專利名稱：一種用于hplc測定絲瓜種子內(nèi)源激素含量的樣品前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種用于HPLC測定絲瓜種子內(nèi)源激素含量的樣品前處理方法。
背景技術(shù)：
絲瓜是我國南北皆可栽培的蔬菜作物。絲瓜除自身具有豐富的營養(yǎng)價值外，還有醫(yī)療保健作用，具有清熱化痰等功效。深入研究絲瓜種子，可為絲瓜良種繁育提供理論基 礎(chǔ)。植物激素是植物生命活動的重要調(diào)控者。植物激素自身在植物體內(nèi)含量甚微，組成復(fù)雜，再加上種子材料中干擾物質(zhì)較多，因而，對種子內(nèi)的植物激素進行測定比較困難。高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,又稱高效液相層析，簡稱HPLC)，它作為一種重要的分析方法，廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中，常用于醫(yī)藥品、化學(xué)、環(huán)保、生命科學(xué)、與食品工業(yè)的研究上。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成份分離、成分定性及定量分析。適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。高效液相色譜具有重現(xiàn)性好，檢測限低等優(yōu)點，是檢測植物激素較為理想的方法。該方法也成功應(yīng)用到多種植物種子內(nèi)源激素測定上。然而，高效液相色譜法，對樣品前處理要求高。因此設(shè)計一個合理的樣品前處理方法是成功利用HPLC分析待測物質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前用于植物激素前處理的多是采用80%的甲醇作為提取液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，使用PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮)或C18預(yù)處理小柱進行激素的純化。這種前處理方法不但實驗費用較高，而且操作復(fù)雜、費時費事。目前，對絲瓜種子內(nèi)激素含量的測定，尚未見公開報道，且利用上述前處理方法，來處理絲瓜種子效果不甚理想。再加上絲瓜種子自身脂肪等干擾物質(zhì)含量高，因此，設(shè)計一種適合絲瓜種子的前處理方法十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明方法的目的是提供一種利用高效液相色譜測定絲瓜種子內(nèi)源激素樣品前處理的方法，處理步驟包括乙腈浸提，氮吹濃縮，冷凍去脂等，該方法可有效出去脂肪等雜質(zhì)，且操作簡單，結(jié)果可靠，經(jīng)濟高效。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下所述。一種用于HPLC測定絲瓜種子內(nèi)源激素含量的樣品前處理方法，其處理步驟包括
1)制備待測絲瓜種子植物激素粗提液；
2)濃縮粗提液后，再加入3ml pH=8. 0磷酸緩沖溶液(0. lmol/L)；3)冷凍去脂，過濾除雜；
4)用稀鹽酸(0.5 mol/L)調(diào)解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；
5)將酯相濃縮后，用流動相定容至Iml，經(jīng)0.45 Pm的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。其中，所述待測絲瓜種子植物激素粗提液的制備方法為準(zhǔn)確稱取I. 000 g去除外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，并裝入IOml帶蓋離心管中，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4°C冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘渣中加入
4ml的冷乙腈低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復(fù)提取2次,合并3次上清液。

其中，在所述的前處理方法中，所述步驟2)及步驟5)中的濃縮方法是指將步驟I)制備的絲瓜種子植物激素粗提液或步驟4)所得的酯相在35 1下用氮氣吹干。其中，在所述的前處理方法中，所述步驟3)中冷凍去脂，過濾除雜的方法為將步驟2)所得溶液放入-80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min，然后在4°C條件下解凍，低溫離心15min (10000 r/m),過濾棄去雜質(zhì)即可。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是本方法操作簡單，成本低，可以一次處理多個樣品，可節(jié)省時間，純化過程中未做過柱處理，減少了待測物在提取過程中的損失。本方法可用于多種植物激素的提取的前處理，并可滿足高效液相色譜對樣品處理的要求。
具體實施例方式下面給出本發(fā)明的較佳的實施例，這些實施例并非限制本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明所用儀器裝置包括氮吹儀，超聲振蕩儀，低溫高速離心機，超低溫冰箱和普通冰箱。實施例I 處理步驟包括
準(zhǔn)確稱取樣品I. 000 g去掉外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘渣中加入4 ml的冷乙腈低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復(fù)提取2次，合并3次上清液。利用乙腈浸提不但可減少雜質(zhì)的溶出，且乙腈易揮發(fā)，有利于加快氮吹濃縮的效率，縮短實驗用時。在35 °C下用氮氣吹干,加入3 ml pH=8. 0的磷酸緩沖溶液(0. I mol/L)。氮吹儀一次可處理多個樣品，起到縮短實驗用時的作用。放入-80 °C超低溫冰箱中，冰凍30 min，在4 °C條件下解凍，低溫離心15 min(10000 r/m)，過濾棄去雜質(zhì)。相對于過柱處理，此操作方便易行。用鹽酸(0. 5 mol/L)調(diào)解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；在35 1條件下氮氣吹干，用流動相定容至I ml，溶液經(jīng)0.45 U m的微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。
實施例2
利用本方法測定發(fā)育中的絲瓜種子內(nèi)源激素ABA的含量。
