專利名稱：檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)試劑盒，特別是一種采用免疫透射比濁法和免疫散射比濁法檢測(cè)人血清中和關(guān)節(jié)腔液中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒及其方法。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體Clq是補(bǔ)體系統(tǒng)Cl的第一組成成份，是一個(gè)巨分子量糖蛋白，一個(gè)Clq分子由18個(gè)多肽鏈成，化學(xué)組成為膠原性蛋白分子量410KD?，F(xiàn)有技術(shù)中采用免疫擴(kuò)散法和ELISA雙抗體夾心技術(shù)測(cè)定補(bǔ)體Clq濃度，但是其步驟復(fù)雜，準(zhǔn)確性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒及其方法，所述的這種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒及其方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中采用免疫擴(kuò)散法和ELISA雙抗體夾心技術(shù)測(cè)定補(bǔ)體Clq濃度過程復(fù)雜，準(zhǔn)確性不高的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒，包括兩種試劑，I試劑由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、PEG6000、EDTA-NA2和TX-100組成，在所述的I試劑中，所述的磷酸氫二鈉的質(zhì)量濃度為28. 6g/L，所述的磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為2. 7g/L，所述的PEG6000的質(zhì)量濃度為50g/L，所述的EDTA-NA2的質(zhì)量濃度為lg/L，所述的TX-100的體積濃度為0. 2ml/L，II試劑由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、PEG6000、EDTA-NA2, TX-100和補(bǔ)體Clq抗血清或者補(bǔ)體Clq單克隆抗體組成，在所述的II試劑中，所述的磷酸氫二鈉的質(zhì)量濃度為28. 6g/L，所述的磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為2. 7g/L，所述的PEG6000的質(zhì)量濃度為50g/L，所述的EDTA-NA2的質(zhì)量濃度為lg/L，所述的TX-100的體積濃度為0. 2ml/L，所述的補(bǔ)體Clq抗血清或者補(bǔ)體Clq單克隆抗體的體積濃度為300ml/L。進(jìn)一步的，所述的補(bǔ)體Clq抗血清為羊抗人補(bǔ)體Clq抗血清、或鼠抗人補(bǔ)體Clq抗血清，所述的補(bǔ)體Clq單克隆抗體為鼠抗人補(bǔ)體Clq單克隆抗體。進(jìn)一步的，所述的TX-100的純度為100%。進(jìn)一步的，所述的兔抗人補(bǔ)體Clq抗血清的效價(jià)為I : 64。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的方法，采用上述的試劑盒，包括一個(gè)將樣本采用生化分析儀測(cè)定的步驟，在所述的一個(gè)將樣本采用生化分析儀測(cè)定的步驟中，將樣品加入I試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測(cè)第I點(diǎn)樣本Al，加入II試劑R2，37°C 孵育5min，讀測(cè)第2點(diǎn)樣本A2，樣本A =樣本A2-樣本Al ;還包括一個(gè)將校準(zhǔn)品采用生化分析儀測(cè)定的步驟，在所述的一個(gè)將校準(zhǔn)采用生化分析儀測(cè)定的步驟中，將校準(zhǔn)加入I試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測(cè)第I點(diǎn)校準(zhǔn)Al，加入II試劑R2，37°C孵育5min，讀測(cè)第2點(diǎn)校準(zhǔn)A2，校準(zhǔn)A =校準(zhǔn)A2-校準(zhǔn)Al ；樣本A2-樣本Al
補(bǔ)體Clq濃度(mg/L) =_X校準(zhǔn)品濃度(mg/L)
