專利名稱：有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備及應(yīng)用。具體是基于有序介孔碳納米材料和離子液體，構(gòu)建的檢測(cè)多種婦科腫瘤標(biāo)志物的無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器，用于檢測(cè)血清中的婦科腫瘤標(biāo)志物。屬于新型納米功能材料與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤(tumor)是人體組織細(xì)胞由于內(nèi)在和外界致病因素長時(shí)間的作用，導(dǎo)致細(xì)胞的遺傳物質(zhì)一脫氧核糖核酸(DNA)產(chǎn)生突變， 使細(xì)胞的生長和分裂失去控制，從而發(fā)生異常增生和功能失調(diào)。腫瘤嚴(yán)重威脅人民健康，是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受重視的重大研究課題。2010年中國深圳召開的國際抗癌聯(lián)盟大會(huì)預(yù)計(jì)到2020年全球每年將有1600萬新增癌癥患者，每年有1000萬人死于癌癥。其中乳腺癌、卵巢癌、多囊卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜癌、宮頸鱗癌、子宮頸癌等婦科腫瘤疾病嚴(yán)重影響了廣大女性的健康，引起了社會(huì)各界和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。近30年來，癌癥發(fā)病率每年以3% 5%的速度增長，80%的新發(fā)腫瘤在中國、印度、巴西和墨西哥等發(fā)展中國家，在世界范圍內(nèi)腫瘤成為第一死亡原因，超過了艾滋病、結(jié)核、瘧疾加起來的死亡原因。以2007年為例，世界有790萬人口死于癌癥，世界衛(wèi)生組織指出，如果能早期進(jìn)行診斷并及時(shí)治療，80% 85 %的腫瘤都可以治愈。腫瘤標(biāo)志物(tumor marker)是指腫瘤組織及細(xì)胞所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的異常表達(dá)，并可以此診斷或監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展。腫瘤標(biāo)志物在正常組織或良性疾病不產(chǎn)生或產(chǎn)量甚微，而腫瘤病人的組織、體液及排泄物中則有大量分泌，測(cè)得值異常升高。腫瘤標(biāo)志物在腫瘤普查、診斷、治療、病情監(jiān)測(cè)、判斷預(yù)后、評(píng)價(jià)療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有很大的實(shí)用價(jià)值。多少年來婦科腫瘤學(xué)家致力于婦科腫瘤早期診斷方法的研究，期望找到一種簡(jiǎn)易、敏感性特異性高的腫瘤標(biāo)志物。近十余年來，這項(xiàng)工程得到了飛速地發(fā)展，特異性血清檢測(cè)物的發(fā)現(xiàn)，挽救了大量婦科惡性腫瘤患者的生命。在治療過程中，通過標(biāo)志物作為病情監(jiān)測(cè)依據(jù)，避免了盲目性。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)包括蛋白質(zhì)組、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-T0F-MS)等的飛速發(fā)展，逐漸發(fā)現(xiàn)了許多有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物。常用的婦科腫瘤標(biāo)志物有以下幾種甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、糖類抗原CA12-5、糖類抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC)等，它們對(duì)臨床及病情監(jiān)測(cè)有重要參考價(jià)值。腫瘤標(biāo)志物從發(fā)現(xiàn)、發(fā)展到現(xiàn)在，隨著檢測(cè)手段的不斷提高，有許多檢測(cè)方法。其中，具有推廣應(yīng)用價(jià)值或已被廣泛應(yīng)用的主要有放射免疫分析法(RIA)、酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)(EIA)、免疫放射分析法(IRMA)、免疫化學(xué)發(fā)光分析(CLIA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TrFLA)、液體芯片檢測(cè)技術(shù)和SELDI-TOF-MS等。但這些技術(shù)一般需要復(fù)雜的監(jiān)測(cè)儀器，檢測(cè)時(shí)間長，普及性差，且有些試劑具有放射性，對(duì)人體有一定的危害。電化學(xué)免疫傳感器是一種將電化學(xué)分析方法與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的生物傳 感器，其具有靈敏、特異、快速、成本低、操作簡(jiǎn)單、易數(shù)字化和易實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)輸出檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于癌癥疾病的診斷。另外，電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了納米材料大的比表面積、較強(qiáng)的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性等特點(diǎn)，顯著改善了傳感器的性能，為電化學(xué)免疫傳感器的研究和應(yīng)用開辟了一個(gè)新的天地。有序介孔碳(OMC)是一類新型的介孔材料,1999年合成方法首次被Ryoo等人報(bào)道。由于介孔碳具有較高的比表面積、有序的孔徑分布，同時(shí)具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、較強(qiáng)的吸附能力，可應(yīng)用于催化、儲(chǔ)氫、吸附等領(lǐng)域。有序介孔碳的酸堿穩(wěn)定性良好，合成方法簡(jiǎn)單，易于制得，其本身是很好的良導(dǎo)體，具有較好的導(dǎo)電性。本發(fā)明采用有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料為電極基體材料，利用離子液體導(dǎo)電率高、電位窗口寬，以及蛋白質(zhì)可與離子液體通過離子間的相互作用，連接?jì)D科腫瘤腫瘤標(biāo)志物的抗體、抗原制得無標(biāo)記電流型免疫傳感器。本發(fā)明免疫傳感器的檢出限低，對(duì)多種婦科腫瘤標(biāo)志物的檢出限在O. 68 1.3 pg 之間。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有婦科腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)學(xué)術(shù)研究成果和專利技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，Tang等研究了檢測(cè)CEA的電化學(xué)免疫傳感器，該傳感器的檢測(cè)限為I. 2 ng · mL—參見Tang，D. P.，Ren, J. J. Anal. Chem. 2010，80，8064-8070. ;CN200910212772. 0 公開了一種用于檢測(cè)甲胎蛋白的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，該傳感器的檢測(cè)限達(dá)到O. 035 ng · mL'由此可以看出，本發(fā)明的方法靈敏度得到了顯著提高，靈敏度均優(yōu)于以上兩種方法，可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)和不足，結(jié)合有序介孔碳納米材料和離子液體的優(yōu)勢(shì)，提供了一種識(shí)別快速、靈敏度高、成本低、便于操作的檢測(cè)多種婦科腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是將該電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于多種婦科腫瘤標(biāo)志物的靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下
I.有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備，其特征在于，包括以下步驟
