專利名稱：用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒和用該試劑盒檢測靶物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒(kit)和使用其檢測靶物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
抗生物素蛋白和生物素，像在抗體和抗原之間的反應(yīng)的情況中一祥，經(jīng)由基于非共價結(jié)合的分子間相互作用而彼此非常穩(wěn)定地結(jié)合以形成復(fù)合物。最多四個生物素分子可連接到ー個抗生物素蛋白分子，并且抗生物素 蛋白和生物素之間的相互作用具有在目前已知的存在于天然體系的實(shí)體中最強(qiáng)的結(jié)合力。然而，當(dāng)熒光分子篩或酶接觸抗生物素蛋白時，與不意圖檢測的物質(zhì)或基質(zhì)的非特異性結(jié)合的水平高，且因此，信噪比變低。因此，難以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的傳感器。因而，不能以高再現(xiàn)性和高靈敏度檢測靶物質(zhì)。而且，在熒光分子篩的情況下，當(dāng)暴露于光時，尤其是紫外區(qū)的光時，熒光分子篩的熒光性質(zhì)降低，并且在酶的情況下，根據(jù)包括例如溫度或濕度的條件，其活性也可容易地降低。因此，使用熒光分子篩或酶的采用靶物質(zhì)信號放大方法的檢測試劑盒具有差的長期保存性質(zhì)，而且，在自診斷具有頻繁的急性發(fā)作的心血管疾病、在家庭中的循環(huán)系統(tǒng)疾病、和在現(xiàn)場作業(yè)中的醫(yī)療中有限制。而且，高量子點(diǎn)即使當(dāng)長時間暴露于高能量的光時也幾乎不被光漂白。因此，量子點(diǎn)可比熒光分子篩更穩(wěn)定地更長時間地發(fā)射熒光信號。而且，由于量子點(diǎn)的表面被改造以降低非特異性結(jié)合的水平，因此信噪比相對地提高。而且，通過將兩性離子化合物引入量子點(diǎn)的表面，可最小化量子點(diǎn)和不意圖檢測的物質(zhì)或基質(zhì)之間的非特異性結(jié)合，所述兩性離子化合物幫助表面電荷具有根據(jù)周圍條件幾乎不改變的這樣的電荷特性并且使其表面具有幾乎中性。通過利用這樣的特性，提出快速且容易地放大靶物質(zhì)檢測信號的方法。

發(fā)明內(nèi)容
提供用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒，其中該試劑盒包含包括第一分子和連接至該第一分子的探針的靶物質(zhì)結(jié)合部分；和包括納米顆粒的靶物質(zhì)檢測部分，所述納米顆粒各自具有第二分子和具有兩性離子的化合物連接到其的表面，其中所述第一分子特異性結(jié)合到所述第二分子而成對。提供通過使用該試劑盒檢測靶物質(zhì)的方法。


由結(jié)合附圖考慮的實(shí)施方式的以下描述，這些和/或其它方面將變得明晰和更容易理解，在所述附圖中圖I是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的靶物質(zhì)檢測部分的示意圖，其中兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素連接到量子點(diǎn)的表面；圖2是用于比較量子點(diǎn)的吸收率(吸光度)(A)和發(fā)射光譜(C)與兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素(鏈親和素，streptavidin)連接的量子點(diǎn)的吸收率(吸光度)(B)和發(fā)射光譜(D)的圖；圖3顯示關(guān)于兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素連接的的量子點(diǎn)(A)、生物素連接的量子點(diǎn)(B)、結(jié)合前的量子點(diǎn)(C)的通過動態(tài)光散射測量的流體動力學(xué)尺寸的結(jié)果，在所述兩性離子化合物和所述抗生物素蛋白鏈菌素連接的量子點(diǎn)之間的特異性結(jié)合由于其間的相互作用而發(fā)生。