專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用化學(xué)注射不育技術(shù)來(lái)進(jìn)行精子競(jìng)爭(zhēng)研究的方法，屬于動(dòng)物生理學(xué)、行為學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
精子競(jìng)爭(zhēng)(發(fā)生在兩個(gè)以上的雄性的精子相互競(jìng)爭(zhēng)使一個(gè)雌性的卵受精)，是精子型態(tài)與功能以及生殖行為研究的重要內(nèi)容，對(duì)物種進(jìn)化研究有著重要的意義。當(dāng)一個(gè)雌性與兩個(gè)雄性交配后，測(cè)定每一個(gè)雄性的受精比例是研究精子競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制的有效手段。有三種方法用來(lái)測(cè)定受精比例不育雄性技術(shù)，表型特征，及DNA標(biāo)記。輻射法不育雄性技術(shù)因其相對(duì)簡(jiǎn)便而最常被采用，其原理是經(jīng)輻照的雄性的精子仍能使卵正常 受精，但受精卵在發(fā)育過(guò)程中(孵化前)會(huì)死亡，從而可以讓雌性與一個(gè)輻射過(guò)的雄性和一個(gè)野生雄性交配，然后根據(jù)受精卵的死亡率來(lái)確定兩個(gè)雄性各自的受精比例。然而，用輻射法來(lái)節(jié)育雄性受到設(shè)備及費(fèi)用的限制?；瘜W(xué)不育劑四乙烯五胺(Tepa 4 Λ"，，Λ"，，-triethylenephosphoramide;C6H12N3OP)及其衍生物塞替派(Thiotepa 4 Λ"，，Λ"，，- triethylenethiophosphoramide;C6H12N3PS ;比t印a更穩(wěn)定)也常被用來(lái)節(jié)育昆蟲(chóng)。這類(lèi)不育劑可作用于DNA，使鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤發(fā)生交聯(lián)從而阻止DNA合成及細(xì)胞分裂。因而，用化學(xué)不育劑處理過(guò)的雄性仍然產(chǎn)生能夠使卵正常受精的精子，但被這些精子受精的卵在胚胎發(fā)育過(guò)程中會(huì)死亡，從而卵不能孵化?；瘜W(xué)不育法因此有可能代替輻射法處理昆蟲(chóng)用于精子競(jìng)爭(zhēng)研究。在使用化學(xué)不育劑時(shí)，劑量及處理方法都是必須認(rèn)真考慮的，其目的是在最小的副作用下完全使雄性的精子不育?？蛇x擇的處理方法主要有飼喂法和注射法。飼喂法相對(duì)簡(jiǎn)單，但不容易定量，注射法可以很好定量并易于重復(fù)，但可能對(duì)被注射的個(gè)體帶來(lái)傷害從而影響精子競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定結(jié)果。申請(qǐng)人在2010年采用塞替派水溶液飼喂法使地中海粉螟雄性節(jié)育，并證明了化學(xué)不育法可以用于精子競(jìng)爭(zhēng)研究。然而經(jīng)過(guò)后來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn)，飼喂法存在不穩(wěn)定、不易控制及無(wú)法定量從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的缺點(diǎn)?；谏鲜觯景l(fā)明采用塞替派水溶液注射法，建立了一種快速可靠的測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有研究方法的不足，采用塞替派水溶液注射不育法，建立一種快速并且可靠的測(cè)定精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，促進(jìn)精子行為及精子競(jìng)爭(zhēng)的研究。本發(fā)明采用的技術(shù)方案具體如下
一、注射塞替派使雄蟲(chóng)不育
化學(xué)注射不育的原則是在最小的副作用下完全使雄性的精子不育，即注射后雄性在交配能力、精子活力、受精力上與野生雄性沒(méi)有顯著差異，但是被其受精的卵100%在孵化前死亡。
