一種快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，通過利用萃取溶劑中的氘代分析物的脫附來校正樣品溶液中分析物的萃取過程，氘代分析物的脫附和分析物的萃取同時(shí)進(jìn)行，最后利用色譜質(zhì)譜儀器測(cè)定分析物及其氘代分析物的濃度，進(jìn)而根據(jù)動(dòng)力學(xué)校正方法的計(jì)算公式計(jì)算出游離分析物的濃度,血漿樣品進(jìn)而可以計(jì)算出血漿藥物蛋白結(jié)合率。本方法不改變生物樣品的性質(zhì)和樣品基質(zhì)的影響，可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定生物樣品中游離分析物的含量。
【專利說明】一種快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速分析生物樣品的方法，特別涉及一種樣品前處理、生物樣品分析、血漿中藥物蛋白結(jié)合率測(cè)定的分析方法，屬于化學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】
【背景技術(shù)】
[0002]生物樣品包括各種體液和組織,常用的是血液(血漿、血清、全血)、尿液、唾液。由于生物樣品成分非常復(fù)雜，且一般具有生物活性，因此在常溫條件下，樣品在短時(shí)間內(nèi)就會(huì)變質(zhì)。鑒于此，生物樣品分析前需要對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，如進(jìn)行分離、純化和濃縮。生物樣品的分析方法多種多樣，目前采用的主要方法包括:萃取、電泳、色譜等方法。由于萃取技術(shù)需要較長(zhǎng)的萃取時(shí)間，對(duì)萃取劑要求很高，對(duì)于目標(biāo)物質(zhì)的定量也非常困難，因此萃取法對(duì)于生物樣品的分析存在很大的缺陷；另外，電泳分析生物樣品需要耗費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間和很高的成本；雖然色譜方法比較常用，但其對(duì)樣品的前處理要求也比較高。
[0003]復(fù)雜樣品體系的分離、分析是現(xiàn)代分析科學(xué)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和分析技術(shù)、分析儀器的發(fā)展，分析的靈敏度、分辨率和自動(dòng)化程度也越來越高，而費(fèi)時(shí)費(fèi)力的樣品前處理技術(shù)已成為制約整個(gè)分析過程的瓶頸。因此，研究開發(fā)一種快速、高效、簡(jiǎn)單、綠色的樣品前處理技術(shù)非常關(guān)鍵。
[0004]微萃取技術(shù)是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的新型樣品前處理技術(shù)，具有集采樣、萃取、濃縮、分離于一體，簡(jiǎn)單方便，省時(shí)省力和綠色環(huán)保的特點(diǎn)。液相微萃取(LPME)由于其可選擇的萃取相和萃取模式更多以及更為經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，近年越來越受到國(guó)內(nèi)外分析科學(xué)家重視。中空纖維液相微萃取(HF-LPME)利用多孔中空纖維膜來保護(hù)液體萃取相，具有成本低、有機(jī)溶劑用量少、樣品凈化功能突出、易與多種分析儀器聯(lián)用和操作模式多樣化等其它萃取技術(shù)無法替代的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有廣闊發(fā)展前景的樣品前處理技術(shù)，非常適合于血漿等復(fù)雜生物樣品的分析。
[0005]雖然HF-LPME具有很多優(yōu)點(diǎn)，然而，由于一般的定量方法需要在平衡狀態(tài)下進(jìn)行，其較長(zhǎng)的萃取時(shí)間是HF-LPME最主要的方法缺陷。原因在于，對(duì)于生物樣品分析而言，過長(zhǎng)的萃取時(shí)間會(huì)影響游離藥物和結(jié)合藥物的平衡，進(jìn)而會(huì)在生物樣品的分析中產(chǎn)生一些假象而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。此外，過長(zhǎng)的分析時(shí)間可能導(dǎo)致萃取溶劑的損失，以及生物樣品中酶的代謝等因素也會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)的改變。