所述圖各自的數(shù)字是具有最高頻率的頂點(diǎn)的測量值；圖4是根據(jù)在量子點(diǎn)的表面處的非特異性結(jié)合力的肌紅蛋白檢測信號放大強(qiáng)度的圖；圖5是說明通過使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的靶物質(zhì)檢測部分和靶物質(zhì)結(jié)合部分檢測肌紅蛋白的方法的示意圖； 圖6A是根據(jù)反應(yīng)時間的關(guān)于兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素連接的量子點(diǎn)及生物素連接的量子點(diǎn)之間的特異性相互作用的熒光信號強(qiáng)度的圖，且圖6B是根據(jù)用生物素連接的量子點(diǎn)處理次數(shù)的肌紅蛋白檢測熒光信號強(qiáng)度的圖；圖7是由于兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)之間的特異性相互作用而放大的肌紅蛋白的檢測信號強(qiáng)度圖，其中由關(guān)于97. 5pg/mL l. 60 μ g/mL的多種肌紅蛋白濃度的檢測基質(zhì)的熒光顯微鏡圖片，以相對熒光強(qiáng)度(分別地，32次(倒三角形)和4次(三角形)放大的檢測信號)、和信噪比(分別地，32次(圓形)和4次(正方形)放大的檢測信號)量化結(jié)果。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將詳細(xì)介紹實(shí)施方式，其實(shí)例示于附圖中，其中相同的附圖標(biāo)記始終表示相同的元件。在這方面，本實(shí)施方式可具有不同的形式，并且不應(yīng)解釋為限于本文中闡述的描述。因而，以下僅通過參考附圖描述實(shí)施方式以解釋本說明書的各方面。本發(fā)明的一方面提供用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒，其中該試劑盒包含包括第一分子和連接至該第一分子的探針的靶物質(zhì)結(jié)合部分；和包括納米顆粒的靶物質(zhì)檢測部分，所述納米顆粒各自具有第二分子和具有兩性離子的化合物連接到其的表面，其中所述第一分子特異性結(jié)合到所述第二分子而成對。術(shù)語“靶物質(zhì)”指樣品中待檢測的物質(zhì)，并且該靶物質(zhì)可為例如生物聚合物，如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、或脂質(zhì)。該試劑盒包含靶物質(zhì)結(jié)合部分和靶物質(zhì)檢測部分。該試劑盒的靶物質(zhì)結(jié)合部分是直接結(jié)合到靶物質(zhì)的部分，并且該試劑盒的靶物質(zhì)檢測部分可經(jīng)由與該靶物質(zhì)結(jié)合部分的特異性結(jié)合檢測該靶物質(zhì)的存在。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，該靶物質(zhì)結(jié)合部分可包括第一分子和連接至該第一分子的探針。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，該第一分子可特異性結(jié)合到包含于該靶物質(zhì)檢測部分中的第二分子而成對。術(shù)語“特異性結(jié)合”指兩個或更多個分子之間經(jīng)由共價鍵或非共價鍵的相互作用，且特異性結(jié)合的實(shí)例是抗原和抗體之間經(jīng)由特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)。根據(jù)上述定義，第一分子和第二分子對可例如選自單鏈核酸分子和具有與其互補(bǔ)的序列的單鏈核酸分子對、雙鏈DNA和與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)對、以及抗原和抗體對。詳細(xì)地，所述對可選自抗生物素蛋白鏈菌素和生物素對、抗生物素蛋白和辣根過氧化物酶對、抗生物素蛋白鏈菌素和堿性磷酸酶對、以及抗生物素蛋白和生物素對，但不限于此。由于第一分子和第二分子之間的特異性結(jié)合，當(dāng)檢測到靶物質(zhì)時，該包括第一分子的靶物質(zhì)結(jié)合部分可位于該包括第二分子的靶物質(zhì)檢測部分附近。術(shù)語“探針”指在靶物質(zhì)的檢測期間直接特異性結(jié)合到靶物質(zhì)的分子。因而，根據(jù)靶物質(zhì)，所述探針可變化。