專利名稱：基于拉曼光譜的尿素同位素豐度的快速檢測方法
基于拉曼光譜的尿素同位素豐度的快速檢測方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于信息檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種15N雙標(biāo)記尿素同位素豐度的拉曼光譜快速檢測方法，用于快速測量雙標(biāo)記尿素的15N同位素豐度。
背景技術(shù)：
氮是植物必需的營養(yǎng)元素，是作物施肥三要素之首，氮肥占我國化肥消費(fèi)比重達(dá) 60%左右。目前我國占世界7%的耕地上消耗著全球35%的氮肥，氮肥的過量施用給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境帶來了巨大危害。中國每年因不合理施肥造成近1000萬噸的氮素流失，直接經(jīng)濟(jì)損失約300億元。而且由于氮肥利用率低下，有60%左右進(jìn)入環(huán)境。因而過量施氮已成為威脅中國長期糧食安全和環(huán)境安全的重大問題。減少氮肥施用量的關(guān)鍵是提高氮肥利用率，而15N同位素示蹤(標(biāo)記)法是目前唯一能直接反映作物對氮肥實(shí)際利用情況的方法。15N同位素示蹤技術(shù)的關(guān)鍵是要對15N同位素豐度的動態(tài)變化進(jìn)行跟蹤和檢測。但是目前15N同位素分析測量儀器昂貴、成本高、操作繁瑣、耗時長、需要大量化學(xué)試劑，難以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)、高效的要求。
①傳統(tǒng)的15N同位素分析方法簡介目前，15N同位素豐度測量的方法有質(zhì)譜法、15N發(fā)射光譜法、核磁共振法和中子活化分析等，其中應(yīng)用較多的是質(zhì)譜法。
質(zhì)譜法是通過測量各種物質(zhì)的原子或原子團(tuán)的荷質(zhì)比來確定被測原子或原子團(tuán)的性質(zhì)和質(zhì)量，具有高靈敏度及精確度的特征，廣泛用于同位素的實(shí)驗室測量。但是這種方法所采用的儀器價格昂貴、系統(tǒng)龐大、操作復(fù)雜，樣品制備繁瑣，操作過程引入污染。且最終的結(jié)果只能給出元素的量，不能測定元素的化學(xué)形態(tài)，這限制了質(zhì)譜法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
15N發(fā)射光譜法需要將樣品轉(zhuǎn)化成氮?dú)?N2),然后用適當(dāng)方法來激發(fā)氮分子發(fā)光， 得到氮的光譜。隨著組成氮分子的氮原子質(zhì)量數(shù)不同而使氮的光譜波長發(fā)生位移，利用這一現(xiàn)象來測定15N同位素豐度。與質(zhì)譜法相比，15N發(fā)射光譜法不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作相對簡便，并能測定含氮量為微克級的樣品。但是，有些元素的原子很難激發(fā)，而且有機(jī)物一般是大分子，組成復(fù)雜，激發(fā)后譜線雜亂難以分析，限制了 15N發(fā)射光譜法的應(yīng)用。
核磁共振法是利用I-IO2兆赫的電磁波照射置于強(qiáng)磁場中的樣品，樣品中的某些原子核在特定的磁場強(qiáng)度下，與照射電磁波發(fā)生共振現(xiàn)象，產(chǎn)生強(qiáng)弱不同的吸收信號。以此來判明某些核素在分子中所處的位置及某些功能團(tuán)上核素的相對數(shù)目。但是由于其造價非常昂貴，而且測定靈敏度較低，故極少用于15N同位素的肥料利用率研究。
中子活化分析是通過鑒別和測試樣本因輻照感生的放射性核素的特征輻射，進(jìn)行元素和核素分析的放射分析化學(xué)方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高，準(zhǔn)確度和精密度也很高， 可測定元素范圍廣；但同樣存在儀器價格昂貴，分析周期較長，操作技術(shù)復(fù)雜的缺陷，在15N 同位素豐度的測量上鮮見報道。而且一般情況下，中子活化分析只能給出元素的量，不能測定元素的化學(xué)形態(tài)。
