專利名稱：用于檢測氟喹諾酮類藥物殘留的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種能檢測氟喹諾酮類藥物殘留的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法(ELISA)與試劑盒。
背景技術(shù)：
氟喹諾酮類藥物是一族人工合成的抗菌藥，由于其抗菌譜廣，抗菌カ強而被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)。但是由于不合理用藥及濫用藥物，該類藥物的不良反應(yīng)及耐藥菌株的出現(xiàn)給人類健康帶來了潛在的危害，因此歐盟和我國農(nóng)業(yè)部分別對該類藥物規(guī)定了最大殘留限量(MRL)。建立殘留檢測方法是控制藥物殘留的重要手段，目前報道的氟喹諾酮類藥物的殘留檢測分析方法主要有理化方法、儀器分析法、微生物法及酶聯(lián)免疫法等。理化法缺乏專一性及敏感性，在殘留分析中應(yīng)用不多；微生物法的靈敏度不高，僅限于樣品的初篩(王瑩，2006 ;李巖松，2005 ;盧圣欣，2007);氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)很高的靈敏度和準確度，但需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的樣品前處理，不適用于大批量樣品的殘留分析；90年代發(fā)展起來的酶聯(lián)免疫分析法不但具有較高的靈敏度和特異性，而且經(jīng)濟、快速且操作簡單，比較適合于大量樣品的殘留檢測。目前關(guān)于檢測氟喹諾酮類藥物的酶聯(lián)免疫分析大部分是通過3位的羧基與蛋白偶聯(lián)制備免疫原免疫動物后獲得抗體，如Holtzapple等(1997)首次報道了以沙拉沙星(SAR)為半抗原獲得的單克隆抗體能識別5種氟喹諾酮類藥物(諾沙星、諾氟沙星、萘啶酸、曲伐沙星及ニ氟沙星);Duan等(2001)以環(huán)丙沙星為半抗原制備的多克隆抗體LOD為0. 32ppb，對諾氟沙星的交叉反應(yīng)率為44. 6% ;Watanabe等(2002)以恩諾沙星為半抗原與蛋白通過碳ニ亞胺法偶聯(lián)后制備的單抗能夠在MRL水平以下以親和色譜的形式識別恩諾沙星；魏東(2007)分別以環(huán)丙沙星、達氟沙星、諾氟沙星及沙拉沙星為半抗原合成免疫原制備抗血清，最終獲得了以沙拉沙星為免疫原的多克隆抗體，該抗體能夠識別6種氟喹諾酮類藥物沙拉沙星(100%)、諾氟沙星(91. 83%)、環(huán)丙沙星(85. 7%)、恩諾沙星(77. 09%)、達氟沙星(38. 37%)及培氟沙星(47. 94%)?？梢?，上述抗體識別的氟喹諾酮類藥物種類不多，難以滿足族特異性檢測的需求。近年來，Bucknall等(2003)制備了族特異性多克隆抗體，該抗體能夠識別9種該類藥物，其交叉反應(yīng)率分別為諾氟沙星(100%)、萘啶酸(15%)、恩諾沙星(6%)、氟甲喹(6%)、環(huán)丙沙星(9%)、氧氟沙星(17%)、惡喹酸(40%)、吡哌酸(18%)、依諾沙星(143%)。HuetA C等(2006)以SAR為免疫原，以諾氟沙星卵清蛋白偶聯(lián)物(N0R-0VA偶聯(lián)物)為包被原，獲得的抗體能識別12種氟喹諾酮類藥物SAR (100%)、諾氟沙星(105%)、ニ氟沙星(64%)、 環(huán)丙沙星(17%)、培氟沙星(30%)、氧氟沙星(55%)、達氟沙星(88%)、恩諾沙星(66%)、馬波沙星(45%)、洛美沙星(24%)、依諾沙星(27%)、萘啶酸(14%)。Wang等(2007)獲得了能夠識別12種氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體，分別是環(huán)丙沙星(100%)、恩諾沙星(82%)、諾氟沙星(71%)、氧氟沙星(54%)、達氟沙星(54%)、培氟沙星(49%)、氨氟沙星(51%)、洛美沙星(40%)、依諾沙星(45%)、氟甲喹(35%)、惡喹酸(40%)、馬波沙星(41%)。上述抗體及相應(yīng)的ELISA檢測方法在一定程度上能滿足氟喹諾酮類藥物殘留檢測的需要，但由于不能識別獸醫(yī)上常用的ニ氟沙星和沙拉沙星，且對個別藥物的交叉反應(yīng)率差異較大，導(dǎo)致檢測的準確度難以控制。因此制備ー種能夠識別包括ニ氟沙星和沙拉沙星的族特異性單克隆抗體，并建立相應(yīng)的ELISA檢測方法和試劑盒具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供ー種能識別氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體和檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在制備檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用以及酶聯(lián)免疫方法和試劑盒在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用。上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 ー種能識別氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC N0:C201149的雜交瘤細胞5B11所分泌的。