例如，如果靶物質(zhì)為抗原蛋白質(zhì)，所述探針可為特異性結(jié)合到該抗原蛋白質(zhì)的抗體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述探針可為特異性結(jié)合到靶物質(zhì)的分子。所述探針可例如選自核酸、碳水化合物、抗體、和脂質(zhì)，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，靶物質(zhì)檢測部分可包括納米顆粒，所述納米顆粒各自具有所述第二分子和具有兩性離子的化合物連接到其的表面。術(shù)語“納米顆?！敝赣杉sf約IOOOnm的直徑的材料組成的顆粒，并且所述納米顆?？蔀榻饘偌{米顆?；蚍墙饘偌{米顆粒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述金屬納米顆?？蛇x 自金、銀、銅、鋁、鎳、鈀、钚、磁鐵、和其氧化物，但不限于此，并且所述非金屬納米顆?？蛇x自二氧化硅、聚苯乙烯、膠乳、和基于丙烯酸酯的材料，但不限于此。而且，納米顆?？蔀榘ㄟx自周期表中II VI族化合物半導(dǎo)體、III V族化合物半導(dǎo)體、和IV族化合物半導(dǎo)體的一種或多種量子點(diǎn)復(fù)合物。術(shù)語“兩性離子”指在相同分子中在不同位置包含正電荷和負(fù)電荷的分子，且因而，當(dāng)具有兩性離子的化合物在水溶液中離子化時，該化合物具有正電荷和負(fù)電荷。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，具有兩性離子的化合物連接到靶物質(zhì)檢測部分的表面以防止與靶物質(zhì)結(jié)合部分非特異性結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，具有兩性離子的化合物可例如選自氨基酸、N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、氨基磺酸、生物堿、賽洛西賓(二甲-4-羥色氨磷酸)(psilocybin)、醌型、和甜菜堿，但不限于此。而且，第二分子可特異性結(jié)合到包含于靶物質(zhì)結(jié)合部分中的第一分子而成對。所述第一分子和所述第二分子對已在以上描述，且由于第二分子和第一分子之間的特異性結(jié)合，在靶物質(zhì)的檢測期間，包含第一分子的靶物質(zhì)結(jié)合部分可位于包含第二分子的靶物質(zhì)檢測部分附近。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，第二分子可經(jīng)由結(jié)合到各納米顆粒的表面的接頭連接。接頭可為本領(lǐng)域中用作接頭的各種化合物的任一種，并可根據(jù)第二分子中存在的官能團(tuán)適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，接頭可選自包含羥基、硫醇基、或酚基的有機(jī)酸，和包含吡啶、甲基胺、咪唑、苯并咪唑、組氨酸、磷腈堿、或羥基的有機(jī)堿，但不限于此。所述接頭包含納米顆粒結(jié)合位點(diǎn)和納米顆粒非結(jié)合位點(diǎn)，其中所述納米顆粒結(jié)合位點(diǎn)選自包含羥基、硫醇基、或酚基的有機(jī)酸，和包含吡啶、甲基胺、咪唑、苯并咪唑、組氨酸、磷腈堿、或羥基的有機(jī)堿，并且所述納米顆粒非結(jié)合位點(diǎn)選自羧酸和疊氮基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，靶物質(zhì)檢測部分可進(jìn)一步包含連接到各納米顆粒的表面的可檢測標(biāo)記。術(shù)語“可檢測標(biāo)記”可為特異性檢測在沒有標(biāo)記的相同種類的分子中的包含標(biāo)記的分子的原子或分子?？蓹z測標(biāo)記可包括例如有色珠、抗原晶體、酶、可雜交核酸、著色材料、熒光材料、磷光材料、可電檢測的分子、或提供改變的熒光偏振或改變的光漫射的材料。而且，所述標(biāo)記可包含放射性同位素(如P32和S35)、化學(xué)發(fā)光的化合物、被標(biāo)記的結(jié)合蛋白質(zhì)、重金屬原子、和光譜標(biāo)志(如模(die))、或磁性標(biāo)記材料。本發(fā)明的另一方面提供檢測靶物質(zhì)的方法，該方法包括a)使該試劑盒的靶物質(zhì)結(jié)合部分與待檢測的靶物質(zhì)接觸山)使操作a)的結(jié)果(result)與該試劑盒的靶物質(zhì)檢測部分接觸；和c)檢測靶物質(zhì)?