②15N示蹤尿素同位素快速、無損測量的必要性激光拉曼光譜是研究分子結(jié)構(gòu)的重要工具，最適合研究同種原子的非極性鍵的振動， 所以N同位素分析具有拉曼活性，可以使用拉曼光譜獲得拉曼譜圖來進(jìn)行研究分析。目前基于拉曼光譜技術(shù)的穩(wěn)定同位素分析還處于初探階段，大部分研究局限于光譜同位素效應(yīng)的定性解析，少量的定量分析研究對象僅以金屬化合物為主。而對于示蹤肥料中15N示蹤原子的拉曼光譜測量國內(nèi)外還未見報道。然而，快速有效的檢測示蹤肥料中15N同位素豐度，對于研究肥料的有效性、肥料與作物間的關(guān)系、以及評價肥料對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的影響有重要的意義。相對傳統(tǒng)15N同位素豐度檢測法的破壞性實(shí)驗而言，拉曼光譜測量具有無損、 快速、痕量檢測等優(yōu)點(diǎn)，可以準(zhǔn)確地對作物整個生長周期的氮吸收、利用的動態(tài)情況進(jìn)行跟蹤，并且可以全面反應(yīng)肥料的吸收、利用、代謝規(guī)律，進(jìn)而準(zhǔn)確的評價肥料在作物生長過程中發(fā)揮的作用。同時，拉曼光譜技術(shù)能有效克服傳統(tǒng)15N同位素分析法測量費(fèi)用昂貴、分析測試耗時、采樣數(shù)目偏少和檢測周期長等缺陷。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了 15N雙標(biāo)記尿素同位素豐度的拉曼光譜快速、無損檢測方法，為快速有效地監(jiān)測農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中尿素的吸收、利用情況以及動態(tài)變化規(guī)律提供理論依據(jù)，有望實(shí)現(xiàn) 15N雙標(biāo)記尿素同位素豐度的快速、低成本測量。
基于拉曼光譜的尿素同位素豐度的快速檢測方法包括以下步驟步驟I.取1-10毫克待測15N雙標(biāo)記尿素直接放在載玻片中心，用蓋玻片輕輕按壓，使之表面平整，然后拿掉蓋玻片，得到樣本。
步驟2.將制備好的樣本固定在顯微拉曼光譜儀的顯微鏡鏡頭下方的載物臺上， 調(diào)節(jié)顯微鏡的放大倍數(shù)，使樣本能夠在目鏡視場內(nèi)清晰成像，使用532nm半導(dǎo)體高功率激光器，激光功率為5mv，曝光時間為5s，曝光次數(shù)為3次，采集孔徑為50 μ m,物鏡為50倍， 在上述條件下采集樣本的拉曼光譜，收集βδΟΟαιΓ1 34. 4cm1范圍的拉曼光譜。
步驟3.基于樣本在βδΟΟοπΓ1 34. 4CHT1范圍的拉曼光譜，采用連續(xù)投影算法篩選出15N雙標(biāo)記尿素同位素豐度測量的指紋波段，分別為512cm—1，990cm—1，999cm—1，1700cm—1 和 3470CHT1，得到樣本在波數(shù)分別在 512CHT1，990cm_1, 999cm_1, 1700cm-1 和 3470CHT1 處的拉曼光譜強(qiáng)度值，依次為A12、H、A-和為《ο ,利用這五個值計算同位素豐度Γ
權(quán)利要求
1.基于拉曼光譜的尿素同位素豐度的快速檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟 步驟I.取1-10毫克待測15N雙標(biāo)記尿素直接放在載玻片中心，用蓋玻片輕輕按壓，使之表面平整，然后拿掉蓋玻片，得到樣本； 步驟2.將制備好的樣本固定在顯微拉曼光譜儀的顯微鏡鏡頭下方的載物臺上，調(diào)節(jié)顯微鏡的放大倍數(shù)，使樣本能夠在目鏡視場內(nèi)清晰成像，使用532nm半導(dǎo)體高功率激光器，激光功率為5mv，曝光時間為5s，曝光次數(shù)為3次，采集孔徑為50 μ m,物鏡為50倍，在上述條件下采集樣本的拉曼光譜，收集βδΟΟαιΓ1 34. 4cm1范圍的拉曼光譜； 步驟3.基于樣本在3500CHT1 34. ^nT1范圍的拉曼光譜，采用連續(xù)投影算法篩選出15N雙標(biāo)記尿素同位素豐度測量的指紋波段，分別為512cm—1，990cm—1，999cm—1，1700cm—1和3470cm \得到樣本在波數(shù)分別在512cm \ 990cm \ 999cm \ 1700cm 1和3470cm 1處的拉曼光譜強(qiáng)度值，依次為馬12、、-^ido和，利用這五個值計算冋位素豐度I
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于拉曼光譜的尿素同位素豐度的快速檢測方法。傳統(tǒng)檢測方法速度慢且操作復(fù)雜。本發(fā)明首先待測15N雙標(biāo)記尿素直接放在載玻片中心，用蓋玻片輕輕按壓，使之表面平整，得到樣本。然后樣本固定在顯微拉曼光譜儀的顯微鏡鏡頭下方的載物臺上，調(diào)節(jié)顯微鏡的放大倍數(shù)，使樣本能夠在目鏡視場內(nèi)清晰成像，使用激光器，收集3500cm-1～34.4cm-1范圍的拉曼光譜。最后基于樣本在3500cm-1～34.4cm-1范圍的拉曼光譜，采用連續(xù)投影算法篩選出特定的指紋波段，得到在該波段處的拉曼光譜強(qiáng)度值，利用拉曼光譜強(qiáng)度值計算同位素豐度。本發(fā)明使用方便，可以快速、有效的測量植物15N示蹤同位素豐度。
文檔編號G01N21/65GK102928396SQ20121042251
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者李曉麗, 何勇, 羅榴彬 申請人:浙江大學(xué)