疫反應。優(yōu)選的，所述包被的具體方法為將克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體溶解于O. 10M pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中至克倫特羅抗體濃度為8. O Pg/mL，萊克多巴胺抗體的濃度為10.0 Pg/mL，混勻，得包被液；然后將包被液加入到聚苯乙烯酶標板，然后置于4 °C條件下包被過夜，倒去孔中未結(jié)合的抗體溶液，然后每孔用洗液清洗，再向每個孔中加入封閉緩沖液，在37 °C下封閉1. 5小時，將酶標板用洗液清洗3次。優(yōu)選的，所述共反應劑含有魯米諾，對碘苯酚，H2O2和堿性磷酸酶底物液。優(yōu)選的，所述共反應劑含有1. OXlO-4 M的魯米諾、5. OXlO-6 M的對碘苯酚、IOmM的H2O2和25 mM的堿性磷酸酶底物液。更優(yōu)選的，所述共反應劑的加入方式為先加入魯米諾和對碘苯酚，再加入H2O2與ALP底物液的混合物，所述H2O2與堿性磷酸酶底物液體積比為1:1。優(yōu)選的，所述共反應劑的pH值為9. O。本發(fā)明中閃光型化學發(fā)光標記物的發(fā)光時間很短，只有零點幾秒到幾秒；輝光型又稱持續(xù)型，發(fā)光時間從幾分鐘到幾十分鐘，或幾小時至更久。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明公開的基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，與傳統(tǒng)的多標記物模式的分光光度法和常規(guī)熒光法相比，無需采用分光系統(tǒng)以分辨不同組分所發(fā)出不同波長的光信號；與時間分辨熒光法相比，化學發(fā)光法的時間窗口更寬前者的時間窗口在毫秒級，而后者的時間窗口從秒級到小時級不等，因此為發(fā)光信號的時間分辨提供了更為便利的條件，無需采用復雜的熒光壽命測量系統(tǒng)，如基于時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù)的精密測量系統(tǒng)，只需用秒表、時鐘等最為常見的計時工具分辨信號；與采用陣列模式的多組分免疫分析法相比，儀器化程度低，操作簡便，只需常規(guī)的化學發(fā)光分析儀即可，無需其常用的復雜儀器設備以及昂貴的陣列型檢測器，因而成本較低。


圖1為本發(fā)明的基于時間分辨的化學發(fā)光免疫分析方法的示意圖。圖2為本發(fā)明檢測克倫特羅和萊克多巴胺的工作曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。
實施例1
結(jié)合附圖1對基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析法做進一步詳細的說明。在實施例中，以克倫特羅(CLE)和萊克多巴胺(RAC)作為模型分析物，辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)作為化學發(fā)光標記物分別標記CLE和RAC，采用基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析法來檢測不同的“瘦肉精”類物質(zhì)。本發(fā)明采用競爭免疫模式，具體免疫分析步驟如下
首先將CLE抗體和RAC抗體溶解于O. 10 M pH 8. O Tris-HCl緩沖液中混合后作為包被液，至CLE抗體濃度為8. O Pg/mL，RAC抗體的濃度為10. O Pg/mL，然后將包被液加入到高親和力的聚苯乙烯96孔酶標板，每孔加入100 UL包被液，然后置于4 °C條件下包被過夜，倒去孔中未結(jié)合的抗體溶液，然后每孔用300 μ L的洗液(含體積分數(shù)為O. 05%吐溫20的Tris-HCl緩沖溶液)清洗3次，再向每個孔中加入150 μ L的封閉緩沖液(SuperBlOck T20， Thermo Fisher Scientific Inc.)在37 °C下封閉1. 5小時,將酶標板用洗液清洗3次；然后，在每個孔中依次加入80 μ L含有不同濃度的CLE和RAC的樣品溶液，同時加入含有HRP標記的CLE抗原(10 Pg/mL)和ALP標記的RAC抗原(20 Pg/mL)各10 μ L，繼續(xù)在37 °〇下孵育1. 5 h，使其充分地發(fā)生競爭性免疫結(jié)合。孵育結(jié)束后清洗酶標板，待進一步檢測。在化學發(fā)光檢測過程中，通過注入共反應劑同時觸發(fā)兩個化學發(fā)光反應。共反應劑包括魯米諾，對碘苯酚，H2O2和ALP底物液。