一種雙相體系促進(jìn)微生物合成2-羥基-3-苯基丙酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種2-羥基-3-苯基丙酸的合成方法，特別涉 及一種雙相體系促進(jìn)微生物合成2-羥基-3-苯基丙酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 2-羥基-3-苯基丙酸(PLA)，是一種廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品和蜂蜜中的有機 酸。大量研究表明PLA可以有效抑制包括食源性致病細(xì)菌、酵母和霉菌等多種微生物的生 長。在飼料添加劑、醫(yī)藥、化妝品等多方面都具有廣泛的應(yīng)用前景。PLA對人和動物細(xì)胞均無 毒性，還具有抑菌譜廣，有望作為一種理想的食品防腐劑而獲得研究人員的廣泛關(guān)注。
[0003] 目前為止，主要應(yīng)用真菌、乳酸菌、丙酸菌等微生物全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PLA。但是轉(zhuǎn)化 過程中底物苯丙酮酸鈉(PPA)在水中溶解度較低，而且對微生物的生長有一定的抑制作用， 生產(chǎn)得到的PLA的抑菌性也會對生產(chǎn)菌株具有抑制作用，底物與產(chǎn)物的雙重抑制作用限制 了 PLA產(chǎn)量的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種水/有機雙相體系及其合成2-羥基-3-苯基丙酸PLA的方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所要解決的第一方面的技術(shù)問題是提供雙相體系促進(jìn)微 生物合成2-羥基-3-苯基丙酸的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)選擇有機溶劑，配制水/有機溶劑雙相體系；
[0007] (2)活化菌體細(xì)胞，收集菌體用緩沖液洗滌后，懸浮在上述的水/有機溶劑雙相體 系，并加入底物苯丙酮酸鈉和葡萄糖，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化；
[0008] (3)在發(fā)酵罐中通過間歇補加底物于水/有機溶劑雙相體系進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PLA。
[0009] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的菌體細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞、芽孢桿菌、乳酸 菌。
[0010] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟（1)中，所述有機溶劑選自甲苯、乙酸乙酯、醇 類、不飽和脂肪酸、液態(tài)烷烴或其取代衍生物。
[0011] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟（1)中，所述有機溶劑選自環(huán)己烷、己烷、辛烷、 三氯甲烷、油酸、異戊醇。
[0012] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(1)中，所述有機溶劑正辛烷。
[0013] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟（1)中，所述水/有機溶劑雙相體系中，水相與有 機相的體積比為1.5-1:1。
[0014] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(2)中，水/有機溶劑雙相體系中含有磷酸鹽緩 沖液;且優(yōu)選pH為7.0。
[0015]本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)化過程的溫度為30-45Γ。
[0016]本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)化過程中采用200rpm-350rpm轉(zhuǎn) 速進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0017] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，在優(yōu)選轉(zhuǎn)化條件下，分批補加大腸桿菌菌體、底物苯 丙酮酸鈉和葡萄糖生產(chǎn)PLA。
[0018] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的大腸桿菌細(xì)胞優(yōu)選為E.coli BL21-pET-28a-D_LDHY52V;制備得到(R)_2_羥基_3_苯基丙酸。
