專利名稱：一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，特別涉及一種以近紅外碲化鎘(CdTe)量子點為標記物的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，屬于電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近紅外光具有組織穿透性好、背景干擾低以及光學(xué)損傷小等優(yōu)點，因此近紅外分析技術(shù)在生命分析科學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，新型近紅外發(fā)光體和相關(guān)傳感策略的構(gòu)建也隨之變得意義深遠；電致化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence, ECL)分析無需激發(fā)光源、信噪比高而且具有比常規(guī)熒光分析法更高的靈敏度，是一種已在多個研究領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用的分析技術(shù)；但是由于傳統(tǒng)ECL物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光輻射都在可見光區(qū)域，如魯米 諾和[Ru(bpy)3]2+(bpy=2, 2' -bipyridyine)等，因此ECL分析技術(shù)的傳感應(yīng)用一直局限在可見光區(qū)域。伴隨著納米制備技術(shù)的進步，近紅外量子點在開發(fā)新型近紅外ECL發(fā)光體顯出巨大潛力；然而，目前近紅外量子點ECL的研究主要在陰極進行，在陽極卻難有突破，而且其ECL激發(fā)電位較高并且在實際應(yīng)用中難以克服復(fù)雜電化學(xué)反應(yīng)和生物組織中溶解氧的干擾；同時，現(xiàn)有技術(shù)中采用的量子點近紅外ECL輻射集中在700nm附近，無法有效消除生物組織的背景干擾(Jing Wang, Heyou Han, Xiaochun Jiang, Liang Huang, Lina Chen, and NaLi Anal. Chem. ,2012,84(11), 4893 - 4899);因此，尋求能夠克服復(fù)雜電化學(xué)反應(yīng)和生物組織背景干擾的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法已成為業(yè)界不斷追求的目標。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法。術(shù)語說明表面帶有羧基的碲化鎘量子點根據(jù)已公開專利文獻中描述的方法得到，該專利文獻的公開號為CN101870459A ；抗原本發(fā)明所述的抗原指甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖類抗原125，糖類抗原15-3，糖類抗原72-4，糖類抗原19-9，前列腺特異性抗原，游離前列腺特異抗原，愛滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲狀腺球蛋白，肌鈣蛋白T抗原，肌紅蛋白抗原等常規(guī)的抗原。一抗本發(fā)明所述的一抗指對上述抗原對應(yīng)產(chǎn)生的抗體，本發(fā)明對于上述抗原對應(yīng)的單克隆抗體效果更好。二抗本發(fā)明所述的二抗指對上述抗原和一抗對應(yīng)產(chǎn)生的二抗。處理過的病人血清樣品指按照醫(yī)學(xué)領(lǐng)域通用的血清處理標準處理后的病人血清樣品；本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，包括步驟(I)近紅外量子點與二抗的連接、步驟(2)夾心免疫反應(yīng)并制得電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器和步驟(3)用電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進行免疫檢測(I)近紅外量子點與二抗的連接將表面帶有羧基的量子點作為標記物并分散到含有I-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺的緩沖溶液中，加入二抗，漩渦混合震蕩均勻，在室溫下反應(yīng),對反應(yīng)溶液進行離心,并用上述緩沖溶液洗漆2-5次,得量子點標記的二抗；(2)夾心免疫反應(yīng)首先，將表面枝接有羧基的固體電極在含有I-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的緩沖溶液中活化后，取含有一抗的緩沖溶液滴加到電極表面，在30-50°C下孵育l_6h，將一抗固定在電極上，并采用3%體積濃度的牛血清白蛋白滴加到電極封閉非特異性吸附的活性位點；其次，取含有不同濃度待測抗原(antigen，Ag)的緩沖溶 液或處理過的病人血清樣品滴涂到電極上，在35-45°C下孵育l_6h，清洗電極；最后，取量子點標記的二抗溶液滴加到上述電極上，在35-45°C下孵育l_6h，制得近紅外電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，所選緩沖溶液因抗原、抗體種類而異，標準是使免疫反應(yīng)的活性最大，電致化學(xué)發(fā)光輻射最強；(3)用電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進行免疫檢測將上述近紅外電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器清洗后，在含有10-100mmol/L2-N-二丁氨基乙醇或三丙胺的緩沖溶液中進行電致化學(xué)發(fā)光測試；先利用夾心免疫分析方法，測定一系列標準濃度抗原的電致化學(xué)發(fā)光信號，然后確定抗原標準工作曲線，最后利用標準曲線法測定待測樣品中抗原的濃度。