，F(xiàn)將詳細(xì)描述靶物質(zhì)檢測方法的各操作。首先，所述方法可包括使該試劑盒的靶物質(zhì)結(jié)合部分與待檢測的靶物質(zhì)接觸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，靶物質(zhì)可固定在固體載體上。例如，固體載體可選自載玻片、圓片(晶片，wafer)、珠、膜、和板，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，靶物質(zhì)可根據(jù)待檢測的靶物質(zhì)而不同，并且其非限制性實(shí)例為核酸如DNA、RNA、肽核酸(PNA)、或鎖核酸 (LNA)，蛋白質(zhì)，肽，碳水化合物，和其組合。接觸可在本發(fā)明的領(lǐng)域中廣泛已知的緩沖溶液中進(jìn)行。也就是說，接觸可在靶物質(zhì)中存在的分子與靶物質(zhì)結(jié)合部分以穩(wěn)定狀態(tài)相互作用的條件下進(jìn)行。而且，接觸可通過例如將包含靶物質(zhì)結(jié)合部分的緩沖溶液直接加到固定在固體載體上的靶物質(zhì)而進(jìn)行。通過所述接觸，結(jié)合到靶物質(zhì)結(jié)合部分的表面的探針可特異性結(jié)合到靶物質(zhì)，且因而，在第一分子暴露時靶物質(zhì)結(jié)合部分結(jié)合到靶物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述方法可進(jìn)一步包括，在操作a)之后，a-Ι)除去未結(jié)合的靶物質(zhì)結(jié)合部分。在a-Ι)的操作中，靶物質(zhì)結(jié)合部分可通過加入過量的本領(lǐng)域中廣泛已知的洗滌溶液例如蒸餾水、醇等而除去。然后，所述方法包括使操作a)的結(jié)果與試劑盒的靶物質(zhì)檢測部分接觸。如在操作a)中一樣，所述接觸可在本領(lǐng)域中廣泛已知的緩沖溶液中進(jìn)行。也就是說，接觸可在靶物質(zhì)中存在的分子、靶物質(zhì)結(jié)合部分、和靶物質(zhì)檢測部分以穩(wěn)定狀態(tài)相互作用的條件下進(jìn)行。而且，接觸可通過例如將包含靶物質(zhì)檢測部分的緩沖溶液直接加到操作a)的結(jié)果而進(jìn)行。作為操作a)的結(jié)果，靶物質(zhì)特異性結(jié)合到靶物質(zhì)結(jié)合部分的探針，并且連接到探針的第一分子暴露。因而，當(dāng)使靶物質(zhì)檢測部分與其接觸時，連接到靶物質(zhì)檢測部分的表面的第二分子特異性結(jié)合到該第一分子，并且在這種情況下，存在于靶物質(zhì)檢測部分的表面處的兩性離子化合物幫助表面電荷具有幾乎不根據(jù)周圍條件改變的這樣的電荷特性且具有幾乎中性，因此，可防止固體載體和靶物質(zhì)檢測部分之間的非特異性結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述方法進(jìn)一步包括，在操作b)之后，b-Ι)除去未結(jié)合的靶物質(zhì)檢測部分。在操作b-Ι)中，靶物質(zhì)檢測部分可通過加入過量的本領(lǐng)域中廣泛已知的洗滌溶液例如蒸餾水、醇等而除去。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述方法進(jìn)一步包括，在操作b-Ι)之后，b-2)使試劑盒的靶物質(zhì)檢測部分和操作b-Ι)的結(jié)果接觸。所述方法可進(jìn)一步包括重復(fù)包括操作b)、b-ι)、和b-2)的循環(huán)I 24次。該循環(huán)是指將在操作b)中已與操作a)的結(jié)果接觸的結(jié)果與靶物質(zhì)檢測部分重復(fù)接觸。根據(jù)分子，包含于靶物質(zhì)結(jié)合部分中的第一分子可特異性結(jié)合到多個第二分子。因而，如果包括第二分子的靶物質(zhì)檢測部分的接觸重復(fù)進(jìn)行直到可與第一分子連接的第二分子的數(shù)量飽和，則靶物質(zhì)檢測部分可特異性結(jié)合到靶物質(zhì)結(jié)合部分。如果多個靶物質(zhì)結(jié)合部分和靶物質(zhì)檢測部分由于特異性結(jié)合而彼此相鄰存在，則通過靶物質(zhì)檢測部分可檢測的信號可被放大。