(1)有序介孔碳納米材料的制備；
(2)有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備；
(3)婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備。(I)中所述的有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
I)取 O. 40 O. 50 g 苯酚，I. 4 I. 8 mL 37% 的甲醛溶液，10 13 mL O. I mo I · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應(yīng)液O. 5 h ;2)預(yù)先將O.64 O. 80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 54 mL超純水中，攪拌溶解，加入I)反應(yīng)液中，反應(yīng)16 18 h，反應(yīng)液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，當(dāng)沉淀出現(xiàn)時(shí)，停止反應(yīng),反應(yīng)液冷卻至室溫；
3)加173 217mL超純水于2)得到的反應(yīng)液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在馬弗爐中130 °C反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。(2)中所述的有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍(lán)溶液以體積比I : O. 5 I : 2混合，在室溫條件下攪拌24 30 h ;
2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍(lán)，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料；
3)將2)中所制得的復(fù)合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的混合液A，室溫儲(chǔ)存下備用。(3)中所述的婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑3 5mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將5 8PL混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將5 8PL濃度為10婦科腫瘤標(biāo)志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4 °C濕潤條件下晾干；
4)將3 6PL濃度為100 Pg · mL—1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器。2.本發(fā)明所述的制備的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，用于婦科腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，步驟如下
(1)工作曲線的繪制；
(2)婦科腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。(I)中所述工作曲線的繪制，步驟如下
I)本發(fā)明將所述的婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器作為工作電極，在該工作電極表面上滴涂不同濃度的婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 1濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干，4 °C保存；
2)將參比電極一飽和甘汞電極、對(duì)電極一鉬柱電極和工作電極正確連接在電化學(xué)工作站上； 3)在pH=7.O 8. O磷酸鹽緩沖液中，通過方波伏安法，檢測(cè)婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加前后電流響應(yīng)值的變化；
4)根據(jù)所得電流響應(yīng)值與婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。3.本發(fā)明所述的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，所述的婦科腫瘤標(biāo)志物選自下列之一原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(糖類抗原CA12-5、糖鏈抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、糖鏈抗原CA15-3、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原SCC、堿性磷酸酶ALP)，胎盤性及胚胎性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、組織多肽抗原TPA、人絨毛膜促性腺激素HCG)，癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物(乳腺癌易感基因BRCA1、乳腺癌易感基因BRCA2)。本發(fā)明的有益成果
(I)利用有序介孔碳納米材料大的比表面積、較大的孔體積、優(yōu)良的導(dǎo)電性能以及對(duì)甲苯胺藍(lán)的吸附能力等特點(diǎn)，用有序介孔碳納米材料作為本發(fā)明免疫傳感器的電極修飾材料，顯著改善了電極的性能。(2)將離子液體引入本發(fā)明免疫傳感器的制備中，利用離子液體導(dǎo)電率高，電位窗口寬等特點(diǎn)，及蛋白質(zhì)可以與離子液體通過離子間的相互作用，連接?jì)D科腫瘤腫瘤標(biāo)志物的抗體，可增加修飾電極上抗體的固定量，從而提高了婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度。(3)本發(fā)明避免了酶的使用，克服了因酶的使用所造成的傳感器不穩(wěn)定，易失活的 缺點(diǎn)。(4)該傳感器利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，顯著提高了檢測(cè)方法的特異性。(5)本發(fā)明改變婦科腫瘤標(biāo)志物種類即可實(shí)現(xiàn)多種婦科腫瘤標(biāo)志物的高靈敏、特異性檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，有利于腫瘤標(biāo)志物傳感器的商品化。(6)本發(fā)明所制備的電化學(xué)免疫傳感器，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，3min即可完成樣品測(cè)定，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量樣品的測(cè)定。


下面結(jié)合

和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。圖I為有序介孔碳納米材料的掃描電鏡圖。圖2為婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的構(gòu)建過程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備，包括以下步驟
(I)有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
1)取O.4 g苯酚，I. 4 mL 37%的甲醛溶液，10 mL O. I mo I · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應(yīng)液O. 5 h ；
2)預(yù)先將O.64 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 mL超純水中，攪拌溶解，加入
I)反應(yīng)液中，反應(yīng)16 h,反應(yīng)液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色,當(dāng)沉淀出現(xiàn)時(shí),停止反應(yīng),反應(yīng)液冷卻
至室溫；