上述的電致化學(xué)發(fā)光測試是基于碲化鎘(CdTe)標記的近紅外電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器為工作電極、鉬(Pt)為對電極和銀/氯化銀(Ag/AgCl)飽和參比電極的三電極體系實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)和(2)中優(yōu)選的量子點為突光福射在700-1100nm的量子點，特別優(yōu)選熒光輻射在780nm的碲化鎘(CdTe)量子點。根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)中優(yōu)選的固體電極為金電極、鉬電極或玻碳電極中的一種。根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)、(2)和(3)中優(yōu)選的緩沖溶液為磷酸緩沖液、Tri5THCl緩沖溶液或B R緩沖溶液中的一種。根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)和(3)中優(yōu)選的抗原為甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原15-3、糖類抗原72-4、糖類抗原19_9、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異抗原、愛滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲狀腺球蛋白、肌鈣蛋白T抗原和肌紅蛋白抗原中的一種，特別優(yōu)選的抗原為甲胎蛋白抗原；步驟(2)中優(yōu)選的一抗為與甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原15-3、糖類抗原72-4、糖類抗原19_9、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異抗原、愛滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲狀腺球蛋白、肌鈣蛋白T抗原和肌紅蛋白抗原對應(yīng)的單克隆抗體，特別優(yōu)選的一抗為甲胎蛋白單克隆抗體；步驟(I)和(2)中優(yōu)選的二抗為上述抗原和一抗對應(yīng)產(chǎn)生的二抗，特別優(yōu)選的二抗為甲胎蛋白抗原和甲胎蛋白單克隆抗體產(chǎn)生的二抗。本發(fā)明具有以下有益效果
I、本發(fā)明步驟簡單，操作性好；2、本發(fā)明能夠有效地避免潛在的電化學(xué)過程干擾和生物組織背景光干擾；3、本發(fā)明具有較高的靈敏度和精確性，重復(fù)性好。


圖I為本發(fā)明實施例I中所采用碲化鎘(CdTe)量子點的紫外吸收光譜(a)、熒光光譜(b)和量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光光譜(C)。圖2為本發(fā)明實施例I中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖3為本發(fā)明實施例2中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。
圖4為本發(fā)明實施例3中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖5為本發(fā)明實施例4中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖6為本發(fā)明實施例5中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖7為本發(fā)明實施例6中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖8為本發(fā)明實施例7中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖9為本發(fā)明實施例8中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖10為本發(fā)明實施例9中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖11為本發(fā)明實施例10中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖12為本發(fā)明實施例11中量子點標記的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光曲線。圖13為本發(fā)明實施例12的甲胎蛋白抗原濃度測定標準曲線。
具體實施例方式下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明；實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，但是本發(fā)明的保護范圍不限于此。實施例以甲胎蛋白抗原為檢測對象，但如前所述以癌胚抗原，糖類抗原125，糖類抗原15-3，糖類抗原72-4，糖類抗原19-9，前列腺特異性抗原，游離前列腺特異抗原，愛滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲狀腺球蛋白，肌鈣蛋白T抗原，肌紅蛋白抗原等常規(guī)的抗原為檢測對象，用本發(fā)明的近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法進行檢測同樣能夠達到較好的效果。