專利名稱：抗毒素/抗血清中Triton X-100殘留量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗毒素/抗血清中Triton X-100殘留量的測定方法。
背景技術(shù)：
抗毒素、抗血清(Antitoxin/Antiserum)是指采用特定的抗原免疫動物后,再收集高效價免疫血清，并經(jīng)過提取、純化后，制備出含完整抗體(IgG)或抗體片段[F(ab’ )2]的免疫球蛋白制品。以用于預防和治療各相應疾病引起的感染。由于抗毒素、抗血清原料來源于馬匹血漿，而馬匹又飼養(yǎng)在開放的環(huán)境中，其可能攜帶的病毒較多，因而該制品存在生物安全性問題。為了保證該制品的安全性，除了要控制免疫馬匹的飼養(yǎng)環(huán)境和馬匹血漿質(zhì)量外，在抗毒素、抗血清生產(chǎn)過程中，如何有效除去或滅活原料血漿中的病毒，是獲得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的關(guān)鍵問題。目前國內(nèi)外較為成熟的病毒滅活、去除方法有巴氏消毒法、干熱法、有機溶劑及去污劑法、納米膜過濾法、光化學法等，但對于動物源性生化提取制品，尤其是規(guī)模化生產(chǎn)抗毒素、抗血清的滅活病毒工藝，國內(nèi)外至今未見報道。有機溶劑及去污劑法是利用有機溶劑和去污劑的配伍，破壞病毒的脂質(zhì)包膜，使其失去傳染性，從而達到滅活病毒的目的。參照歐洲藥品管理局(EMEA)和我國國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的，針對人血液制品的相關(guān)技術(shù)法規(guī)，需要在抗毒素、抗血清生產(chǎn)工藝中增加有機溶劑及去污劑處理滅活病毒的步驟，其中有機溶劑選用磷酸三丁酯，去污劑選用 Triton X-IOO0該方法有很好的蛋白質(zhì)兼容性，能有效滅活病毒，且對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的影響甚微。但如何從制品中除去加入的有機溶劑和去污劑，則是該方法最大的難點。因此， 經(jīng)有機溶劑及去污劑(磷酸三丁酯/ Triton X-100)滅活的抗毒素、抗血清制品中Triton X-100的殘留量測定，是涉及其質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標之一。由于目前在抗毒素、抗血清制品中并無Triton X_100殘留測定的通用方法，因而難于有效控制經(jīng)有機溶劑及去污劑滅活病毒的抗毒素、抗血清制品的質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)有機溶劑/去污劑法滅活后的抗毒素/抗血清中 Triton X-100殘留量的測定方法，該方法能準確地測定抗毒素/抗血清中Triton X-100殘留量，并且方法準簡便、快速。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)一種抗毒素/抗血清中Triton X-100殘留量的測定方法，包括分別吸取對照品溶液、供試品溶液，采用高效液相色譜法進行測定，再通過峰面積與溶液濃度的比例進行常規(guī)計算，得到抗毒素/抗血清中Triton X-100的殘留量，其特征在于所述對照品溶液與供試品溶液的制備經(jīng)過下列各步驟(1)將對照品TritonX-100溶解于水中，制成每ImL溶液中含有5 20 μ g的Triton X-100的對照品溶液；
(2)取供試品抗毒素、抗血清O.5 lmL，過預先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，后用體積濃度為5 10%的甲醇溶液清洗，再用ImL甲醇洗脫，收集洗脫液即為供試品溶液。所述采用高效液相色譜法進行測定的色譜條件為反相液相色譜柱，以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑，以甲醇水溶液為流動相，并采用紫外檢測器，其檢測波長為220 240nm。所述甲醇水溶液中，甲醇與水的體積比為9 : I 7 : 3。所述步驟(2)中固相萃取柱的活化是先用ImL的甲醇通過固相萃取柱，再用ImL 水通過固相萃取柱，即得活化的固相萃取柱。所述甲醇為市購的分析純產(chǎn)品。所述步驟(2)中的固相萃取柱為親水親脂平衡型固相萃取柱，為ProElut PLS、 Oasis HLB, BOND ELUT PLEXA 中的一種。所述步驟(2)中的供試品抗毒素/抗血清是指經(jīng)過常規(guī)有機溶劑/去污劑法滅活后的抗毒素/抗血清。本發(fā)明能對破傷風抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等抗毒素/抗血清制品中的Triton X-100殘留量進行測定。本發(fā)明采用高效液相色譜法對Triton X_100殘留量進行測定，在免疫球蛋白制品中，含有大量的大分子物質(zhì)，對高效液相色譜系統(tǒng)尤其是色譜柱的損害較大，因此需在預處理中進行提純，除去大分子物質(zhì)，而Triton X-100在免疫球蛋白制品中的殘留量極低，處于ppm極，在預處理的過程中容易損失，影響測定的準確性，所以抗毒素、抗血清中Tri ton X-100的殘留量測定是一個技術(shù)難點。為了避免Triton X-100在處理過程中的損失，用水和甲醇清洗預活化的固液萃取柱，且用量不可過大，以ImL為宜。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果采用上述方案，從根本上解決了現(xiàn)有技術(shù)因免疫球蛋白制品中，含有大量的大分子物質(zhì)，以及Triton X-100在檢測過程中損失大，難于檢測出 Triton X-100殘留量的準確值等問題，有效地除去供試品中的大分子物質(zhì)及雜質(zhì)，最大限度地降低被測物Triton X-100的損失，確保測定結(jié)果的準確性，同時本發(fā)明提供的方法準確、快速、簡便。
