專(zhuān)利名稱(chēng)：一種淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種淡水魚(yú)精子掃描電鏡樣品制備方法。
背景技術(shù)：
在魚(yú)類(lèi)的人工繁育過(guò)程中，人們主要關(guān)注卵子的質(zhì)量，對(duì)精子質(zhì)量沒(méi)引起足夠的重視。然而魚(yú)類(lèi)個(gè)體之間精子質(zhì)量差異較大，如個(gè)體大小、養(yǎng)殖溫度和模式、營(yíng)養(yǎng)狀況和催產(chǎn)藥物使用情況等會(huì)影響到精子的質(zhì)量，魚(yú)類(lèi)精子活力和質(zhì)量是人工繁殖的基本保證，關(guān)系到苗種生產(chǎn)的成敗，因此研究精子的超微結(jié)構(gòu)對(duì)于獲得高質(zhì)量雄性配子、確保人工繁殖成功具有重要意義。這項(xiàng)工作需要借助電子顯微鏡的應(yīng)用，通過(guò)掃描電鏡對(duì)精子形態(tài)進(jìn)行觀察，可以了解精子表面的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，闡明光鏡未能觀察到的精子超微結(jié)構(gòu)。從20世紀(jì)七十年代開(kāi)始，陸續(xù)有學(xué)者對(duì)魚(yú)類(lèi)精子形態(tài)及微細(xì)結(jié)構(gòu)開(kāi)展研究。魚(yú)類(lèi)精子一般由頭部、頸部和較長(zhǎng)的尾部組成，各部位的結(jié)構(gòu)和含水量不相同，在傳統(tǒng)方法脫水、干燥、粘樣等過(guò)程中，容易因表面張力變化和外力機(jī)械損傷而引起精子開(kāi)裂或龜裂、斷裂等，使得表面結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致觀察效果差和難于作微細(xì)形態(tài)學(xué)分析。貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2008年10月第33卷第 5期刊登的“人精子掃描電鏡樣品的制備與觀察”，提供了一種用于人精子掃描電鏡樣品的制備方法。該方法應(yīng)用在魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡中存在的不足有1)乙醇脫水、干燥過(guò)程使魚(yú)類(lèi)精子變脆、易造成斷裂等機(jī)械損傷；2)精子樣品密度難以控制；3)用玻璃刀裁切含有樣品部位不易操作。由于精子是非常特殊的游離細(xì)胞，不易進(jìn)行常規(guī)電鏡制樣處理，且精液中含有較多的精漿成分，會(huì)影響電鏡觀察。為了適應(yīng)魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡的要求，更好的顯露表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，在制樣過(guò)程中必須進(jìn)行特殊處理，才能制備保持高度完整性和良好形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡觀察樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法。淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)—、固定液配制用O. 2M磷酸氫二鈉溶液的母液A和O. 2M磷酸二氫鈉溶液的母液B按體積比為 18 : 7的比例混合并用純水稀釋成pH7. 2,0. IM的PBS磷酸鹽緩沖液，然后用該P(yáng)BS磷酸鹽緩沖液稀釋戊二醛溶液，使戊二醛終濃度為2. 5%，獲得固定液；二、樣品固定將新采集的成熟雄魚(yú)精液于4°C、2500r/min條件下離心3min,棄去上清液,加入2 倍體積的固定液，30min后于2500r/min條件下離心3min、棄上清液,加入固定液,獲得精子固定樣品，置于4°C條件下備用；三、樣品臺(tái)準(zhǔn)備在金屬樣品臺(tái)上貼好鍍碳導(dǎo)電膠布，清洗裁剪后規(guī)格為O. 5cmX I. 5cm的蓋玻片、 擦干后粘貼到鍍碳導(dǎo)電膠布上，每塊玻片的位置做好標(biāo)識(shí)；