最后，所述方法包括c)檢測靶物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，在操作c)中，可檢測選自磁信號、電信號、發(fā)射信號、散射信號、和放射性信號的信號。所述信號可例如選自由可檢測標(biāo)記產(chǎn)生的磁信號、電信號、發(fā)射信號(如熒光或拉曼信號)、散射信號、和放射性信號。檢測信號的詳細(xì)實(shí)例與關(guān)于可檢測標(biāo)記給出的相同?，F(xiàn)將參考以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述一個或多個實(shí)施方式。這些實(shí)施例僅用于說明的目的并且不意圖限制所述一個或多個實(shí)施方式的范圍。實(shí)施例I :合成其非特異性結(jié)合最小化的靶物質(zhì)檢測部分將納米顆粒分散在氯仿中,所述納米顆粒各自具有CdSe/CdZnS的芯/殼結(jié)構(gòu),通 過使用其中鎘(Cd)、硒(Se)、鋅(Zn)、和硫⑶前體快速加入高溫且氮?dú)?N2)飽和的包括十八碳烯和油胺的溶劑中的高溫?zé)岱纸夤に嚭铣?。所述納米顆粒用作量子點(diǎn)。而且，將其中預(yù)先合成的下式I表示的兩性離子化合物和下式II表示的包含羧基的化合物已過量溶解于其中的水溶液與包含純化量子點(diǎn)的氯仿溶液混合，并將混合物在室溫下攪拌。式I
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H H在這方面，存在于各量子點(diǎn)表面的有機(jī)分子配體如三辛基膦、三辛基膦氧化物、油胺、油酸等同時被所述兩性離子化合物和所述包含羧基的化合物取代，使得量子點(diǎn)移動到水溶液層并分散于其中。然后，分離氯仿層，且僅將水溶液層透析以除去殘余配體。然后，以用于幫助共價鍵的基于碳二亞胺的結(jié)合試劑處理被羧酸和兩性離子化合物同時表面取代的量子點(diǎn)，并將125 μ L的抗生物素蛋白鏈菌素溶液以2. 5mg/mL抗生物素蛋白鏈菌素溶液對應(yīng)于Inmol量子點(diǎn)的方式加入其中，從而將抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合到羧基。由此，得到具有兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素連接到其的表面的量子點(diǎn)(構(gòu)成靶物質(zhì)檢測部分)。圖I是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的靶物質(zhì)檢測部分的示意圖。參考圖1，靶物質(zhì)檢測部分包括量子點(diǎn)100，其具有兩性離子化合物110和作為第二分子實(shí)例的抗生物素蛋白鏈菌素120經(jīng)由有機(jī)分子配體130連接到其的表面。此外，如圖2中所示，證實(shí)雖然兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素連接到靶物質(zhì)檢測部分，但是構(gòu)成靶物質(zhì)檢測部分的量子點(diǎn)的吸收和發(fā)射特性與兩性離子化合物和抗生物素蛋白鏈菌素未連接到其的對照組相比良好地保持。實(shí)施例2 :證實(shí)由于靶物質(zhì)檢測部分的抗生物素蛋白鏈菌素和生物素之間的特異性結(jié)合引起的自組裝在以用于幫助共價鍵的基于碳二亞胺的結(jié)合試劑處理被羧基和兩性離子化合物同時表面取代的量子點(diǎn)后，將伯胺連接到其的生物素加到其中，從而制備生物素連接的量子點(diǎn)。在這方面，將36 μ L生物素溶液以lmg/mL生物素溶液對應(yīng)于Inmol量子點(diǎn)的方式使用。然后，將生物素連接的量子點(diǎn)與根據(jù)實(shí)施例I制備的靶物質(zhì)檢測部分混合，然后靜置30分鐘，且然后通過動態(tài)光散射測量其流體動力學(xué)尺寸。其結(jié)果示于圖3中。與實(shí)施例I中不同的僅被兩性離子化合物和包含羧基的化合物表面取代而沒有加入 抗生物素蛋白鏈菌素的量子點(diǎn)的流體動力學(xué)尺寸(圖3的A)比靶物質(zhì)檢測部分或生物素連接到其的量子點(diǎn)的尺寸(圖3的B或C)小約f約1.5nm。