[0006]另外，與傳統(tǒng)的液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)不同,微萃取技術(shù)是一種非完全萃取的模式，因而定量校正技術(shù)對(duì)于微萃取技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用十分重要。中空纖維液相微萃取一般采用平衡外標(biāo)法定量，即利用標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的樣品溶液進(jìn)行平衡萃取，再進(jìn)行后續(xù)的儀器分析(色譜法或電泳法等)，根據(jù)儀器的分析信號(hào)和已知的樣品溶液濃度做出工作曲線。這種定量技術(shù)的缺點(diǎn)表現(xiàn)在:(1)平衡時(shí)間長(zhǎng)(多數(shù)血漿樣品的平衡時(shí)間是90-180分鐘)，樣品會(huì)發(fā)生變化；(2)無法測(cè)定游離藥物的濃度，外標(biāo)法測(cè)定的只能是藥物的總濃度(包括游離藥物和結(jié)合藥物)，因而不能用于血漿樣品中藥物蛋白結(jié)合率的測(cè)定。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有生物樣品分析的難點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法。
[0008]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，包括樣品前處理裝置的制作、動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取、樣品中游離分析物濃度的計(jì)算和儀器分析，其中所述樣品前處理采用動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取技術(shù)，所述樣品中游離分析物濃度采用動(dòng)力學(xué)校正樣品溶液中分析物濃度計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，所述儀器分析采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器進(jìn)行定性定量分析。
[0010]優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中所述動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取技術(shù)的樣品前處理方法為中空纖維膜中的氘代分析物的脫附與分析物的萃取同時(shí)進(jìn)行。
[0011]優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中所述中空纖維液相微萃取可選用手動(dòng)或自動(dòng)中空纖維液相微萃取進(jìn)行處理，中空纖維膜材料根據(jù)分析物進(jìn)行選擇。
[0012]優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中采用的動(dòng)力學(xué)校正樣品溶液中游離分析物濃度計(jì)算公式可以進(jìn)一步計(jì)算出血漿樣品的藥物蛋白結(jié)合率。
[0013]一種快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，包括如下步驟:
[0014]a.取聚偏氟乙烯中空纖維膜，剪成1.6-2.0cm的小段，甲醇超聲清洗，自然晾干；
[0015]b.取0.5-10 μ L的移液槍槍頭剪去上半部分，留下2.6-3.0cm長(zhǎng)度的尖嘴部分，其尖端套在步驟a的聚偏氟乙烯中空纖維膜上，聚偏氟乙烯中空纖維膜另一端被封口 ；
[0016]c.取樣品瓶，瓶口蓋上一層帶有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊，將步驟b的連接有聚偏氟乙烯中空纖維膜的通過聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊上的小孔固定于樣品瓶?jī)?nèi)；
[0017]d.通過所述移液槍槍頭自由端向聚偏氟乙烯中空纖維膜內(nèi)腔中加入含有氘代分析物的萃取溶液，然后向所述樣品瓶?jī)?nèi)加入含有分析物的血漿樣品溶液，放到渦旋振蕩器上，轉(zhuǎn)速400-800rpm，萃取5_20分鐘，然后用微量注射器吸取聚偏氟乙烯中空纖維膜內(nèi)腔中的溶液作為樣品，注入氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行所述分析物和氘代分析物的定量分析。
[0018]優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中在所述帶有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊上蓋一層無孔聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊。