四、樣品滴片將精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2 3次，然后加入配制的PBS 磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6 IO7個(gè)/ml，混合均勻后用10 μ I微量加樣槍貼近步驟三中樣品臺(tái)上的玻片逐滴滴片，用無(wú)菌注射器針頭從滴液中心向四周做發(fā)散狀劃線， 靜置I 2min后，用濾紙輕輕吸干玻片上的液體，放入干燥器干燥I 2天，獲得干燥好的樣品臺(tái)；五、樣品鍍膜將干燥好的樣品臺(tái)用離子濺射鍍膜儀噴金90 110s，在精子樣品表面均勻鍍上一層厚度為9 Ilnm的金膜，完成鍍金的精子樣品可在掃描電子顯微鏡下觀察，即完成淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備。本發(fā)明對(duì)精子樣品未進(jìn)行脫水前處理，原理1)魚(yú)類(lèi)精子內(nèi)部幾乎完全由遺傳物質(zhì)組成，含水量很少，遠(yuǎn)低于其它需要進(jìn)行脫水干燥的生物樣品(70% 80%)。含水量較低的生物樣品(如毛發(fā)、牙齒、角質(zhì)等)可以直接鍍膜觀察；含水量高的樣品如果放入鏡體直接觀察，由于水分蒸發(fā)樣品就會(huì)收縮變形較大，表面微細(xì)結(jié)構(gòu)被破壞，并且水蒸氣污染物鏡、光闌等重要零部件，影響觀察效果。因此，含水量較少的魚(yú)類(lèi)精子樣品可以不脫水處理。
2)魚(yú)類(lèi)精子的外層是細(xì)胞質(zhì)膜，與其它生物樣品有細(xì)胞壁或纖維組織保持形態(tài)不同，經(jīng)脫水干燥后精子變脆，很容易發(fā)生斷裂、開(kāi)裂或龜裂等表面結(jié)構(gòu)破壞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)精子固定后的樣品不經(jīng)過(guò)乙醇脫水、干燥，可避免因表面張力變化而引起精子斷裂、開(kāi)裂或龜裂等表面結(jié)構(gòu)破壞；2)精液固定后經(jīng)PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2 3次，可去除精漿等其它成分，使樣品電鏡觀察時(shí)更清晰；3)精子滴片前用PBS 磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6 IO7個(gè)/ml，使精子分散均勻、密度適中，利于獲得單個(gè)精子完整形態(tài)觀察結(jié)果；4)先粘貼蓋玻片、后滴片，可避免樣品受到外力機(jī)械損傷；5) 滴片時(shí)采用微量加樣槍?zhuān)⒂冕橆^分散滴液，可避免樣品層太厚影響觀察效果；6)鍍膜儀噴金時(shí)間控制在90 110s，使精子樣品表面金膜厚度為9 llnm，可避免電鏡觀察時(shí)精子頭部與鞭毛光線反差過(guò)大。本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、易操作，精子完整率高、分布密度適中，技術(shù)成本低，可應(yīng)用于淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品的制備。


圖I為實(shí)施例中所得魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品放大2500倍的掃描電鏡圖；圖2為實(shí)施例中所得魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品放大1800倍的掃描電鏡圖。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、固定液配制用O. 2M磷酸氫二鈉溶液的母液A和O. 2M磷酸二氫鈉溶液的母液B按體積比為 18 : 7的比例混合并用純水稀釋成pH7. 2,0. IM的PBS磷酸鹽緩沖液，然后用該P(yáng)BS磷酸鹽緩沖液稀釋戊二醛溶液，使戊二醛終濃度為2. 5%，獲得固定液；
二、樣品固定將新采集的成熟雄魚(yú)精液于4°C、2500r/min條件下離心3min,棄去上清液,加入2 倍體積的固定液，30min后于2500r/min條件下離心3min、棄上清液,加入固定液,獲得精子固定樣品，置于4°C條件下備用；三、樣品臺(tái)準(zhǔn)備在金屬樣品臺(tái)上貼好鍍碳導(dǎo)電膠布，清洗裁剪后規(guī)格為O. 5cmX I. 5cm的蓋玻片、 擦干后粘貼到鍍碳導(dǎo)電膠布上，每塊玻片的位置做好標(biāo)識(shí)；四、樣品滴片將精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2 3次，然后加入配制的PBS 磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6 IO7個(gè)/ml，混合均勻后用10 μ I微量加樣槍貼近步驟三中樣品臺(tái)上的玻片逐滴滴片，用無(wú)菌注射器針頭從滴液中心向四周做發(fā)散狀劃線， 靜置I 2min后，用濾紙輕輕吸干玻片上的液體，放入干燥器干燥I 2天，獲得干燥好的樣品臺(tái)；五、樣品鍍膜將干燥好的樣品臺(tái)用離子濺射鍍膜儀噴金90 110s，在精子樣品表面均勻鍍上一層厚度為9 Ilnm的金膜，完成鍍金的精子樣品可在掃描電子顯微鏡下觀察，即完成淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備。