一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種河北產(chǎn)落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法，所建立的方法包括采用高效液相色譜法檢測(cè)河北產(chǎn)落花生莖葉藥材中的原兒茶酸，液相色譜條件包括：色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；流動(dòng)相包括：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為酸性水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm~400nm；理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。采用本發(fā)明的建立方法，可有效獲得能夠全面表征河北產(chǎn)落花生莖葉藥材活性組分的指紋圖譜，具有精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性高的特點(diǎn)。獲得的指紋圖譜可用于確保河北產(chǎn)落花生莖葉藥材質(zhì)量的穩(wěn)定一致，進(jìn)而保證其用藥的安全性和有效性。
【專利說明】一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物分析檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法，特別涉及河北產(chǎn)落花生莖葉藥材的高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥作為多組分復(fù)雜體系，其化學(xué)成分眾多，測(cè)定少數(shù)幾種有效成分或指標(biāo)成分不足以確保藥材或制劑的質(zhì)量，而宏觀地綜合分析已成為必然的趨勢(shì)，中藥指紋圖譜這一質(zhì)量控制模式便順應(yīng)了這個(gè)趨勢(shì)。
[0003]中藥指紋圖譜是指中藥材經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，采用一定的分析手段和儀器檢測(cè)得到的能夠標(biāo)識(shí)其中各種組分群體特征的共有峰的圖譜，是以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為基礎(chǔ)，經(jīng)化學(xué)測(cè)定或基因鑒定得到的某種或某產(chǎn)地中藥及其制劑所共有的、具有特異性的組分群體(某類或數(shù)類成分）的特征圖譜或圖像。
[0004]中藥指紋圖譜能比較全面的反映中藥中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，尤其是在現(xiàn)階段絕大多數(shù)有效成分沒有明確的情況下，雖然它不能代替含量測(cè)定，但它比測(cè)定任何單一成分所提供的信息都豐富，能更好地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量，大大提高中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的技術(shù)水平和科技含量，成為建立現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心。
[0005]落花生莖葉收載于《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，為豆科落花生屬植物落花生Arachishypogaea L.的干燥地上部分。本品味甘，性平。具有散瘀消腫，解毒，止汗的功效，用于治療跌打損傷，各種瘡毒和盜汗等癥。近年來隨著對(duì)其化學(xué)成分和藥理活性的深入研究，使得原本作為農(nóng)作物廢棄物的落花生莖葉藥材得到了合理有效的利用，以落花生莖葉藥材為主要原料的制劑，如落花安神合劑、降壓避風(fēng)片等被廣泛應(yīng)用于臨床。
[0006]現(xiàn)有落花生莖葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅從外觀性狀、簡(jiǎn)單的薄層鑒別角度對(duì)其進(jìn)行控制，顯然不能全面準(zhǔn)確表征其內(nèi)在質(zhì)量。指紋圖譜作為中藥及其提取物成方制劑質(zhì)量控制的最優(yōu)方法，已被大家廣為采納。采用中藥指紋圖譜方式，一方面可以通過指紋圖譜的特征性有效的鑒別樣品的真?zhèn)魏彤a(chǎn)地，另一方面通過對(duì)主要指紋圖譜特征峰的面積或比例的控制，能有效控制藥材的質(zhì)量，確保其質(zhì)量的均一和穩(wěn)定，從而保證藥材的安全性和有效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種建立落花生莖葉藥材指紋圖譜的方法，該方法建立的指紋圖譜能夠全面表征落花生莖葉的藥物活性組分，從而表征和控制其內(nèi)在質(zhì)量。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0009]本發(fā)明提供了一種落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法，所述方法包括采用高效液相色譜法檢測(cè)落花生莖葉藥材成分，其中，所述高效液相色譜法的條件包括：
[0010]色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；
[0011]流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為O. 2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，所述梯度洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比：
[0012](Tl5min，流動(dòng)相A為0?5%，流動(dòng)相B為100%?5% ；
[0013]15?60min，流動(dòng)相A為5%?30%，流動(dòng)相B為95%?70% ；
[0014]6(T80min，流動(dòng)相 A 為 30%?50%，流動(dòng)相 B 為 70%?50% ；
[0015]8(Tl00min，流動(dòng)相 A 為 50%?100%，流動(dòng)相 B 為 50%?0%。
[0016]優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的條件還包括：
[0017]流速：1.OmL/min ；
[0018]柱溫：30O;
[0019]檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm;
[0020]理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。
[0021]優(yōu)選地，上述建立方法還包括通過以下步驟制備對(duì)照品溶液：取原兒茶酸對(duì)照品適量，加入甲醇溶解制成每ImL含O. Img的溶液，作為對(duì)照品溶液。