3)加173mL超純水于2)得到的反應(yīng)液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在馬弗爐中130°C反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。納米材料的形貌見圖1，由圖I可以看出，有序介孔碳納米材料為球形介孔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為100 nm,顆粒均勻。(2)有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍(lán)溶液以體積比I : O. 5混合，在室溫條件下攪拌24 h ；2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍(lán)，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料；
3)將2)中所制得的復(fù)合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的混合液A，室溫儲(chǔ)存下備用。(3)婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備，結(jié)合圖2進(jìn)行制備，步驟如下
1)將直徑3mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將5μ 混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將5PL濃度為10 Pg 婦科腫瘤標(biāo)志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干；
4)將3PL濃度為100μg · mL—1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)施例2
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備，包括以下步驟
(I)有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
1)取O.45 g苯酚，I. 6 mL 37%的甲醛溶液，11 mL O. I mol · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應(yīng)液O. 5 h ；
2)預(yù)先將O.72 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于49 mL超純水中，攪拌溶解，力口入I)反應(yīng)液中，反應(yīng)17 h,反應(yīng)液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色,當(dāng)沉淀出現(xiàn)時(shí),停止反應(yīng),反應(yīng)液冷
卻至室溫；
3)加195mL超純水于2)得到的反應(yīng)液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在馬弗爐中130°C反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。納米材料的形貌見圖1，由圖I可以看出，有序介孔碳納米材料為球形介孔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為100 nm,顆粒均勻。(2)有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍(lán)溶液以體積比I : I混合，在室溫條件下攪拌27 h ；
2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍(lán)，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料；
3)將2)中所制得的復(fù)合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的混合液A，室溫儲(chǔ)存下備用。(3)婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備，結(jié)合圖2進(jìn)行制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將6μ 混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將6PL濃度為10 Pg 婦科腫瘤標(biāo)志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干；
4)將5PL濃度為100 Pg 牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)施例3
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，包括以下步驟。( I)有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
1)取O.50 g苯酚，I. 8 mL 37%的甲醛溶液，13 mL O. I mol · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70°C攪拌反應(yīng)液O. 5 h ；
2)預(yù)先將O.80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于54 mL超純水中，攪拌溶解，力口入I)反應(yīng)液中，反應(yīng)18 h，反應(yīng)液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，當(dāng)沉淀出現(xiàn)時(shí)，停止反應(yīng)，冷卻至室溫；
3)加217mL超純水于2)得到的反應(yīng)液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在馬弗爐中130°C反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。納米材料的形貌見圖1，由圖I可以看出，有序介孔碳納米材料為球形介孔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為100 nm,顆粒均勻。(2)有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍(lán)溶液以體積比I : 2混合，在室溫條件下攪拌30 h ；
2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍(lán)，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料；
3)將2)中所制得的復(fù)合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的混合液A，室溫儲(chǔ)存下備用。(3)婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備，結(jié)合圖2進(jìn)行制備，步驟如下
1)將直徑5mm的玻碳電極依次用I.0、0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將8μ 混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將8PL濃度為10婦科腫瘤標(biāo)志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干；
4)將6PL濃度為100 Pg 牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器。實(shí)施例4
實(shí)施例I 3制備的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，分別用于婦科腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，包括以下步驟
I)本發(fā)明將所述的婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器作為工作電極，在該工作電極表面上滴涂不同濃度的婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 1濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干，4 °C保存；
2)將參比電極一飽和甘汞電極、對(duì)電極一鉬柱電極和工作電極正確連接在電化學(xué)工作站上；