[0019]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中步驟a中聚偏氟乙烯中空纖維膜的孔徑0.2 μ m，內(nèi)徑1.2mm,外徑1.4mm,且被剪成1.8cm的小段，甲醇超聲清洗2分鐘，自然晾干。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中步驟b中將移液槍槍頭剪去上半部分，留下2.8cm長(zhǎng)度的尖嘴部分，其尖端套在步驟a的聚偏氟乙烯中空纖維膜上，聚偏氟乙烯中空纖維膜另一端用鉗子夾緊封口。
[0021]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其中步驟d中渦旋振蕩器的轉(zhuǎn)速為550rpm,萃取10分鐘。
[0022]與現(xiàn)有分析方法相比，本發(fā)明涉及的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著進(jìn)步:
[0023](I)檢測(cè)前，生物樣品無需進(jìn)行其它處理，直接由固定在中空纖維膜中的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，業(yè)不用進(jìn)行樣品PH值的改變，樣品一直可以保持生理?xiàng)l件，避免了生理?xiàng)l件的改變對(duì)樣品性質(zhì)的改變(藥物蛋白結(jié)合、PH值等)。
[0024](2)動(dòng)力學(xué)校正可以把萃取時(shí)間控制在20min以內(nèi)，有效地避免了樣品變質(zhì)的影響，避免了樣品中的基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，大大提高了分析方法的準(zhǔn)確度。
[0025](3)無需復(fù)雜的前處理裝置，避免采用微透析涉及的動(dòng)力泵等，裝置簡(jiǎn)單，成本低，沒有非特異性吸附等現(xiàn)象。
[0026](4)由于微萃取具有富集效果，雖然萃取時(shí)間短(10分鐘)，但仍然可以獲得足夠儀器檢測(cè)到的游離分析物的物質(zhì)的量η和Q，進(jìn)而可以計(jì)算出樣品中的游離分析物濃度Ctl和藥物蛋白結(jié)合率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖為動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取裝置示意圖
[0028]其中:1為防止溶劑揮發(fā)的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊(此材質(zhì)的隔墊一般不吸附分析物);2為固定槍頭打孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊；3為樣品瓶；4為微量注射器槍頭；5為聚偏氟乙烯中空纖維膜或聚丙烯中空纖維膜；6為含有氘代分析物的萃取溶液(氘代分析物溶解在萃取溶劑中配制而成);7為含有分析物(分析物有游離形式和蛋白結(jié)合形式)的生物樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明的分析方法通過利用中空纖維液相微萃取進(jìn)行生物樣品中分析物的萃取和富集，利用動(dòng)力學(xué)校正技術(shù)定量，短時(shí)間(5-20分鐘)萃取，最后用色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測(cè)定。
[0030]本發(fā)明的生物樣品中分析物的萃取采用聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜微萃取裝置。把上述中空纖維膜剪成合適的小段，甲醇超聲清洗，自然晾干。把合適大小的移液槍槍頭減去上半部分，留下一定的長(zhǎng)度，此移液槍槍頭用以在樣品瓶中固定中空纖維膜。把聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷(Teflon/PDMS)隔墊打個(gè)孔用以固定移液槍槍頭的上半部分，移液槍槍頭的尖嘴部分套在中空纖維膜上，用一加熱的鐵絲把中空纖維膜固定在移液槍槍頭的尖嘴部分，中空纖維膜另一端用鉗子夾緊封好口。
[0031]本發(fā)明的動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取操作如下:把20-30 μ L的含有氘代分析物(氘代分析物的含量應(yīng)保證其初始濃度和萃取一定時(shí)間后剩余的氘代分析物的含量在色譜儀器分析的線性范圍內(nèi))的萃取溶劑(常用的是正辛醇、對(duì)二甲苯、正己醚等)加到固定在隔墊上的中空纖維膜的內(nèi)腔中，等待2分鐘，待萃取溶劑完全浸潤(rùn)到中空纖維膜壁的孔徑中(纖維膜變透明)。然后把上述中空纖維膜放到4-10ml的樣品瓶中(樣品瓶中加有2-6ml的含有分析物的血漿樣品)，渦旋振蕩，進(jìn)行萃取。在萃取過程中，氘代分析物脫附到樣品溶液中，游離分析物萃取到萃取溶劑中(結(jié)合藥物由于分子較大，超過中空纖維膜的