[0022]并且，上述建立方法還包括通過以下步驟制備供試品溶液：取河北產(chǎn)落花生莖葉藥材I. Og,置于燒瓶錐形瓶中，加入70%體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液IOOml，超聲提取lh，提取液濃縮至干，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，用O. 45 μ m濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。
[0023]精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μ I注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到指紋圖譜：
[0024]色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；DiamonSil鉆石I代α8，5μπι，
2.5 X 460mm ;
[0025]流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為O. 2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
[0026]流速：1.OmL/min ；
[0027]柱溫：30°C;
[0028]紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm。
[0029]所述梯度洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比：
[0030](Tl5min，流動(dòng)相A為0?5%，流動(dòng)相B為100%?5% ；
[0031 ] 15?60min，流動(dòng)相A為5%?30%，流動(dòng)相B為95%?70% ；
[0032]6(T80min，流動(dòng)相 A 為 30%?50%，流動(dòng)相 B 為 70%?50% ；
[0033]8(Tl00min，流動(dòng)相 A 為 50%?100%，流動(dòng)相 B 為 50%?0%。
[0034]根據(jù)上述建立方法得到的指紋圖譜中共標(biāo)記有7個(gè)特征吸收峰，其中峰I為對(duì)照品原兒茶酸，各峰以峰I為參照峰的計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積如下：
[0035]相對(duì)保留時(shí)間：
[0036]峰I ：1. OOO ;峰2 ：1. 182 ;峰3 ：1. 547 ;峰4 ：2. 221 ;峰5 ：2. 244 ;峰6 ：2. 307 ;峰7 ：
4.333 ；
[0037]相對(duì)峰面積：
[0038]峰I :1· OOO ;峰2 ：7. 204 ;峰3 ：2. 594 ;峰4 ：1. 452 ;峰5 ：2. 026 ;峰6 ：1. 023 ;峰7 ：
O.421。
[0039]以下是本發(fā)明的詳細(xì)描述：
[0040]色譜條件：采用梯度洗脫的方式；根據(jù)落花生莖葉藥材成分的特點(diǎn)先后嘗試了甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，并且嘗試了多種不同梯度條件，經(jīng)過對(duì)各種色譜圖比較，最后確定乙腈-O. 2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液系統(tǒng)，采用梯度洗脫方式，得到的多個(gè)色譜峰有較好的分離效果。
[0041]供試品溶液采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD)在21(T400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全梯度掃描，并對(duì)各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，在286nm波長(zhǎng)處，各色譜峰分離良好，特征峰明顯且峰型較好，從圖譜中可以盡可能的獲取色譜組分信息及反映整體系組成的全貌，因此選定286nm為指紋圖譜測(cè)定波長(zhǎng)。通過對(duì)luna、Diamonsil鉆石I代、Ameritech,菲羅門-ODS等C18色譜柱比較，最終確定用Diamonsil鉆石I代C18 (5ym,2. 5 X 460mm)；柱溫：30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm ;流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為O. 2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫：洗脫梯度程序?yàn)椋?Tl5min，流動(dòng)相A為O?5%，流動(dòng)相B為100%?5% ；15?60min，流動(dòng)相A為5%?30%，流動(dòng)相B為95%?70% ;6(T80min，流動(dòng)相A為30%?50%，流動(dòng)相B為70%?50% ;8(Tl00min，流動(dòng)相A為50%?100%，流動(dòng)相B為50%?0%。并記錄100分鐘色譜圖。流速：1. Oml/min。進(jìn)樣量10 μ L。
[0042]優(yōu)選對(duì)照品溶液的制備方法為：取原兒茶酸對(duì)照品適量置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
[0043]優(yōu)選供試品溶液的制備方法：通過多次的試驗(yàn)考察確定了本質(zhì)量控制方法中供試品溶液的制備方法，試驗(yàn)比較了 50%體積分?jǐn)?shù)乙醇水溶液、70%體積分?jǐn)?shù)乙醇水溶液、50%體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液、70%體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液、甲醇做提取溶劑對(duì)指紋圖譜的影響，確定用70%體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液作溶劑效果佳，同時(shí)對(duì)超聲和回流不同提取方法和不同提取時(shí)間做了比較。結(jié)果表明使用70%體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液超聲lh，所得色譜峰較多，峰面積較大。因此，優(yōu)選條件為取河北產(chǎn)落花生莖葉藥材I. Og，置于燒瓶錐形瓶中，加入70%體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液100ml，超聲提取lh，提取液濃縮至干，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，用
O.45 μ m濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0044]以原兒茶酸為參照峰的指紋圖譜的制定：