校準(zhǔn)A2-校準(zhǔn)Al上述測(cè)定的參數(shù)為溫度37°C，主波長(zhǎng)340nm、546nm、600nm，副波長(zhǎng)700nm，樣本或校準(zhǔn)品3-4 u I, R1 :240 iil，R2 :60 yl，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。本發(fā)明的羊抗人補(bǔ)體Clq抗血清、鼠抗人補(bǔ)體Clq抗血清、鼠抗人補(bǔ)體Clq單克隆抗體可以在市場(chǎng)購(gòu)買，也可以通過常規(guī)的免疫方法制備。本發(fā)明的試劑盒和方法是采用免疫透射比濁法和免疫散射比濁法的測(cè)定原理，SP利用補(bǔ)體Clq抗原和兔抗人補(bǔ)體Clq抗血清、羊抗人補(bǔ)體Clq抗血清、鼠抗人補(bǔ)體Clq抗血清、鼠抗人補(bǔ)體Clq單克隆抗體相結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生渾濁，其濁度高低，即透光度減少、吸光度增加反映人血清樣本中補(bǔ)體Clq的濃度，補(bǔ)體Clq的濃度可由校準(zhǔn)品所作的劑量反應(yīng)曲線算出。采用本發(fā)明的試劑盒和方法測(cè)得的Clq的濃度可以作為科研和教學(xué)使用。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明的試劑盒和方法用于測(cè)定補(bǔ)體Clq濃度的過程簡(jiǎn)單方便，準(zhǔn)確性高。


圖I是由校準(zhǔn)品所作的補(bǔ)體Clq濃度和吸光度的劑量反應(yīng)曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I免疫透射比濁法當(dāng)一束入射光照射液相中的IC時(shí)，一部分光被IC粒子吸收，一部分光透過，還有一部分光被IC粒子散射。利用比濁儀在光源的光路方向上測(cè)量透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值或吸光值，來判斷待測(cè)抗原的量，此法稱為透射比濁法。I. I適用儀器半自動(dòng)、全自動(dòng)生化分析儀。I. 2分析方法免疫透射比濁法。I. 3性能要求I. 3. I試劑外觀Rl :無色澄清透明液體；R2 :淡黃色澄清液體。
、
1.3.2試劑空白吸光度(A)吸光度(A): + ( 0. 04A(在溫度 37 °C ;主波長(zhǎng) 340nm(副波長(zhǎng) 700nm))。I. 3. 3 精密度I. 3. 3. I批內(nèi)精密度CVS 10%。I. 3. 4批間精密度
相對(duì)極差≤10%。1. 3. 5 準(zhǔn)確度不準(zhǔn)確度±10%的范圍以內(nèi)。1.3.6分析靈敏度吸光度⑷> 0. 04A。1. 3. 7 線性在50mg/L_400mg/L 范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(Y)≥0. "00。1. 3. 8 穩(wěn)定性試劑在2°C -8°C避光貯存至有效期末前后兩個(gè)月，進(jìn)行檢測(cè)，其質(zhì)量符合上項(xiàng)的規(guī)定。2. I檢測(cè)條件2. I. I生化分析儀(以下簡(jiǎn)稱儀器)日立7060自動(dòng)生化分析儀。2. I. 2工作環(huán)境溫度室溫15-32 °C。室內(nèi)濕度45-85% RH。2. I. 3主要測(cè)定參數(shù)及操作步驟溫度370C ;主波長(zhǎng)340nm(副波長(zhǎng)700nm)，樣本或校準(zhǔn)品3-4 u I :240 u I ；R2 60iU，反應(yīng)時(shí)間10分鐘。方法類型二點(diǎn)終點(diǎn)法。樣本或校準(zhǔn)品加試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測(cè)第I點(diǎn)(Al)，加入試劑R2，37°C孵育5min，讀測(cè)第2點(diǎn)(A2)，樣本A = A2-A1。結(jié)果計(jì)算
樣本A2-樣本Al
補(bǔ)體Clq濃度(mg/L) =_X校準(zhǔn)品濃度(mg/L)