所述的雜交瘤細胞5B11，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCN0:C201149o所述的單克隆抗體在制備檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。包含所述的單克隆抗體的試劑盒。所述的試劑盒，是檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。所述的試劑盒在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用。一種檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其步驟如下(I)將半抗原諾氟沙星與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原(NOR-BSA偶聯(lián)物);(2)將半抗原諾氟沙星與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原(NOR - OVA偶聯(lián)物)；(3)利用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號為CCTCC N0:C201149的雜交瘤細胞5B11 ；(4)利用保藏號為CCTCC N0:C201149的雜交瘤細胞5B11制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體(如酶標板)；(6)將待測樣品用こ腈在堿化條件下提取、氮氣吹干、正己烷去脂和含0. 05體積％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液重新溶解得到待測物；( 7 )對步驟(6 )的待測物進行酶聯(lián)免疫檢測。所述的酶聯(lián)免疫方法在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是(I)本發(fā)明制備的單克隆抗體能夠識別15種氟喹諾酮類藥物，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有單克隆抗體能識別這么多氟喹諾酮類藥物，特別是能夠同時識別獸醫(yī)上常用的ニ氟沙星和沙拉沙星，因此適用范圍廣；(2)本發(fā)明建立的檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒靈敏度、精密度高、準確性好；
(3)本發(fā)明涉及的樣品處理方法簡便，易操作，樣品處理所用的主要有機試劑為こ腈和正己烷，對操作者身體健康危害較小。


圖I為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2為本發(fā)明的單克隆抗體與達氟沙星標準品的間接競爭ELISA反應(yīng)曲線，X軸為達氟沙星(DNA)標準溶液濃度對數(shù)值，Y軸為達氟沙星標準品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。
具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進ー步說明，但不限制本發(fā)明。實施例I免疫原和包被原的制備免疫原(NOR-BSA偶聯(lián)物)的合成準確稱取諾氟沙星32. 4mg溶解于I. 5mLN，N- ニ甲基甲酰胺(DMF)中，溶液在4 °C的冰浴中冷卻25min后加入碳ニ亞胺(EDC)192. 42mg和N —羥基琥珀酰亞胺(NHS) 16. 05mg,然后4°C反應(yīng)過夜(A液)。準確稱取BSA57. 86mg溶解于15ml碳酸鹽緩沖液(CBS)中(B液)。然后將A液逐滴緩慢滴入B液中，于4°C反應(yīng)過夜后將反應(yīng)混合物移入處理過的透析袋內(nèi)，用0. Olmol磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7. 4)在4°C的條件下透析，期間不斷換液，以移走游離的諾氟沙星小分子物質(zhì)。將所得產(chǎn)物低壓凍干，干-20°C保存?zhèn)溆?。包被?NOR - OVA偶聯(lián)物)的合成稱取諾氟沙星16. 3mg溶解于2mL DMF中，充分溶解后，加入NHS 20mg, EDC 192mg，反應(yīng)在避光條件下進行24h (A液)。準確稱取OVA39. 75mg溶解于20mL PBS (pH7. 4)中(B液)。將A液逐滴滴入B液中，反應(yīng)在4°C條件下過夜最后將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋中，在PBS液(pH7. 4)中4°C透析，每天不斷更換透析液，直至透析完全為止。實施例2單克隆抗體的制備2.1小鼠免疫以實施例I制備的NOR - BSA偶聯(lián)物為免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基礎(chǔ)免疫及數(shù)次加強免疫。