0.2μηι孔徑,不能被萃取)。萃取時(shí)間為5-20分鐘(一般是平衡萃取時(shí)間的1/10)。萃取完成后，取出中空纖維膜，用微量注射器取纖維膜內(nèi)腔中的萃取溶劑1-2L，注入色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行含量測(cè)定，獲取公式I中的η和Q，此步驟和一般儀器分析的色譜-質(zhì)譜分析相同。
[0032]本發(fā)明的原理基于界面層模型和擴(kuò)散傳質(zhì)理論，推導(dǎo)和建立了動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取(HF-LPME)測(cè)定生物樣品中游離分析物濃度的計(jì)算公式。
[0033]本發(fā)明的游離分析物濃度計(jì)算公式如下:
[0034]Co = KesVM-Q)⑴
[0035]公式(I)中Ctl代表樣品溶液中游離分析物的濃度，η代表預(yù)平衡時(shí)在萃取時(shí)間t萃取溶劑萃取的分析物的物質(zhì)的量(色譜-質(zhì)譜分析獲得的數(shù)值)，Qtl代表預(yù)先加到萃取溶劑中的氘代分析物的物質(zhì)的量(已知量)，Q代表預(yù)平衡時(shí)在萃取時(shí)間t萃取溶劑中殘留的氘代分析物的物質(zhì)的量(色譜-分析獲得的結(jié)果)，Ve代表萃取溶劑的體積，Kes代表分析物在萃取溶劑和樣品溶液間的分配系數(shù)(有些藥物可以查閱文獻(xiàn)獲取改值，文獻(xiàn)檢索不到的可以根據(jù)搖瓶法測(cè)定)。
[0036]根據(jù)公式(1)，則對(duì)于生物樣品中游離分析物的濃度測(cè)定，可以根據(jù)預(yù)平衡時(shí)氘代分析物的脫附來校正樣品溶液中分析物的吸附，克服樣品基質(zhì)的影響，縮短分析時(shí)間。
[0037]對(duì)于血漿樣品，根據(jù)公式I計(jì)算出游離藥物濃度以后，可以進(jìn)而進(jìn)行藥物蛋白結(jié)合率的計(jì)算，計(jì)算公式采用方程2，
[0038]PB(%) = ( ' ~,( , X IOO ^ 2 )


t
[0039]公式(2)中PB (%)代表藥物蛋白結(jié)合率，Ct代表血漿樣品溶液中藥物的總濃度(加入血漿樣品中的藥物濃度)，Cf代 表樣品溶液中游離藥物(分析物)的濃度，也就是根據(jù)公式
(I)計(jì)算出來的游離藥物濃度。
[0040]以下通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0041]實(shí)施例1:
[0042]把聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜(孔徑0.2 μ m,內(nèi)徑1.2mm,外徑1.4mm)剪成
1.8cm的小段，甲醇超聲清洗2分鐘，自然晾干。把0.5-10 μ L的移液槍槍頭減去上半部分，留下2.8cm的長(zhǎng)度，此移液槍槍頭用以在樣品瓶中固定中空纖維膜。把聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷(Teflon/PDMS)隔墊打個(gè)孔用以固定移液槍槍頭的上半部分，移液槍槍頭的尖嘴部分套在中空纖維膜上，用一加熱的鐵絲把中空纖維膜固定在移液槍槍頭的尖嘴部分，中空纖維膜另一端用鉗子夾緊封好口，中空纖維膜的有效長(zhǎng)度為1.5cm。
[0043]如圖1所示，取IOml樣品瓶(3)，聚偏氟乙烯中空纖維膜(5)固定在移液槍槍頭
(4)上，移液器槍頭固定在聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊(2)上，用微量注射器準(zhǔn)確加到中空纖維膜內(nèi)腔中萃取溶液(2.5 μ g/ml的氘代氟硝西泮正辛醇溶液)20 μ L，加入4mL含有分析物(250ng/ml氟硝西泮)的血漿樣品溶液，放到渦旋振蕩器上，550rpm轉(zhuǎn)速，萃取10分鐘，然后用微量注射器吸取中空纖維膜內(nèi)腔中的溶液2 μ L，注入氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析物和氘代分析物的定量分析。
[0044]根據(jù)氟硝西泮和氘代氟硝西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液的儀器工作曲線，求出在萃取10分鐘時(shí)正辛醇萃取溶劑中萃取的氟硝西泮的物質(zhì)的量η (根據(jù)工作曲線求出的氟硝西泮濃度乘以萃取溶劑體積20 μ L)和萃取10分鐘時(shí)正辛醇萃取溶劑中剩余的氘代氟硝西泮的物質(zhì)的量Q (根據(jù)工作曲線求出的氘代氟硝西泮濃度乘以萃取溶劑體積20 μ L)。