本實(shí)施方式步驟一中戊二醛溶液為市售的質(zhì)量濃度25%的戊二醛溶液。本實(shí)施方式步驟二中精子的來(lái)源繁殖季節(jié)挑選成熟度好的雄淡水魚(yú)，進(jìn)行促黃體素釋放激素A2 (LHRH-A2)和絨促性素(HCG)混合激素催熟，使用劑量為L(zhǎng)HRH_A24 μ g/kg， HCG200IU/kg，腹腔一次注射，調(diào)節(jié)水溫22 24°C，IOh后可采到活力良好的新鮮精子樣品。本實(shí)施方式步驟三中樣品臺(tái)準(zhǔn)備的具體過(guò)程在金屬樣品臺(tái)上貼好鍍碳導(dǎo)電膠布，每隔I I. 5cm用刀切割I(lǐng) 2mm的分割線，將蓋玻片用鑷子和刀片裁剪成 O. 5cmXl. 5cm的小塊，清洗、擦干后粘貼到鍍碳導(dǎo)電膠布上，每塊玻片的位置做好標(biāo)識(shí)。本實(shí)施方式步驟四中精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2 3次，可去除精漿等其它成分，使樣品電鏡觀察時(shí)更清晰。本實(shí)施方式步驟四中加入配制的PBS磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6 IO7 個(gè)/ml，使精子分散均勻、密度適中，利于獲得單個(gè)精子完整形態(tài)觀察結(jié)果。本實(shí)施方式步驟五中離子濺射鍍膜儀的型號(hào)為日產(chǎn)E-1010 (HITACHI)型。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是，步驟四中將精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2次，然后加入配制的PBS磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6個(gè)/ml。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是，步驟五中將干燥好的樣品臺(tái)用離子濺射鍍膜儀噴金100s，在精子樣品表面均勻鍍上一層厚度為IOnm的金膜。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。實(shí)施例淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、固定液配制用O. 2M磷酸氫二鈉溶液的母液A和O. 2M磷酸二氫鈉溶液的母液B按體積比為18 : 7的比例混合并用純水稀釋成pH7. 2,0. IM的PBS磷酸鹽緩沖液，然后用該P(yáng)BS磷酸鹽緩沖液稀釋戊二醛溶液，使戊二醛終濃度為2. 5%，獲得固定液；二、樣品固定將新采集的成熟雄魚(yú)精液于4°C、2500r/min條件下離心3min,棄去上清液,加入2 倍體積的固定液，30min后于2500r/min條件下離心3min、棄上清液,加入固定液,獲得精子固定樣品，置于4°C條件下備用；三、樣品臺(tái)準(zhǔn)備在金屬樣品臺(tái)上貼好鍍碳導(dǎo)電膠布，清洗裁剪后規(guī)格為O. 5cmX I. 5cm的蓋玻片、 擦干后粘貼到鍍碳導(dǎo)電膠布上，每塊玻片的位置做好標(biāo)識(shí)；四、樣品滴片將精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗3次，然后加入配制的PBS磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6個(gè)/ml，混合均勻后用10 μ I微量加樣槍貼近步驟三中樣品臺(tái)上的玻片逐滴滴片，用無(wú)菌注射器針頭從滴液中心向四周做發(fā)散狀劃線，靜置2min 后，用濾紙輕輕吸干玻片上的液體，放入干燥器干燥2天，獲得干燥好的樣品臺(tái)；五、樣品鍍膜將干燥好的樣品臺(tái)用離子濺射鍍膜儀噴金100s，在精子樣品表面均勻鍍上一層厚度為IOnm的金膜，完成鍍金的精子樣品可在掃描電子顯微鏡下觀察，即完成淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備。本實(shí)施例步驟一中戊二醛溶液為市售的質(zhì)量濃度25%的戊二醛溶液。本實(shí)施例步驟二中精子的來(lái)源繁殖季節(jié)挑選成熟度好的雄鯉魚(yú)，進(jìn)行促黃體素釋放激素A2 (LHRH-A2)和絨促性素(HCG)混合激素催熟，使用劑量為L(zhǎng)HRH_A24 μ g/kg， HCG200單位/kg，腹腔一次注射，調(diào)節(jié)水溫22 24°C，IOh后可采到活力良好的新鮮精子樣