塞替派對(duì)人是有毒的，因此所有的處理都在通風(fēng)櫥里進(jìn)行，并且配戴手套。將雄蟲(chóng)用二氧化碳輕度麻醉后，用玻璃毛細(xì)管針注射器從雄蟲(chóng)腹面柔軟處進(jìn)行注射，每只雄蟲(chóng)注射塞替派(SIGMA-ALDRICH，Co. , USA)的劑量為O. 001 O. 5mg (可以配制成水溶液注射)，注射過(guò)的雄性被單獨(dú)關(guān)養(yǎng)5 72h (使塞替派發(fā)揮作用)備用(注射劑量及注射后的單獨(dú)關(guān)養(yǎng)時(shí)間根據(jù)昆蟲(chóng)種的不同進(jìn)行調(diào)整)，不同昆蟲(chóng)種的最適注射劑量及注射后的單獨(dú)關(guān)養(yǎng)時(shí)間及有效節(jié)育時(shí)間可按下述方法確定
I.給雄性注射不同的劑量，分別關(guān)養(yǎng)一定的時(shí)間，然后分別與野生未交配過(guò)的雌蟲(chóng)交配，之后每天計(jì)數(shù)產(chǎn)卵、受精及孵化率，從而確定可以使雄蟲(chóng)精子完全節(jié)育的最低劑量及注射后有效時(shí)間。2.用一只雌蟲(chóng)與按上述優(yōu)化的注射條件注射過(guò)的雄蟲(chóng)和一只未注射過(guò)的雄蟲(chóng)單獨(dú)關(guān)養(yǎng)，觀察交配情況，并通過(guò)精包精子計(jì)數(shù)、雌性生殖道精子量的動(dòng)態(tài)變化、體外精子游動(dòng)測(cè)定，以確定該注射條件對(duì)雄性交配能力、精子活力和受精力是否有影響。
二、精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的測(cè)定
讓雌蟲(chóng)與上述注射過(guò)的或野生雄蟲(chóng)交配，并根據(jù)孵化率來(lái)確定各個(gè)雄蟲(chóng)的受精比例。用了 4個(gè)處理(I)雌性先與處理過(guò)的雄性交配再與未處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配(T-U) ; (2)雌性先與未處理過(guò)的雄性交配再與處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配(U-T) ; (3)雌性先后與兩個(gè)處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配各一次(T-T)，(4)雌性先后與兩個(gè)未處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配各一次(U-U)。根據(jù)不同研究目的可以調(diào)整兩次交配中間間隔時(shí)間，交配了兩次的雌性被單獨(dú)關(guān)養(yǎng)以記錄孵化率。第二雄性所占的受精卵的比率可按下述公式得到
P2 = I/[SQRT(^A) + I]
k — (Xu-U ~~ Χτ-υ) / (-^T-U ~~ Χτ-τ) h — (Χυ-τ - Xt-t) / (^u-U - Χυ-τ)
其中P2 =第二雄性所占的受精卵的比率，Xuhi和Xt_u = U-U的孵化率和T-U的孵化率；Χτ_τ和Χυ_τ = T-T和U-T的孵化率。則第一雄性的受精卵的比率P1 = I - P2 上述結(jié)果的可靠性可以用如下公式進(jìn)行檢驗(yàn)
即如能得到Xt-U ^ (100 - Xift) X Xu,則表明化學(xué)注射處理過(guò)的精子與正常精子一樣具有相同的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)也說(shuō)明用該化學(xué)注射處理法進(jìn)行精子受精比例測(cè)定得到的結(jié)果是可靠的。本發(fā)明所述方法具有快速、穩(wěn)定及可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于昆蟲(chóng)精子行為及精子競(jìng)爭(zhēng)的研究。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，同樣適用于其它昆蟲(chóng)的精子競(jìng)爭(zhēng)研究等。實(shí)施例I :斜紋夜蛾精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果測(cè)定 一、注射條件的優(yōu)化新羽化的雄蟲(chóng)(〈12 h)用二氧化碳輕度麻醉后，用玻璃毛細(xì)管針注射器從雄蟲(chóng)腹面第三腹節(jié)處進(jìn)行注射，每只雄蟲(chóng)注射塞替派(SIGMA-ALDRICH，Co., USA)的劑量為