校準(zhǔn)A2-校準(zhǔn)Al2. I. 4 校準(zhǔn)品本標(biāo)準(zhǔn)中所用校準(zhǔn)品為浙江省玉環(huán)縣南方試劑廠生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品。2. 2試劑外觀光下目測(cè)試劑盒，Rl :無色澄清透明液體；R2 :淡黃色澄清液體。2. 3試劑空白吸光度值取^240 u 1，加蒸懼水 I,置 37°C孵育 5min 后,加入 R260 u l,g 37°C孵育 5min后，在7060自動(dòng)生化分析儀上，用340nm波長(zhǎng)，測(cè)定其吸光度值應(yīng)符合實(shí)施例I中I. 3. 2項(xiàng)的規(guī)定。2. 4精密度2. 4. I批內(nèi)精密度試驗(yàn)方法在儀器正常工作條件下，用同一批試劑，連續(xù)測(cè)試(約200mg/L)樣本20次，計(jì)算其測(cè)量值的平均值(X )和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，再按以下公式計(jì)算變異系數(shù)(CV%)的值，其結(jié)果應(yīng)符合實(shí)施例I中I. 3. 3. I項(xiàng)的規(guī)定。n SD = { E (Xi-X)2/(N-I)}1/2I = ICV= SD/XX100%式中SD-標(biāo)準(zhǔn)偏差；CV-變異系數(shù)；X -n次測(cè)定值的均值；Xi-第i次的測(cè)定值；n_測(cè)量次數(shù)。2. 4. 2批間精密度試驗(yàn)方法在儀器正常工作條件下，取三個(gè)批號(hào)試劑，每個(gè)批號(hào)取一套。分別測(cè)定(約200mg/L)樣本各3次。然后計(jì)算每批測(cè)定結(jié)果的均值h、x2, UP三批試劑測(cè)定結(jié)果的總均值(Xt )。按照下列公式求出三個(gè)批號(hào)試劑的測(cè)定均值的相對(duì)極差(％)，其結(jié)果應(yīng)符合實(shí)施例I中I. 3. 4項(xiàng)的規(guī)定。
相對(duì)極差(%) = (Xmax-Xmin) /Xt X 100%式中J(Inax)Sx^ X2> x3中最大值，又(min)為x X2> X3中最小值。2. 5準(zhǔn)確度在儀器正常工作條件下，試劑用浙江玉環(huán)南方試劑廠生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)定標(biāo)后，測(cè)定已知濃度的樣本，重復(fù)測(cè)定10次，其測(cè)量結(jié)果的均值的相對(duì)偏差應(yīng)符合實(shí)施例I中I. 3. 5項(xiàng)的規(guī)定。RE %=絕對(duì)偏差/TVX 100%絕對(duì)偏差=檢測(cè)結(jié)果均值-標(biāo)準(zhǔn)品靶值式中TV-測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的靶值2. 6分析靈敏度R1 試劑 240iil，加入 50mg/L 樣本 4iil，置 37°C 孵育 5min 后，加入 R260 iil，置 37°C孵育5min后，在7060自動(dòng)生化分析儀上，用340nm主波長(zhǎng)(副波長(zhǎng)700nm)，測(cè)吸光度，其結(jié)果應(yīng)符合實(shí)施例I中I. 3. 6項(xiàng)的規(guī)定。2. 7線性試驗(yàn)樣本或校準(zhǔn)品選用按實(shí)施例3配制的1#、2#、3#、4#、和5#各測(cè)試濃度樣本或校準(zhǔn)品。測(cè)定步驟在儀器正常工作條件下，經(jīng)定標(biāo)后，用試劑測(cè)定以上五個(gè)濃度樣本或校準(zhǔn)品，每一濃度樣本或校準(zhǔn)品分別測(cè)定3次，取均值為實(shí)測(cè)值Yi。計(jì)算按以下公式計(jì)算相關(guān)系數(shù)Y，其結(jié)果應(yīng)符合實(shí)施例I中I. 3. 7項(xiàng)的規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒，包括兩種試劑，其特征在于I試劑由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、PEG6000、EDTA-NA2和TX-IOO組成，在所述的I試劑中，所述的磷酸氫二鈉的質(zhì)量濃度為28. 6g/L，所述的磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為2. 7g/L，所述的PEG6000的質(zhì)量濃度為50g/L，所述的EDTA-NA2的質(zhì)量濃度為lg/L，所述的TX-100的體積濃度為0.2ml/L，II試劑由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、PEG6000、EDTA-NA2、TX-100和補(bǔ)體Clq抗血清或者補(bǔ)體Clq單克隆抗體組成，在所述的II試劑中，所述的磷酸氫二鈉的質(zhì)量濃度為28. 6g/L，所述的磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為2. 7g/L，所述的PEG6000的質(zhì)量濃度為50g/L，所述的EDTA-NA2的質(zhì)量濃度為lg/L，所述的TX-100的體積濃度為0. 2ml/L，所述的補(bǔ)體Clq抗血清或者補(bǔ)體Clq單克隆抗體的體積濃度為300ml/L。