[0045]計(jì)算游離藥物濃度，采用公式
【權(quán)利要求】
1.一種快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，包括樣品前處理裝置的制作、動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取、樣品中游離分析物濃度的計(jì)算和儀器分析，其特征在于:所述樣品前處理采用動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取技術(shù)，所述樣品中游離分析物濃度采用動(dòng)力學(xué)校正樣品溶液中分析物濃度計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，所述儀器分析采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器進(jìn)行定性定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取技術(shù)的樣品前處理方法為中空纖維膜中的氘代分析物的脫附與分析物的萃取同時(shí)進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述中空纖維液相微萃取可選用手動(dòng)或自動(dòng)中空纖維液相微萃取進(jìn)行處理，中空纖維膜材料根據(jù)分析物進(jìn)行選擇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:采用的動(dòng)力學(xué)校正樣品溶液中游離分析物濃度計(jì)算公式可以進(jìn)一步計(jì)算出血漿樣品的藥物蛋白結(jié)合率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于包括如下步驟: a.取聚偏氟乙烯中空纖維膜，剪成1.6-2.0cm的小段，甲醇超聲清洗，自然晾干； b.取0.5-10 μ L的移液槍槍頭剪去上半部分，留下2.6-3.0cm長(zhǎng)度的尖嘴部分，其尖端套在步驟a的聚偏氟乙烯中空纖維膜上，聚偏氟乙烯中空纖維膜另一端被封口 ； c.取樣品瓶，瓶口蓋上一層帶有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊，將步驟b的連接有聚偏氟乙烯中空纖維膜的通過聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊上的小孔固定于樣品瓶?jī)?nèi)； d.通過所述移液槍槍頭自由端向聚偏氟乙烯中空纖維膜內(nèi)腔中加入含有氘代分析物的萃取溶液，然后向所述樣品瓶?jī)?nèi)加入含有分析物的血漿樣品溶液，放到渦旋振蕩器上，轉(zhuǎn)速400-800rpm，萃取5_20分鐘，然后用微量注射器吸取聚偏氟乙烯中空纖維膜內(nèi)腔中的溶液作為樣品，注入氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行所述分析物和氘代分析物的定量分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:在所述帶有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊上蓋一層無孔聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔墊。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:步驟a中聚偏氟乙烯中空纖維膜的孔徑0.2 μ m，內(nèi)徑1.2mm，外徑1.4mm，且被剪成1.8cm的小段，甲醇超聲清洗2分鐘，自然晾干。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:步驟b中將移液槍槍頭剪去上半部分，留下2.8cm長(zhǎng)度的尖嘴部分，其尖端套在步驟a的聚偏氟乙烯中空纖維膜上，聚偏氟乙烯中空纖維膜另一端用鉗子夾緊封口。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:步驟d中潤(rùn)旋振蕩器的轉(zhuǎn)速為550rpm,萃取10分鐘。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103472144SQ201210184216
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月6日
【發(fā)明者】崔淑芬, 侯金星, 段貴嬌, 許柏球, 林素靜 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院