O.02 O. 03mg (配制成1%的水溶液注射2 3 μ I)。注射過(guò)的雄性被單獨(dú)關(guān)養(yǎng)5 72h備用。該注射劑量及注射后單獨(dú)關(guān)養(yǎng)時(shí)間是經(jīng)過(guò)多次測(cè)試及優(yōu)化后適合于斜紋夜蛾的處理?xiàng)l件，實(shí)驗(yàn)處理后的斜紋夜蛾雄性在交配能力、精子活力、受精力上與野生雄性沒(méi)有顯著差異，但是被其受精的卵100%在孵化前死亡，因此符合精子競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的要求。劑量及處理方法的優(yōu)化原則是在最小的副作用下完全的使雄性的精子不育。注射條件優(yōu)化方法具體為
I.給雄性注射不同的劑量，分別關(guān)養(yǎng)一定的時(shí)間，然后分別與野生未交配過(guò)的雌蟲(chóng)交配，之后每天(該種成蟲(chóng)壽命約IOd)計(jì)數(shù)產(chǎn)卵、受精及孵化率。結(jié)果表明注射劑量為 O.02 O. 03mg塞替派在關(guān)養(yǎng)5 72h內(nèi)均能使卵正常受精(與野生型對(duì)照)，劑量太低不能完全使雄性節(jié)育，劑量太高被注雄蟲(chóng)死亡率有明顯升高，注射后時(shí)間太短藥效不能完全發(fā)揮作用使雄性不能完全節(jié)育，時(shí)間太長(zhǎng)藥效會(huì)降低同樣不能使雄性完全節(jié)育。2.用一只雌蟲(chóng)與按上述優(yōu)化的注射條件注射過(guò)的雄蟲(chóng)和一只未注射過(guò)的雄蟲(chóng)單獨(dú)關(guān)養(yǎng)，觀察交配情況表明該注射方法對(duì)雄蟲(chóng)競(jìng)爭(zhēng)力沒(méi)有顯著影響。通過(guò)精包精子計(jì)數(shù)、雌性生殖道精子量的動(dòng)態(tài)變化、體外精子游動(dòng)測(cè)定表明該注射方法對(duì)雄蟲(chóng)射精量、精子活力和遷移力沒(méi)有顯著影響。從而確定注射劑量為O. 02 O. 03mg塞替派、關(guān)養(yǎng)5 72h的節(jié)育方式滿足不育法測(cè)定該種精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的要求。三、精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的測(cè)定
讓雌蟲(chóng)與上述注射過(guò)的或野生雄蟲(chóng)交配，并根據(jù)孵化率來(lái)確定各個(gè)雄蟲(chóng)的受精比例。用了 4個(gè)處理(I)雌性先與處理過(guò)的雄性交配再與未處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配(T-U) ; (2)雌性先與未處理過(guò)的雄性交配再與處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配(U-T) ; (3)雌性先后與兩個(gè)處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配各一次(T-T)，(4)雌性先后與兩個(gè)未處理過(guò)的雄蟲(chóng)交配各一次(U-U)。第一次交配發(fā)生在注射的當(dāng)夜，交配過(guò)的雌蟲(chóng)被單獨(dú)關(guān)養(yǎng)至第二夜，然后再按處理要求與第二雄配對(duì)。交配了兩次的雌性被單獨(dú)關(guān)養(yǎng)以記錄孵化率。P2及P1可按上述公式得的
對(duì)多次上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，均能得到Xt-U ^ (100 - Χυ_τ) X Xu,表明該化學(xué)注射處理過(guò)的精子與正常精子一樣具有相同的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)也說(shuō)明利用該化學(xué)注射法進(jìn)行斜紋夜蛾精子受精比例測(cè)定得到的結(jié)果是可信的。實(shí)施例I :地中海粉螟精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果測(cè)定