準(zhǔn)確稱取樣品I. 000 g去掉外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘洛中加入4 ml的冷乙腈,低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復(fù)提取2次,合并3次上清液。在35 °C條件下用氮氣吹干，加入3 ml pH=8. 0的磷酸緩沖溶液(0. I mol/L)，放A -80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min,在4 °C條件下解凍,低溫離心15 min (10000 r/m),過濾棄去雜質(zhì)，用鹽酸(0. 5 mol/L)調(diào)解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 1條件下氮氣吹干，用流動相定容至I ml，溶液經(jīng)0.45 y m的微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。色譜條件Waters C18反相色譜柱(4. 6 mmX250 mm, 5 iim);柱溫35 °C;流動向體積比為5:5的甲醇和水(含0. 2%磷酸)混合溶液；流速0. 8 ml/min ;進樣量20 U I ;波長260 nm ;用外標(biāo)法進行定量測定。利用本方法對植物激素進行前處理得到較好的純化和富集。該方法與高效液相色 譜連用，成功測定了絲瓜種子內(nèi)源激素ABA的含量。進行加標(biāo)回收率實驗，平均回收率為80. 53%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3. 43%，符合激素測定要求。實際測定授粉后發(fā)育28天的雜交絲瓜種子內(nèi)源ABA含量為1496. 2ng/g Fff (鮮重)
實施例3
利用本方法測定發(fā)育中的絲瓜種子內(nèi)源激素GA3的含量。準(zhǔn)確稱取樣品I. 000 g去掉外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4 1冰箱浸提24 h，低溫離心10 min (10000 r/m)取上清液，再向殘洛中加入4 ml的冷乙腈,低溫超聲振蕩I h,離心10 min (10000 r/m)取上清液,重復(fù)提取2次,合并3次上清液。在35 °C條件下用氮氣吹干,加入3 ml pH=8. 0的磷酸緩沖溶液(0. I mol/L),放A -80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min,在4 °C條件下解凍,低溫離心15 min (10000 r/m),過濾棄去雜質(zhì)，用鹽酸(0. 5 mol/L)調(diào)解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 1條件下氮氣吹干，用流動相定容至I ml，溶液經(jīng)0.45 y m的微孔濾膜過濾后進行HPLC測定。色譜條件Waters C18反相色譜柱(4. 6 mmX250 mm, 5 iim);柱溫35 °C;流動向體積比為5:5的甲醇和水(含0. 2%磷酸)混合溶液；流速0. 8 ml/min ;進樣量20 U I ;波長205 nm ;用外標(biāo)法進行定量測定。利用本方法對植物激素進行前處理得到較好的純化和富集。該方法與高效液相色譜連用，成功測定了絲瓜種子內(nèi)源激素GA3的含量。進行加標(biāo)回收率實驗，平均回收率為71. 33%，RSD小于3. 84%，符合激素測定要求。實際測定授粉后發(fā)育28天的雜交絲瓜種子內(nèi)源GA3含量為2223. 5 ng/g Fff (鮮重)。本方法具有良好的發(fā)展前景，可進一步用于其他植物激素的前處理。
權(quán)利要求
1.一種用于HPLC測定絲瓜種子內(nèi)源激素含量的樣品前處理方法，其特征在于，其處理步驟包括 1)制備待測絲瓜種子植物激素粗提液； 2)濃縮粗提液后，再加入3ml、pH=8. 0,0. lmol/L磷酸緩沖溶液； 3)冷凍去脂，過濾除雜； 4)用0.5 mol/L稀鹽酸調(diào)解至pH=3. (T3. 5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相； 5)將酯相濃縮后，用流動相定容至Iml，經(jīng)0.45 Pm的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。
2.如權(quán)利要求I所述的前處理方法，其特征在于，所述待測絲瓜種子植物激素粗提液的制備方法為準(zhǔn)確稱取I. 000 g去除外種皮的絲瓜種子，在液氮條件下研成粉末，并裝入IOml帶蓋離心管中，加入6 ml的冷乙腈，密封放入4°C冰箱浸提24 h，10000 r/m低溫離心10 min取上清液,再向殘洛中加入4 ml的冷乙腈低溫超聲振蕩I h, 10000 r/m離心10 min取上清液，重復(fù)提取2次，合并3次上清液。
3.如權(quán)利要求I所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟2)及步驟5)中的濃縮方法是指將步驟I)制備的絲瓜種子植物激素粗提液或步驟4)所得的酯相在35 °C下用氮氣吹干。
4.如權(quán)利要求I所述的前處理方法，其特征在于，所述步驟3)中冷凍去脂，過濾除雜的方法為將步驟2)所得溶液放入-80 °C超低溫冰箱中冰凍30 min，然后在4°C條件下解凍，10000 r/m低溫離心15 min,過濾棄去雜質(zhì)即可。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于HPLC測定絲瓜種子內(nèi)源激素含量的樣品前處理方法，其處理步驟包括制備待測絲瓜種子植物激素粗提液；濃縮粗提液后，再加入3ml、pH=8.0、0.1mol/L磷酸緩沖溶液；冷凍去脂，過濾除雜；用0.5mol/L稀鹽酸調(diào)解至pH=3.0~3.5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相；將酯相濃縮后，用流動相定容至1ml，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。本方法操作簡單，成本低，可以一次處理多個樣品，可節(jié)省時間，純化過程中未做過柱處理，減少了待測物在提取過程中的損失。本方法可用于多種植物激素的提取的前處理，并可滿足高效液相色譜對樣品處理的要求。
文檔編號G01N30/06GK102830183SQ201210267580
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者胡晉, 秦國臣, 王洋, 朱巖芳, 祝水金 申請人:浙江大學(xué)