實施例1-11中，所用的表面帶有羧基的量子點，由申請人根據(jù)已公開的專利文獻(公開號CN101870459A)實驗室制的，所用的甲胎蛋白單克隆抗體、抗原及二抗均購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司，所用電致化學(xué)發(fā)光信號由西安瑞邁公司生產(chǎn)的MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)采集，電致化學(xué)發(fā)光光譜由普林斯頓公司生產(chǎn)的光學(xué)多道分析系統(tǒng)采集。實施例I :一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟I,用近紅外量子點作為標記物標記二抗將表面帶有羧基的鎘化碲(CdTe)量子點(熒光輻射波長為780nm)分散于含有l(wèi)OOmg/mLl-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺和100mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺的磷酸緩沖液中，加入二抗，漩渦混合震蕩均勻，在室溫下反應(yīng)，對反應(yīng)溶液進行離心，并用磷酸緩沖液洗漆3次,得到量子點標記的二抗；
步驟2，金電極的表面處理將金電極用a-氧化鋁拋光粉(0.5-0.7i!m)拋光處理后，浸入電極清洗液中l(wèi)Omin，然后分別用二次蒸餾水和乙醇沖洗；將電極用氮氣吹干后浸入5mL0. 02mol/L的巰基乙酸溶液中過夜反應(yīng)，通過金硫鍵將巰基乙酸自組裝到電極上，末端羧基裸露在電極表面；然后分別用乙醇和二次蒸餾水輕輕洗去未接在電極上的巰基乙酸，并用氮氣吹干；步驟3，夾心免疫反應(yīng)首先，將表面枝接有巰基乙酸的金電極浸入含有100mg/mLl-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺和lOOmg/mLN-羥基琥珀酰亞胺pH為7. 4的磷酸緩沖溶液中活化30分鐘，取IOii L2. Oii g/mL含有甲胎蛋白單克隆一抗(Abl)的磷酸緩沖溶液滴加到電極表面，在37°C下孵育3h，將甲胎蛋白單克隆一抗固定在電極上，并采用3%體積濃度的牛血清白蛋白滴加到電極封閉非特異性吸附的活性位點，清洗電極；其次，取IOyL含有80. Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，在37°C下孵育3h，清洗電極；最后，取IOii L量子點標記的單克隆二抗溶液滴加到接好甲胎蛋白抗原(Ag)的電極上，在37°C下孵育3h， 制得近紅外的電致化學(xué)發(fā)光甲胎蛋白免疫傳感器；步驟4，用電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進行免疫檢測將上述制得的近紅外電致化學(xué)發(fā)光甲胎蛋白免疫傳感器清洗后，浸入含有20mmol/L2-N-丁氨基乙醇的pH為9. 2的磷酸緩沖溶液中進行電致化學(xué)發(fā)光測試，電化學(xué)掃描范圍為0-1. 0V，掃描速度為100mV/S，光電倍增管高壓為-800V，在優(yōu)化實驗條件下，通過測定由不同標準濃度甲胎蛋白抗原形成的免疫復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光信號，確定甲胎蛋白抗原標準工作曲線，再利用標準曲線法測定樣品中甲胎蛋白抗原的濃度。實施例2 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有40. Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例3 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有10. Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液或處理過的病人血清樣品滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例4 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中,選用10 ii L含有5. Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例5 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有I. Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例6 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有0. 50ng/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例I 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象 步驟3中其次一步中，選用IOii L含有0. I Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例8 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有50. Opg/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例9 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有10. Opg/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例10 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用10 ii L含有5. Opg/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例11 一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，步驟如下選擇直徑為5. Omm的金電極作為載體材料，以甲胎蛋白抗原為檢測對象步驟3中其次一步中，選用IOii L含有100. Ong/mL甲胎蛋白抗原(Ag)的磷酸緩沖溶液滴涂到電極上，其他步驟與實施例I中相同。實施例12 本實施例對實施例1-11中測定樣品中甲胎蛋白抗原的濃度與相對應(yīng)電致化學(xué)發(fā)光強度繪制曲線，如圖13所示；由圖13可知，本發(fā)明具有較高的靈敏度和精確性，在