該結(jié)果可由于如下事實(shí)具有由于抗生物素蛋白鏈菌素和生物素在量子點(diǎn)的表面處彼此特異性結(jié)合而提高的顆粒尺寸的組合物(組分)比在當(dāng)沒有引入抗生物素蛋白鏈菌素的情況中移動得慢。而且，其中靶物質(zhì)檢測部分與生物素連接的量子點(diǎn)混合的樣品的流體動力學(xué)尺寸(圖3的D)為約lOOOnm。該結(jié)果可由于如下事實(shí)當(dāng)多個靶物質(zhì)檢測部分與多個生物素連接的量子點(diǎn)接觸時，它們連續(xù)為彼此提供特異性結(jié)合位點(diǎn)，從而使復(fù)合物聚集。實(shí)施例3 :證實(shí)通過抗生物素蛋白鏈菌素和生物素之間的相互作用的生物素連接的量子點(diǎn)的熒光信號的放大在生物素連接的量子點(diǎn)的量逐漸增加的同時，使根據(jù)實(shí)施例I制備的靶物質(zhì)檢測部分與生物素連接的量子點(diǎn)接觸。結(jié)果，靶物質(zhì)檢測部分中存在的抗生物素蛋白鏈菌素和生物素連接的量子點(diǎn)之間的特異性結(jié)合活躍地進(jìn)行。由于4個生物素可連接到一個抗生物素蛋白鏈菌素，因此生物素連接的量子點(diǎn)的量越大，則量子點(diǎn)具有的熒光信號的強(qiáng)度越大。如圖4的A中所示，如果非特異性結(jié)合沒有最小化，即量子點(diǎn)沒有被兩性離子化合物表面處理，當(dāng)生物素連接的量子點(diǎn)的量增加時，非特異性結(jié)合顯著增加，且因此，噪聲信號也增加(圖4的B)。然而，在被兩性離子化合物表面處理的量子點(diǎn)的情況下，即使當(dāng)生物素連接的量子點(diǎn)被處理時，噪聲信號也相對地非常低，并且生物素連接的量子點(diǎn)的量越大，則熒光信號的強(qiáng)度越大。因此，當(dāng)生物素連接的量子點(diǎn)的量達(dá)到一定水平時，熒光信號的強(qiáng)度具有最大值(圖4的A)。實(shí)施例4 :證實(shí)關(guān)于由于抗生物素蛋白鏈菌素和生物素之間的特異性結(jié)合引起的靶物質(zhì)檢測部分和靶物質(zhì)結(jié)合部分的自組裝的反應(yīng)速度，和靶物質(zhì)檢測信號放大測試如實(shí)施例3中所述，證實(shí)通過將兩性離子化合物連接到納米顆粒的表面以降低非特異性結(jié)合而有效地增強(qiáng)熒光信號。該結(jié)果通過檢測作為靶物質(zhì)的肌紅蛋白而實(shí)際地證實(shí)。圖5是說明通過使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的靶物質(zhì)檢測部分和靶物質(zhì)結(jié)合部分檢測肌紅蛋白的方法的示意圖。將肌紅蛋白抗體150固定在基質(zhì)140上，并使肌紅蛋白160與該基質(zhì)上的肌紅蛋白抗體150接觸，然后在其上處理生物素連接的肌紅蛋白抗體靶物質(zhì)結(jié)合部分200，從而使生物素暴露于基質(zhì)140的表面。然后，在其上重復(fù)處理具有抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接到其的表面的納米顆粒靶物質(zhì)檢測部分300以及具有生物素和兩性離子化合物連接到其的表面的納米顆粒靶物質(zhì)檢測部分310。結(jié)果，如圖5中所示，根據(jù)靶物質(zhì)檢測部分的處理次數(shù)，多個靶物質(zhì)檢測部分以枝狀形式接到一個靶物質(zhì)結(jié)合部分。因而，突光信號由量子點(diǎn)放大。在這種情況下，證實(shí)抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)如何快速地彼此特異性結(jié)合。如圖5中所示，在生物素在基質(zhì)140上暴露的同時，不同地控制在抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)之間的接觸時間，以獲得圖6A的結(jié)果。參考圖6A，在用抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)和生物素連接的量子點(diǎn)處理后小于3分鐘時，熒光信號顯著增力口。處理后4分鐘，熒光信號的強(qiáng)度會聚到其最大值。由該結(jié)果，證實(shí)在抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)之間的結(jié)合非常快速地發(fā)生，并且在一定時間后，可獲得非常穩(wěn)定的狀態(tài)。