3)在pH=7. O 8. O磷酸鹽緩沖液中，通過方波伏安法檢測(cè)婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加前后電流響應(yīng)值的變化；4)根據(jù)所得電流響應(yīng)值與婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。實(shí)施例5原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)CA12_5、CA 15-3或CA19-9
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備及應(yīng)用，包括以下步驟
(1)選擇原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)，按照實(shí)施例Γ3所述的步驟制備電化學(xué)免疫傳感器；
(2)按照實(shí)施例4所述的步驟繪制工作曲線；
(3)原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)指標(biāo)見表I。表I原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)指標(biāo)_
權(quán)利要求
1.一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，包括以下步驟 (1)有序介孔碳納米材料的制備； (2)有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備； (3)婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備。
2.如權(quán)利要求I所述的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下(1)取O. 40 O. 50 g 苯酚，I. 4 1.8 mL 37% 的甲醛溶液，10 13 mL O. I mo I *L_1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應(yīng)液O. 5 h ; (2)預(yù)先將O.64 O. 80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 54 mL超純水中，攪拌溶解，加入(I)反應(yīng)液中，反應(yīng)16 18 h，反應(yīng)液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，當(dāng)沉淀出現(xiàn)時(shí)，停止反應(yīng)，反應(yīng)液冷卻至室溫； (3)加173 217mL超純水于(2)得到的反應(yīng)液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在馬弗爐中130 °C反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體； (4)將(3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。
3.如權(quán)利要求I中所述的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備，步驟如下 (1)將濃度為2mg · mL-1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL-1的甲苯胺藍(lán)溶液以體積比I : O. 5 I : 2混合，在室溫條件下震蕩24 30 h ; (2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍(lán)，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料； (3)將(2)中制得的復(fù)合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的混合液A，室溫儲(chǔ)存下備用。
4.如權(quán)利要求I中所述的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述電化學(xué)免疫傳感器的制備步驟如下 (1)將直徑3 5mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面； (2)將5 8PL混合液A滴涂到步驟(I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥； (3)將5 8PL濃度為10 Pg · ml/1婦科腫瘤標(biāo)志物抗體滴涂到步驟(2)得到的電極表面，4 °C濕潤條件下晾干； (4)將3 6PL濃度為100 Pg .mr1牛血清白蛋白滴涂到步驟(3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，電化學(xué)免疫傳感器制備完成。
5.如權(quán)利要求Γ4所述的制備的婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，用于婦科腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，方法如下 (1)工作曲線的繪制； (2)婦科腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)； (O中所述的工作曲線的繪制，步驟如下 I)本發(fā)明將所述的婦科腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器作為工作電極，在該工作電極表面上滴涂不同濃度的婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 1濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干，4 °C保存； 2)將參比電極一飽和甘汞電極、對(duì)電極一鉬柱電極和工作電極正確連接在電化學(xué)工作站上； 3)在pH=7.O 8. O磷酸鹽緩沖液中，通過方波伏安法檢測(cè)婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加前后電流響應(yīng)值的變化； 4)根據(jù)所得電流響應(yīng)值與婦科腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。
6.如權(quán)利要求I 5所述的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，其特征在于，所述的婦科腫瘤標(biāo)志物選自下列之一原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(糖類抗原CA12-5、糖鏈抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、糖鏈抗原CA15-3、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原SCC、堿性磷酸酶ALP)，胎盤性及胚胎性 腫瘤相關(guān)物質(zhì)(甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、組織多肽抗原TPA、人絨毛膜促性腺激素HCG)，癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物(乳腺癌易感基因BRCA1、乳腺癌易感基因BRCA2)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備及應(yīng)用，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于(1)有序介孔碳納米材料的制備；(2)有序介孔碳-甲苯胺藍(lán)復(fù)合材料的制備；(3)婦科腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于識(shí)別快速、靈敏度高、檢測(cè)限低、成本低、便于操作，能實(shí)現(xiàn)多種婦科腫瘤標(biāo)志物的高靈敏、特異性、快速準(zhǔn)確檢測(cè)，3min即可完成樣品測(cè)定，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量樣品的測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N27/327GK102854235SQ20121034081
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月15日
發(fā)明者魏琴, 范海霞, 李賀, 張勇, 吳丹, 杜斌, 于海琴, 馬洪敏, 龐雪輝, 王志玲, 羅川南, 李慧芝, 范大偉, 曹偉, 朱沛華, 張永芳 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)