5.Opg/mL的低濃度下都有較好的檢測結(jié)果，而且本發(fā)明的重復(fù)性也比較好。
權(quán)利要求
1.一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，包括步驟(I)近紅外量子點與二抗的連接、步驟(2 )夾心免疫反應(yīng)并制得電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器和步驟(3 )用電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進行免疫檢測 (1)近紅外量子點與二抗的連接 將表面帶有羧基的量子點作為標記物并分散到含有I-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺的緩沖溶液中，加入二抗，漩渦混合震蕩均勻，在室溫下反應(yīng)，對反應(yīng)溶液進行離心，并用上述緩沖溶液洗滌2-5次，得量子點標記的二抗； (2)夾心免疫反應(yīng) 首先，將表面枝接有羧基的固體電極在含有I-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的緩沖溶液中活化后，取含有一抗的緩沖溶液滴加到電極表面，在30-50°C下孵育l_6h，將一抗固定在電極上，并采用3%體積濃度的牛血清白蛋白滴加到電極封閉非特異性吸附的活性位點；其次，取含有不同濃度待測抗原的緩沖溶液或處理過的病人血清樣品滴涂到電極上，在35-45°C下孵育l_6h，清洗電極；最后，取量子點標記的二抗溶液滴加到上述電極上，在35-45°C下孵育l_6h，制得近紅外電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器； (3)用電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進行免疫檢測 將上述近紅外電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器清洗后，在含有10-100mmol/L2-N- 二丁氨基乙醇或三丙胺的緩沖溶液中進行電致化學(xué)發(fā)光測試；先利用夾心免疫分析方法，測定一系列標準濃度抗原的電致化學(xué)發(fā)光信號，然后確定抗原標準工作曲線，最后利用標準曲線法測定待測樣品中抗原的濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于步驟(I)和(2)中的量子點為熒光輻射在700-1100nm的量子點。
3.如權(quán)利要求2所述的一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于步驟(I)和(2)中的量子點為熒光輻射在780nm的碲化鎘量子點。
4.如權(quán)利要求I所述的一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于步驟(1)、(2)和(3)中所述的緩沖溶液為磷酸緩沖液、Tris^HCl緩沖溶液或B R緩沖溶液中的一種。
5.如權(quán)利要求I所述的一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于步驟(2)中固體電極為金電極、鉬電極或玻碳電極中的一種。
6.如權(quán)利要求I所述的一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述的抗原為甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖類抗原125、糖類抗原15-3、糖類抗原72-4、糖類抗原19-9、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異抗原、愛滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲狀腺球蛋白、肌鈣蛋白T抗原和肌紅蛋白抗原中的一種；步驟(2)中所述的一抗為與抗原對應(yīng)的單克隆抗體；步驟(I)和(2)中所述的二抗為所述抗原與一抗對應(yīng)的單克隆二抗。
7.如權(quán)利要求6所述的一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述的抗原為甲胎蛋白抗原，步驟(2)中所述一抗為甲胎蛋白單克隆抗體，步驟(I)和(2)中所述二抗為甲胎蛋白二抗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種近紅外的電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，屬于電致化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域；包括步驟(1)近紅外量子點與二抗的連接、步驟(2)夾心免疫反應(yīng)并制得電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器和步驟(3)用電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進行免疫檢測三個步驟；本發(fā)明步驟簡單，操作性好，能夠有效地避免潛在的電化學(xué)過程干擾和生物組織背景光干擾，具有較高的靈敏度和精確性，重復(fù)性好。
文檔編號G01N21/76GK102749452SQ20121026228
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者劉淑風(fēng), 梁國棟, 鄒桂征 申請人:山東大學(xué)