[0045]精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，依據(jù)所得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。以上述方法作為測(cè)試手段，將待測(cè)定樣品指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對(duì)比，計(jì)算相似度，應(yīng)為O. 9(Tl. 00。
[0046]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的河北產(chǎn)落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法具有以下積極效果：
[0047]本發(fā)明首次對(duì)河北產(chǎn)落花生莖葉藥材的指紋圖譜進(jìn)行研究，通過本發(fā)明的方法獲得的指紋圖譜能更全面、完善地表征藥物的有效活性組分及其質(zhì)量。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)河北產(chǎn)落花生莖葉最大可能的化學(xué)成分的全面檢測(cè)，能有效地表征其質(zhì)量。所建立的指紋圖譜可以用于質(zhì)量控制，在保證藥材均一穩(wěn)定的同時(shí)，確保了制劑產(chǎn)品的安全性和有效性。
[0048]并且，本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖I為10批河北產(chǎn)落花生莖葉供試品的指紋圖譜疊加圖；
[0050]SI-天津陳咀（2010. 10)S2-天津陳咀(2011. 10) S3-河北香河（2011. 11)S4_ 河北香河（2010. 11) S5-河北香河（2011. 6) S6-河北香河(2011. 11) S7-河北邪臺(tái)(2010.6)天津陳咀鎮(zhèn)2010.10
天津陳咀鎮(zhèn)2011.10
河北香河2011.11
河北香河2010.11
河北香河2011.6
河北香河2011.11
河北邢臺(tái)2010.6
河北邢臺(tái)2011.6
河北邢臺(tái)2011.10
河北武安2011.8
四元泵，在線脫氣裝置，自動(dòng)進(jìn)樣器，0八0電子天平；超聲儀:[0065]指紋圖譜的測(cè)定:吸取上述原兒茶酸對(duì)照品溶液和落花生莖葉供試品溶液注入液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定，得到河北產(chǎn)落花生莖葉HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其中測(cè)定色譜測(cè)定條件包括:
[0066]色譜柱為Diamonsil C18 (5 μ m, 2.5 X 460mm),采用流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為
0.2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液，梯度洗脫程序見下表2 ;檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm ;柱溫:30°C ;流速:
1.0ml/min,進(jìn)樣量 10 μ L。
[0067]表2 HPLC梯度洗脫程序
[0068]
[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于：所述方法采用HPLC法，其條件為： 色譜柱：C18烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料； 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為O. 2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述梯度洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比： O~15min，流動(dòng)相A為O~5%，流動(dòng)相B為100%~5% ； 15~60min，流動(dòng)相A為5%~30%，流動(dòng)相B為95%~70% ； 60~80min，流動(dòng)相A為30%~50%，流動(dòng)相B為70%~50% ； 80~lOOmin，流動(dòng)相A為50%~100%，流動(dòng)相B為50%~0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立方法，其特征在于： 所述HPLC法檢測(cè)包括以下步驟： 1)制備對(duì)照品溶液； 2)制備供試品溶液； 3)測(cè)定：根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到指紋圖譜： 色譜柱：C18烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料，5 μ m，2. 5 X 460mm ； 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為O. 2%體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
流速：1. OmL/min ； 檢測(cè)波長(zhǎng)：286nm ； 理論塔板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的制備對(duì)照品溶液按如下步驟：取原兒茶酸對(duì)照品適量，加入甲醇溶解制成每Iml含O. Img的溶液，作為對(duì)照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的制備供試品溶液按如下步驟：取落花生莖葉藥材1.0g，置于燒瓶錐形瓶中，加入70 %體積分?jǐn)?shù)甲醇水溶液100ml，超聲提取lh，提取液濃縮至干，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中，用O. 45 μ m濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法得到的指紋圖譜中包括7個(gè)共有吸收峰，其中峰I為對(duì)照品原兒茶酸，各峰以峰I為參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積如下： 相對(duì)保留時(shí)間：
峰 1 ：1. 000 ；峰 2 ：1. 182 ；峰 3 ：1. 547 ；峰 4 ：2. 221 ；峰 5 ：2. 244 ；峰 6 ：2. 307 ;峰 7 :.4.333 ； 相對(duì)峰面積：
峰 1 ：1. 000 ；峰 2 ：7. 204 ；峰 3 ：2. 594 ；峰 4 ：1. 452 ；峰 5 ：2. 026 ；峰 6 ：1. 023 ;峰 7 :.O.421。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103837627SQ201210479915
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】張鐵軍, 王麗莉, 龔蘇曉, 朱雪瑜, 田成旺, 廖茂梁, 許浚, 孫衛(wèi) 申請(qǐng)人:天津藥物研究院