品O本實(shí)施例步驟五中離子濺射鍍膜儀的型號(hào)為日產(chǎn)E-1010 (HITACHI)型。本實(shí)施例與常用方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比見(jiàn)表I。表I掃描電鏡常用制樣方法與本實(shí)施例方法優(yōu)缺點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法，其特征在于淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)一、固定液配制用O.2M磷酸氫二鈉溶液的母液A和O. 2M磷酸二氫鈉溶液的母液B按體積比為18 7 的比例混合并用純水稀釋成pH7. 2,0. IM的PBS磷酸鹽緩沖液，然后用該P(yáng)BS磷酸鹽緩沖液稀釋戊二醛溶液，使戊二醛終濃度為2. 5%，獲得固定液；二樣品固定將新采集的成熟雄魚(yú)精液于4°C、2500r/min條件下離心3min,棄去上清液,加入2倍體積的固定液，30min后于2500r/min條件下離心3min、棄上清液,加入固定液,獲得精子固定樣品，置于4°C條件下備用；三、樣品臺(tái)準(zhǔn)備在金屬樣品臺(tái)上貼好鍍碳導(dǎo)電膠布，清洗裁剪后規(guī)格為O. 5cmX I. 5cm的蓋玻片、擦干后粘貼到鍍碳導(dǎo)電膠布上，每塊玻片的位置做好標(biāo)識(shí)；四、樣品滴片將精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2 3次，然后加入配制的PBS磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6 IO7個(gè)/ml，混合均勻后用10 μ I微量加樣槍貼近步驟三中樣品臺(tái)上的玻片逐滴滴片，用無(wú)菌注射器針頭從滴液中心向四周做發(fā)散狀劃線，靜置 I 2min后，用濾紙輕輕吸干玻片上的液體，放入干燥器干燥I 2天，獲得干燥好的樣品臺(tái)；五、樣品鍍膜將干燥好的樣品臺(tái)用離子濺射鍍膜儀噴金90 110s，在精子樣品表面均勻鍍上一層厚度為9 Ilnm的金膜，完成鍍金的精子樣品可在掃描電子顯微鏡下觀察，即完成淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法，其特征在于步驟四中將精子固定樣品用配制的PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2次，然后加入配制的PBS磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度數(shù)量級(jí)為IO6個(gè)/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法，其特征在于 步驟五中將干燥好的樣品臺(tái)用離子濺射鍍膜儀噴金100s，在精子樣品表面均勻鍍上一層厚度為IOnm的金膜。
全文摘要
一種淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備方法，它涉及一種淡水魚(yú)精子掃描電鏡樣品制備方法。方法一、固定液配制；二、樣品固定；三、樣品臺(tái)準(zhǔn)備；四、樣品滴片；五、樣品鍍膜，即完成淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品制備。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1)可避免因表面張力變化而引起精子斷裂、開(kāi)裂或龜裂等表面結(jié)構(gòu)破壞；2)樣品電鏡觀察時(shí)更清晰；3)精子分散均勻、密度適中，利于獲得單個(gè)精子完整形態(tài)觀察結(jié)果；4)可避免樣品受到外力機(jī)械損傷；5)可避免樣品層太厚影響觀察效果；6)可避免電鏡觀察時(shí)精子頭部與鞭毛光線反差過(guò)大。本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、易操作，精子完整率高、分布密度適中，技術(shù)成本低，可應(yīng)用于淡水魚(yú)類(lèi)精子掃描電鏡樣品的制備。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102607908SQ201210046338
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者徐偉, 李池陶, 耿龍武 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所