加入方式為先每孔分別加入40 μ L濃度為1.OX 10_4 M的魯米諾和20 μ L濃度為5. OX 10_6 M的對碘苯酚，然后將觸發(fā)兩個化學發(fā)光反應的觸發(fā)劑10 mM的H2O2與25 mM的ALP底物液按1:1的比例混合，取30 μ 立即注入到待檢測的微孔中觸發(fā)反應，通過光電倍增管收集化學發(fā)光信號，光電倍增管的工作電壓設置為-800 V，分別在O. 6 s和25 min的兩個時間窗口處檢測CLE和RAC的化學發(fā)光信號。本發(fā)明所述的檢測過程中，共反應劑的pH值最佳為9.0。對于共反應劑以Tris-HCl為共同的緩沖液體系更為兼容。對碘苯酚作為增強劑，其濃度過大會影響HRP催化的魯米諾-H2O2的動力學特征，使反應時間延長，故優(yōu)選為5. OX 10_6 M。在上述實驗方法和條件下,測定了濃度為I ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的CLE標準溶液和RAC標準溶液，結(jié)果如圖2所示。由檢測結(jié)果可知，CLE和RAC在1. 0-500 ng/mL范圍內(nèi)化學發(fā)光峰高呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)(R2)分別為O. 9985 和 O. 9913，檢測限(S/N=2)都為 O. 50 ng/mL。本實施例中利用了 HRP催化的魯米諾-H2O2反應在一定濃度的增強劑對碘苯酚的作用下在O. 6s即達到發(fā)光峰值，之后迅速衰減，呈現(xiàn)出閃光型化學發(fā)光信號；而ALP催化的金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽水解反應初始發(fā)光極低，隨著時間延長發(fā)光信號增強，整個發(fā)光過程可持續(xù)增強數(shù)小時，呈現(xiàn)輝光型化學發(fā)光信號。由于兩者的發(fā)光動力學特征差異較大，這就為以時間分辨法識別不同組分提供了可能途徑。在本實施例閃光型-輝光型化學發(fā)光組合研究中，將兩個體系進行配對組合，結(jié)果顯示，呈現(xiàn)出時間分辨化學發(fā)光的現(xiàn)象，兩者兼容性較好，相互干擾性較小。為了進一步評估本發(fā)明所述方法的可行性，對其交叉干擾性進行了研究。檢測時，在待檢測樣品中只加入一種分析物CLE (100 ng/mL)或RAC (100 ng/mL)，然后進行檢測。同時，對空白樣品進行檢測作為對照實驗。檢測結(jié)果當檢測只含有CLE的樣品時，由于CLE與其抗體的競爭免疫反應，與對照實驗相比，窗口 I的信號明顯降低，窗口 2的信號基本不變。同樣的，當檢測只含有RAC的樣品時，由于RAC與其抗體的競爭免疫反應，與對照實驗相比，窗口 2的信號明顯降低，而窗口 I的信號基本不變。由此表明，其交叉干擾性可有效地避免。實施例2
以豬尿為樣品，將豬尿用Tris-HCl緩沖液(pH7. O)稀釋5倍，分別加入CLE和RAC，至CLE和RAC的濃度都為10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。在包被CLE抗體和RAC抗體的酶標板上封閉并清洗，然后每孔分別加入80 μ L含CLE和RAC的豬尿稀釋液，同時加入含有HRP標記的CLE抗原(10 Pg/mL)和ALP標記的RAC抗原(20 Pg/mL)各10 μ L，在37 V下孵育1. 5 h，使其發(fā)生競爭性免疫反應。孵育結(jié)束后再清洗酶標板。在上述優(yōu)化的反應條件下觸發(fā)化學發(fā)光反應，分別在O. 6 s和25 min的兩個時間窗口處檢測CLE和RAC的化學發(fā)光信號，檢測結(jié)果如表I所示 表1.空白豬尿樣品中克倫特羅和萊克多巴胺的加標回收率
I i￥i I克倫特羅I萊克多巴胺
I 樣品 I 2I I I3
I 加_重(ng.mL) ' 10 一 I ^100 + 10 ' 50100 —
IIj:
+檢出重(ng.mL) . 8.6 —— 54.7 104.4 —「11—2 技1 . 88.7 —
RSD (%) ' 7.6 —— 6J5J ' 7.2 . 6.53J
■回收率—( ) ' 86109104 j 11290 —「38 —
I_1..1I_