而且，對于多種肌紅蛋白濃度，評價當(dāng)重復(fù)處理抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)時的最大信號放大的次數(shù)。如圖6B中所示，在32次處理期間測量熒光檢測信號，且在這方面，抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)的處理時間各自為4分鐘。結(jié)果，處理次數(shù)越多，熒光信號具有的強(qiáng)度越大。因此，熒光信號總體提高，但在第24次處理后，即24次的信號放大后， 熒光信號會聚至其最大值。實(shí)施例5 :根據(jù)用靶物質(zhì)檢測部分和靶物質(zhì)結(jié)合部分的重復(fù)處理的高靈敏度的靶物質(zhì)檢測方法基于由實(shí)施例2 4獲得的結(jié)果，證實(shí)抗生物素蛋白鏈菌素和兩性離子化合物連接的量子點(diǎn)與生物素連接的量子點(diǎn)對用于靶物質(zhì)(例如，肌紅蛋白)的檢測信號的放大。這體現(xiàn)為與常規(guī)已知的信號放大方法相比具有非常高的靈敏度的檢測方法。參考圖7，基于其熒光信號放大的基質(zhì)的熒光顯微鏡照片，證實(shí)肌紅蛋白濃度越高，相對熒光強(qiáng)度和信噪比越大。由該結(jié)果，主要地，證實(shí)肌紅蛋白濃度越高，熒光信號的強(qiáng)度越大。然而，當(dāng)肌紅蛋白的濃度達(dá)到lOOOng/mL或更高時，涂覆有抗體的基質(zhì)達(dá)到其自身檢測極限，且因此，熒光信號會聚到最大值。而且，關(guān)于其中信噪比為3或更高的樣品濃度，該體系的檢測極限為約390pg/mL。該檢測極限比典型的基于酶的肌紅蛋白檢測方法低約13倍。而且，考慮到典型地基于酶的肌紅蛋白檢測方法需要約180分鐘的檢測時間，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的靶物質(zhì)檢測方法可用于以高靈敏度檢測肌紅蛋白，同時其檢測時間為約120分鐘或更小，遠(yuǎn)短于180分鐘。而且，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的靶物質(zhì)檢測方法用于檢測靶物質(zhì)，而不使用酶。如上所述，通過使用根據(jù)本發(fā)明的以上實(shí)施方式的一個或多個的用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒和使用該試劑盒檢測靶物質(zhì)的方法有效地檢測靶物質(zhì)。應(yīng)理解，本文中描述的示例性實(shí)施方式應(yīng)僅在描述的意義上考慮并且不是為了限制的目的。各實(shí)施方式中的特征或方面的描述應(yīng)典型地被認(rèn)為可用于其它實(shí)施方式中的其它類似特征或方面。
權(quán)利要求
1.用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒，該試劑盒包含 包括第一分子和連接至該第一分子的探針的靶物質(zhì)結(jié)合部分；和 包括納米顆粒的靶物質(zhì)檢測部分，所述納米顆粒各自具有第二分子和具有兩性離子的化合物連接到其的表面， 其中所述第一分子特異性結(jié)合到所述第二分子而成對。
2.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述具有兩性離子的化合物選自氨基酸、N-ニ(羥こ基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、氨基磺酸、生物堿、賽洛西賓、醌型、和甜菜堿。
3.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述第二分子經(jīng)由結(jié)合到各納米顆粒表面的接頭連接到各納米顆粒的表面。
4.權(quán)利要求3的試劑盒，其中所述接頭包含納米顆粒結(jié)合位點(diǎn)和納米顆粒非結(jié)合位點(diǎn)，其中所述納米顆粒結(jié)合位點(diǎn)選自包含羥基、硫醇基、或酚基的有機(jī)酸，和包含吡啶、甲基胺、咪唑、苯并咪唑、組氨酸、磷腈堿、或羥基的有機(jī)堿，并且所述納米顆粒非結(jié)合位點(diǎn)選自竣酸和置氣基。