首次免疫時用與等體積的弗氏完全佐劑乳化的含100 u g免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的頸背部皮下進行基礎(chǔ)免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐劑乳化的含100 u g免疫原的蛋白乳液進行加強免疫。從免疫三次起，毎次免疫后第8天采尾血，分離血清，間接ELISA法檢測血清抗體效價。免疫合格的小鼠(效價高、靈敏度好)停止免疫以備融合。2. 2細胞融合與篩選在融合前3天(最好與上次免疫相隔3周以上)給免疫合格的小鼠腹腔注射含IOOiIg免疫原的蛋白溶液(不加佐劑)，強化免疫。融合前I天取未免疫的Balb/C鼠一只制備飼養(yǎng)細胞。根據(jù)骨髓瘤細胞的計數(shù)結(jié)果，取3 5X 107個骨髓瘤細胞與免疫脾細胞混合(比例為1:10 5:10)。1500r/min離心5min，將離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上，控干水滴。輕輕地敲擊管底，使管底細胞成糊狀，將其放置于37°C水浴中,將吸有0. 8mL預(yù)溫至37°C的50%聚こニ醇(PEG，購自Amersco)的ImL刻度吸管插入到管底，60sec內(nèi)緩緩加PEG到混合細胞上，邊加邊輕輕攪拌，加完后靜置90sec，將離心管插到離心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL預(yù)溫至37°C的RPMI - 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(購自Hyclone)沿管壁緩緩加到融合細胞上,邊加邊輕輕晃動離心管,第I分鐘逐滴加入lmL(3sec/滴)，第2分鐘再加2mL，最后加完剩下的7mL(5min內(nèi)加完)。加完第一個IOmL后，接著沿管壁補加RPMI - 1640培養(yǎng)基至50mL，加完后擰緊蓋，緩慢顛倒幾次，混勻。1500r/min離心5min，棄去上清，用含有飼養(yǎng)細胞的72mL HAT完全培養(yǎng)基輕輕將融合細胞攪拌重懸。將融合細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，2滴/孔。一次融合可接種5塊96孔細胞培養(yǎng)板，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從融合當天算起為0d，前面3d盡量不要動細胞板，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。第3d姆孔補加I滴HAT完全培養(yǎng)基(購自Amersco)并觀察集落生長情況；第5d姆孔吸出1/2培養(yǎng)上清(100 u L)，再加入I滴HT完全培養(yǎng)基(購自Amersco)；以后每隔3d同上法吸去1/2培養(yǎng)上清，換入HT完全培養(yǎng)基。根據(jù)細胞的生長情況，當細胞生長至占孔底面積1/4左右即可取細胞培養(yǎng)上清，以發(fā)明人制備的NOR - OVA偶聯(lián)物為包被原，利用ELISA方法篩選出 分泌抗氟喹諾酮抗體的陽性細胞孔。對篩選出來的陽性細胞孔利用有限稀釋法連續(xù)3次克隆化，最終建立一株穩(wěn)定分泌抗氟喹諾酮抗體的雜交瘤細胞株，對該雜交瘤細胞株進行染色體計數(shù)平均值為94. 4條，高于親本細胞的染色體數(shù)目(SP2/0骨髓瘤細胞的染色體平均數(shù)為58條，脾細胞染色體為40條)，說明融合細胞的確是SP2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的雜交產(chǎn)物。申請人將該雜交瘤細胞株命名為5B11，并于2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO C201149。2. 3腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射0. 5ml弗氏不完全佐劑進行預(yù)處理。用RPMI - 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮細胞并將細胞數(shù)調(diào)至I X IO6個/mL，每只小鼠腹腔接種0. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動時采集腹水，純化獲得單克隆抗體。以單克隆抗體亞型鑒定試紙條確定單克隆抗體為IgGl亞型。實施例3間接競爭ELISA檢測方法的建立3. I試劑配制碳酸鹽緩沖液(pH9. 6):準確稱取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超純水溶解，定容至lOOOmL。洗滌液(pH7.4):準確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g，Na2HPO4 12H20 2. 90g，KCl0. 20g，少量超純水溶解，加入Tween 20 0. 50mL，定容至lOOOmL。磷酸鹽緩沖液(pH7.4):準確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 12H202. 90g, KCl 0. 20g,少量超純水溶解，定容至1000mL。封閉液準確稱取卵清蛋白10. 