2.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒，其特征在于所述的補(bǔ)體Clq抗血清為羊抗人補(bǔ)體Clq抗血清、或鼠抗人補(bǔ)體Clq抗血清，所述的補(bǔ)體Clq單克隆抗體為鼠抗人補(bǔ)體Clq單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒，其特征在于所述的TX-100的純度為100%。
4.如權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒，其特征在于所述的兔抗人補(bǔ)體Clq抗血清的效價(jià)為1:64。
5.一種檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的方法，其特征在于采用權(quán)利要求I所述的試劑盒，包括一個(gè)將樣本采用生化分析儀測(cè)定的步驟，在所述的一個(gè)將樣本采用生化分析儀測(cè)定的步驟中，將樣品加入I試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測(cè)第I點(diǎn)樣本Al，加入II試劑R2，37°C孵育5min，讀測(cè)第2點(diǎn)樣本A2，樣本A=樣本A2-樣本Al ;還包括一個(gè)將校準(zhǔn)品采用生化分析儀測(cè)定的步驟，在所述的一個(gè)將校準(zhǔn)采用生化分析儀測(cè)定的步驟中，將校準(zhǔn)加入I試劑Rl后，37°C孵育5min，讀測(cè)第I點(diǎn)校準(zhǔn)Al，加入II試劑R2，37°C孵育5min，讀測(cè)第2點(diǎn)校準(zhǔn)A2，校準(zhǔn)A=校準(zhǔn)A2-校準(zhǔn)Al ； 樣本A2-樣本Al 補(bǔ)體Clq濃度(mg/L)=_X校準(zhǔn)品濃度(mg/L) 校準(zhǔn)A2-校準(zhǔn)Al 上述測(cè)定的參數(shù)為溫度37°C，主波長(zhǎng)340nm、546nm、600nm，副波長(zhǎng)700nm，樣本或校準(zhǔn)品3-4 u !,R1 240u !,R2 :60 yl，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，提供了一種檢測(cè)血清中補(bǔ)體Clq濃度的試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用免疫擴(kuò)散法和ELISA雙抗體夾心技術(shù)測(cè)定補(bǔ)體C1q濃度步驟復(fù)雜，準(zhǔn)確性不高、重復(fù)性差的技術(shù)問題。包括兩種試劑，Ⅰ試劑由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、PEG6000、EDTA-NA2和TX-100組成，Ⅱ試劑由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、PEG6000、EDTA-NA2、TX-100、補(bǔ)體C1q抗血清或補(bǔ)體C1q單克隆抗體組成。本發(fā)明還提供了采用上述的試劑盒檢測(cè)人血清中補(bǔ)體Clq濃度的方法，本發(fā)明的試劑盒和方法用于測(cè)定補(bǔ)體C1q濃度的步驟簡(jiǎn)單方便，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，用于自動(dòng)化分析儀。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102636654SQ201210133619
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者劉穎冰, 劉穎成, 張瑞鎬, 朱慧琳, 王泉龍 申請(qǐng)人:上海北加生化試劑有限公司