[0019] 本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)化體系中，菌體濃度為10g/L-40g/L，優(yōu)選為20g/L;底物苯丙 酮酸鈉濃度為1 〇g/L_25g/L，優(yōu)選為15g/L。
[0020] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果是：配制形成水/有機雙相體系，底物的溶解度增 加，生成的產(chǎn)物部分溶解于有機相中，減輕了底物和產(chǎn)物對生產(chǎn)菌株的抑制作用，從而提高 產(chǎn)物的產(chǎn)量。
[0021] 雙相體系是形成水相與有機相的混合兩相，在此體系下轉(zhuǎn)化底物PPA生成PLA，PPA 與PLA在水相與有機相中的分配系數(shù)不同，選擇PLA溶解度高，PPA溶解度低的有機溶劑，增 加 PPA的溶解度，同時使生產(chǎn)得到的PLA部分溶解于有機相中，減少由于PLA的抑菌作用造成 的對生產(chǎn)菌株的抑制，從而提高PLA的產(chǎn)量，發(fā)酵罐恒速流加底物生產(chǎn)PLA，測得PLA產(chǎn)量為 22.57 ±0.02g/L。在 5L 發(fā)酵罐中 PLA 產(chǎn)量達(dá)到 22.57g/L。
【附圖說明】
[0022]圖1為水相與正辛烷體積比對PLA產(chǎn)量的影響。
[0023]圖2為轉(zhuǎn)化溫度對PLA產(chǎn)量的影響線形圖。
[0024]圖3為轉(zhuǎn)速對PLA產(chǎn)量的影響柱形圖。
[0025] 圖4為底物濃度對PLA產(chǎn)量的影響柱形圖。
[0026] 圖5為菌體濃度對PLA產(chǎn)量的影響柱形圖。
[0027] 圖6為最優(yōu)條件分批補加底物生產(chǎn)PLA的曲線圖。
[0028] 圖7為發(fā)酵罐生產(chǎn)PLA時間曲線圖。
【具體實施方式】：
[0029] 為進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明優(yōu)選方案進(jìn)行描述，但是應(yīng) 當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限 制。
[0030] 以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明，實施例中采用的實施條件可以根 據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0031] 實施例1:篩選有機溶劑
[0032] 選用大腸桿菌，優(yōu)選如重組大腸桿菌E.coli BL21(pET-28a-D-LDHY52V)(本實驗 室構(gòu)建(211116七&1.，2015))，具體見0呢01510279435.9公開的方法 ;按2%的接種量接種到 裝有100mL的LB液體培養(yǎng)基(含50yg/mL卡那霉素）的搖瓶中，37°C，200rpm恒溫震蕩培養(yǎng)至 0D600 = 1.0左右時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，25°C誘導(dǎo)8h，4°C、6000rpm離心5min，收 集菌體用pH 7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌2次，收集離心得到的菌泥重懸于總體積為10mL，水相 與有機相等體積混合，配制雙相體系(水/甲苯、水/乙酸乙酯、水/環(huán)己烷、水/油酸、水/正辛 烷、水/三氯甲烷、水/正己烷、水/異戊醇），菌體濃度0D600 = 12.23，加入200g/L底物0.5mL， 葡萄糖終濃度20(^/1，37°(：、200印111反應(yīng)111，同時設(shè)置對照組即純水相條件下反應(yīng)生產(chǎn)?1^。 12000rpm離心2min分離上下兩層，分別稀釋適當(dāng)倍數(shù)經(jīng)0.22μπι濾膜過濾后進(jìn)行高效液相檢 測。色譜條件為:色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18分析柱;流動相為A: 0.05 %三氟乙酸水溶 液，8:0.05%三氟乙酸甲醇溶液；流速1111171^11;0-201^11，8:10%-100% ;20-231^11，8: 100%;23-25min，B:100%-10%。柱溫30°C;進(jìn)樣體積5yL;檢測波長210nm。計算所得PLA的 產(chǎn)量為水相與有機相中的PLA的質(zhì)量之和與體系總體積之比。
[0033]比較對照組與實驗組生成PLA的產(chǎn)量。根據(jù)結(jié)果顯示在不同的有機相中，PPA與PLA 的分配系數(shù)不同，PLA在異戊醇、乙酸乙酯和正辛烷中的溶解度相對較高，而在水/正辛烷形 成的雙相體系中，PLA的產(chǎn)量較其他雙相體系高，因此選擇正辛烷做雙相體系的有機相，配 制水/正辛烷雙相體系。
[0034]實施例2優(yōu)化轉(zhuǎn)化過程
[0035]轉(zhuǎn)化過程中，溫度、轉(zhuǎn)速、底物濃度、水相與有機相的體積比、菌體量等因素都會影