5.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述納米顆粒各自包含量子點(diǎn)，所述量子點(diǎn)包括選自周期表中II VI族化合物半導(dǎo)體、III V族化合物半導(dǎo)體、和IV族化合物半導(dǎo)體中的一種或多種、或金、銀、或鐵氧化物。
6.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述第一分子和所述第二分子對選自單鏈核酸分子和具有與其互補(bǔ)的序列的單鏈核苷分子對、雙鏈DNA和與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)對、以及抗原和抗體對。
7.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述第一分子和所述第二分子對包含抗生物素蛋白鏈菌素和生物素對、或抗生物素蛋白和生物素對。
8.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述探針特異性結(jié)合到所述靶物質(zhì)。
9.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述探針選自核酸、碳水化合物、抗體、和脂質(zhì)。
10.權(quán)利要求I的試劑盒，其中所述祀物質(zhì)檢測部分進(jìn)ー步包含連接到各納米顆粒的表面的可檢測標(biāo)記。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述可檢測標(biāo)記選自有色珠、著色材料、熒光材料、磷光材料、電可檢測的分子、和提供改變的熒光偏振或改變的光漫射的材料。
12.檢測靶物質(zhì)的方法，所述方法包括 a)使權(quán)利要求I的試劑盒的靶物質(zhì)結(jié)合部分與待檢測的靶物質(zhì)接觸； b)使操作a)的結(jié)果與權(quán)利要求I的試劑盒的靶物質(zhì)檢測部分接觸；和 c)檢測所述靶物質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述靶物質(zhì)固定在固體載體上。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述固體載體選自載玻片、圓片、珠、膜、和板。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述靶物質(zhì)選自DNA、RNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、和其組合。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法進(jìn)ー步包括，在操作a)之后，a-1)除去未結(jié)合的靶物質(zhì)結(jié)合部分。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法進(jìn)ー步包括，在操作b)之后，b-1)除去未結(jié)合的靶物質(zhì)檢測部分。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法進(jìn)ー步包括，在操作b-1)之后，b-2)使權(quán)利要求I的試劑盒的靶物質(zhì)檢測部分與操作b-1)的結(jié)果接觸。
19.權(quán)利要求12的方法，其中在操作c)中，檢測選自磁信號、電信號、發(fā)射信號、散射信號、和放射性信號的信號。
全文摘要
提供用于檢測靶物質(zhì)的試劑盒和通過使用該試劑盒檢測靶物質(zhì)的方法。通過使用該試劑盒和該檢測方法有效地檢測靶物質(zhì)。該試劑盒包含包括第一分子和連接至該第一分子的探針的靶物質(zhì)結(jié)合部分；和包括納米顆粒的靶物質(zhì)檢測部分，所述納米顆粒各自具有第二分子和具有兩性離子的化合物連接到其的表面，其中所述第一分子特異性結(jié)合到所述第二分子而成對。
文檔編號G01N33/53GK102788876SQ20121015329
公開日2012年11月21日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者樸埈赫, 樸鐘辰, 樸魯璟, 林圭鉉, 許在賢, 金圣智 申請人:三星電子株式會社, 浦項(xiàng)工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)