由表I可知，利用本發(fā)明的方法測得CLE和RAC的加標回收率分別為86-104%和88-112%，兩者的標準偏差均低于7. 6%。本發(fā)明中，也可以用吖啶酯-H2O2與ALP-金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽體系組合進行檢測，吖啶酯-H2O2化學發(fā)光反應為典型的閃光型發(fā)光，在O. 4秒時達到峰值，反應條件較為簡單，在H2O2的稀堿性溶液中即能發(fā)光。因此，能夠與ALP-金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽體系組合并呈現(xiàn)出良好的化學發(fā)光時間分辨現(xiàn)象。將吖啶酯和ALP各10 Ul混合于待檢測的反應孔中，其濃度分別為5 X 10_9 M和O. 05 Pg/mL，將含有O. 06%H202的堿性緩沖液20 ul與25 mM的ALP底物液20 ul混合之后，立即加入到待檢測的反應孔中觸發(fā)反應，通過光電倍增管檢測化學發(fā)光信號，在第一個時間窗口 O. 4秒處出現(xiàn)第一個信號值，隨著時間延長，第二個信號的化學發(fā)光強度逐漸增強，可選擇15 min作為第二個時間窗口讀取信號。應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)用化學發(fā)光反應動力學性質(zhì)不同的化學發(fā)光標記物分別標記不同的抗原或抗體，然后與待測物同時加入包被有相應抗體或抗原的酶標板反應孔中進行免疫反應； (2)向所述反應孔中加入引發(fā)化學發(fā)光的共反應劑，然后在不同時間窗口分別檢測不同的化學發(fā)光信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述步驟(I)是用閃光型化學發(fā)光標記物和輝光型化學發(fā)光標記物分別標記不同的抗原或抗體，然后與待測物同時加入包被有相應抗體或抗原的酶標板反應孔中進行免疫反應。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述步驟(I)是用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶分別標記克倫特羅和萊克多巴胺，然后與克倫特羅和萊克多巴胺同時加入到包被有克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體的酶標板反應孔中進行免疫反應。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述包被的具體方法為將克倫特羅抗體和萊克多巴胺抗體溶解于O. 10 M pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中至克倫特羅抗體濃度為8. O Pg/mL，萊克多巴胺抗體的濃度為10.0 Pg/mL，混勻，得包被液；然后將包被液加入到聚苯乙烯酶標板，然后置于4°C條件下包被過夜，倒去孔中未結(jié)合的抗體溶液，然后每孔用洗液清洗，再向每個孔中加入封閉緩沖液，在37 °C下封閉1.5小時，將酶標板用洗液清洗3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，其特征在于所述共反應劑含有魯米諾，對碘苯酚，H2O2和ALP底物液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述基于時間分辨化學發(fā)光的多兀免疫分析方法,其特征在于所述共反應劑含有1. 0Χ1(Γ4 M的魯米諾、5. 0Χ1(Γ6 M的對碘苯酚、IOmM的H2O2和25 mM的堿性磷酸酶底物液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述基于時間分辨化學發(fā)光的多兀免疫分析方法,其特征在于所述共反應劑的加入方式為先加入魯米諾和對碘苯酚，再加入H2O2與堿性磷酸酶底物液的混合物，所述H2O2與堿性磷酸酶底物液體積比為1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述基于時間分辨化學發(fā)光的多兀免疫分析方法,其特征在于所述共反應劑的pH值為9.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于時間分辨化學發(fā)光的多元免疫分析方法，包括以下步驟，用化學發(fā)光反應動力學性質(zhì)不同的化學發(fā)光標記物分別標記不同的抗原或抗體，然后與待測物同時加入包被有相應抗體或抗原的酶標板反應孔中進行免疫反應；再向所述反應孔中加入引發(fā)化學發(fā)光的共反應劑，最后在不同時間窗口分別檢測不同的化學發(fā)光信號；利用該方法，通過時間分辨在不同的時間窗口分別檢測不同組分的化學發(fā)光信號，以實現(xiàn)不同組分的免疫分析，無需使用精密的熒光壽命測量系統(tǒng)，只需采用常規(guī)化學發(fā)光分析儀和普通計時工具即可完成多組分的檢測。
文檔編號G01N33/558GK103018441SQ20121058915
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者付志鋒, 韓靜, 高鴻飛 申請人:西南大學