00g，加入磷酸鹽緩沖液IOOOmL,攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。底物混合液準確吸取底物B液(購自武漢市飛遠科技有限公司)10mL，加入100 U L底物A液(購自武漢市飛遠科技有限公司)，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。 終止液準確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。3. 2方陣滴定法采用方陣滴定法初步選擇包被原濃度和抗體稀釋度。使用碳酸鹽緩沖液將N0R-0VA包被原倍比稀釋成32、16、8、4、2 ii g/mL,從第一至第五列依次縱向加入96孔酶標板，4°C過夜；洗滌3次，拍干，加入封閉液250yL，37°C封閉2h ;洗滌3次，拍干，單克隆抗體使用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成 1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200，從第一至第七行依次橫向加入96孔酶標板，37°C孵育30min ;洗滌3次，拍干，各孔加入用磷酸鹽緩沖液1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(簡稱ニ抗，以下所指ニ抗均為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體，購自武漢飛羿生物技術(shù)有限公司)100 u L，37°C孵育30min ;洗滌4次，拍干，各孔加入底物混合液100 u L，避光顯色15min ;カロ入終止液50ii L ;用自動酶標儀在450nm波長處測定光密度值(OD值)。方陣滴定結(jié)果見表I，初步選擇幾個OD值接近2. 0，且相鄰兩孔OD值有較大變化的包被濃度及對應(yīng)的抗體稀釋度組合。結(jié)果表明，可選擇以下包被原濃度和抗體稀釋度組合(8，6400)和(16，12800)表I 5B11單克隆抗體方陣滴定
權(quán)利要求
1.一種能識別氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號為CCTCCN0:C201149的雜交瘤細胞5B11所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細胞5B11，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:C201149。
3.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
4.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。
6.權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用。
7.—種檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其步驟如下 (1)將半抗原諾氟沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原； (2)將半抗原諾氟沙星與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號為CCTCCN0:C201149的雜交瘤細胞5B11 ； (4)利用保藏號為CCTCCN0:C201149的雜交瘤細胞5B11制備單克隆抗體； (5)用步驟(2)的包被原包被固相載體； (6)將待測樣品用乙腈在堿化條件下提取、氮氣吹干、正己烷去脂和含0.05體積％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液重新溶解得到待測物； (7)對步驟(6)的待測物進行酶聯(lián)免疫檢測。
8.權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫方法在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能識別氟喹諾酮類藥物的特異性單克隆抗體，所述單克隆抗體是由雜交瘤細胞5B11所分泌的，該雜交瘤細胞保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C201149。本發(fā)明還公開了檢測氟喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒及其在氟喹諾酮類藥物殘留檢測中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備得到的單克隆抗體能識別15種氟喹諾酮類藥物，特別是能夠同時識別二氟沙星和沙拉沙星，因此適用范圍廣。本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒靈敏度、精密度高、準確性好。
文檔編號G01N33/577GK102766212SQ20121017649
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉振利, 彭大鵬, 曹光彩, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)