對(duì)地中海粉螟按上述方式用塞替派進(jìn)行注射不育并優(yōu)化得到最適注射條件為每只雄蟲(chóng)注射O. 015 O. 025mg塞替派、關(guān)養(yǎng)12 72h。并用該注射方法進(jìn)行了精子競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，同用能得到Xt-U ^ (100 - Χυ_τ) X Xu,表明用該化學(xué)注射方法進(jìn)行地中海粉螟精子受精比例測(cè)定得到的結(jié)果是可靠的。
權(quán)利要求
1.一種利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于將化學(xué)藥物注射雄性不育技術(shù)運(yùn)用于昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的測(cè)定。
2.其方法的具體步驟如下 Cl)每只雄蟲(chóng)注射O. OOl O. 5mg塞替派； (3)注射后的雄蟲(chóng)關(guān)養(yǎng)5 72h； (4)讓雌蟲(chóng)按照不同順序先后與注射節(jié)育或野生雄蟲(chóng)交配，并根據(jù)孵化率來(lái)確定各個(gè)雄蟲(chóng)的受精比例。
3.如權(quán)利要求I所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于被注射和關(guān)養(yǎng)后的雄蟲(chóng)的精子雖能正常受精但受精卵100%在孵化前死亡(注射不育)。
4.如權(quán)利要求I所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于所述雌蟲(chóng)先與注射節(jié)育的雄性交配再與野生雄蟲(chóng)交配(T-U)。
5.如權(quán)利要求I所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于所述雌蟲(chóng)先與野生雄蟲(chóng)交配再與注射節(jié)育的雄蟲(chóng)交配(U-T)。
6.如權(quán)利要求I所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于所述雌蟲(chóng)先后與兩個(gè)野生雄蟲(chóng)交配各一次(U-U)。
7.如權(quán)利要求I所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于所述雌蟲(chóng)先后與兩個(gè)注射節(jié)育的雄蟲(chóng)交配各一次(T-T)。
8.如權(quán)利要求Γ6任一項(xiàng)所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于兩次交配可發(fā)生在同一天也可在不同天，以便于不同的研究目的。
9.如權(quán)利要求Γ6任一項(xiàng)所述的利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，其特征在于兩個(gè)雄性的受精比例可以根據(jù)孵化率來(lái)確定 第二雄性所占的受精卵的比率P2 = 1/[SQRT (姑)+ I] k — (Xu-U ~~ Χτ-υ) / (-^T-U ~~ Χτ-τ) h — (Χυ-τ - Xt-t) / (^u-U - Χυ-τ) 其中Xm和xt_u = U-U的孵化率和T-U的孵化率；χτ_τ和χυ_τ = T-T和U-T的孵化率； 則第一雄性的受精卵的比率P1 = I - P2O
全文摘要
一種利用化學(xué)注射不育技術(shù)測(cè)定昆蟲(chóng)精子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果的方法，本發(fā)明涉及一種利用化學(xué)注射不育技術(shù)來(lái)進(jìn)行精子競(jìng)爭(zhēng)研究的方法，其原理是經(jīng)化學(xué)不育劑注射的雄性的精子仍能使卵正常受精，但受精卵在發(fā)育過(guò)程中(孵化前)會(huì)死亡，從而可以讓雌性與一個(gè)注射過(guò)的雄性和一個(gè)野生雄性交配，然后根據(jù)受精卵的死亡率來(lái)確定兩個(gè)雄性各自的受精比例，從而達(dá)到精子競(jìng)爭(zhēng)研究的目的。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102914642SQ20121043014
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者徐進(jìn), 葉輝, 俞虹 申請(qǐng)人:云南大學(xué)