具體實施例方式通過以下的實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下列實施例所述內(nèi)容。實施例I
破傷風抗毒素中Triton X-100殘留量的測定
儀器1、Aglient 1200高效液相色譜儀及ChemStations工作站 2、Mettler AE 240 電子天平
試劑與試藥=Triton X-100對照品(購自Sigma公司，批號118K0095);甲醇為色譜純 (美國Fisher化學試劑公司)；水為超純水；其它試劑均為分析純。經(jīng)過下列各步驟(1)將對照品TritonX-100溶解于水中，制成每ImL溶液中含有10μ g的Triton X-100 的對照品溶液；
(2)取經(jīng)過常規(guī)有機溶劑/去污劑法滅活后的供試品-破傷風抗毒素O. 5mL,過預先
活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用體積濃度為5%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脫，收集洗脫液即為供試品溶液；其中，固相萃取柱為親水親脂平衡型固相萃取柱Oasis HLB ;固相萃取柱的預先活化是先用ImL的甲醇溶液通過固相萃取柱，再用ImL水通過固相萃取柱；
(3 )分別吸取步驟(I)所得對照品溶液與步驟(2 )所得供試品溶液，按常規(guī)采用高效液相色譜法進行測定后，通過峰面積與溶液濃度的比例進行常規(guī)計算，得到破傷風抗毒素中 Triton X-100的殘留量為I. 5μ g/mL。其中，色譜條件為反相液相色譜柱，以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑，以甲醇水=8 2體積比的混合溶液為流動相，并采用檢測波長為 230nm的紫外檢測器,色譜柱的理論板數(shù)按Triton X-100計算不低于1500。實施例2
抗狂犬病血清中Triton X-100殘留量的測定
儀器1、Aglient 1200高效液相色譜儀及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240 電子天平
試劑與試藥=Triton X-100對照品(購自Sigma公司，批號118K0095);甲醇為色譜純 (美國Fisher化學試劑公司)；水為超純水；其它試劑均為分析純。經(jīng)過下列各步驟
(1)將對照品TritonX-100溶解于水中，制成每ImL含5 μ g的Triton X-100對照品溶液；
(2)取經(jīng)過常規(guī)有機溶劑/去污劑法滅活后的供試品——抗狂犬病血清lmL，過預先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用體積濃度為7%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脫，收集洗脫液即為供試品溶液；其中，固相萃取柱為親水親脂平衡型固相萃取柱ProElut PLS ;固相萃取柱的預先活化是先用ImL的甲醇溶液通過固相萃取柱，再用ImL水通過固相萃取柱；
(3 )分別吸取步驟(I)所得對照品溶液與步驟(2 )所得供試品溶液，按常規(guī)采用高效液相色譜法進行測定后，再通過峰面積與溶液濃度的比例進行常規(guī)計算，得到抗狂犬病血清中Triton X-100的殘留量0. 9 μ g/mL。其中，色譜條件為反相液相色譜柱，以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑，以甲醇水=9 I體積比的混合溶液為流動相，并采用檢測波長為 220nm的紫外檢測器,色譜柱的理論板數(shù)按Triton X-100計算不低于1500。實施例3
抗蛇毒血清中Triton X-100殘留量的測定
儀器1、Aglient 1200高效液相色譜儀及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240 電子天平
試劑與試藥=Triton X-100對照品(購自Sigma公司，批號118K0095);甲醇為色譜純 (美國Fisher化學試劑公司)；水為超純水；其它試劑均為分析純。經(jīng)過下列各步驟
(I)將對照品Triton X-100溶解于水中，制成每ImL含20 μ g的Triton X-100對照品溶液；
(2)取經(jīng)過常規(guī)有機溶劑/去污劑法滅活后的供試品-抗蛇毒血清O. 5mL,過預先
活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用體積濃度為10%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脫，收集洗脫液即為供試品溶液；其中，固相萃取柱為親水親脂平衡型固相萃取柱BOND ELUT PLEXA ;固相萃取柱的預先活化是先用ImL的甲醇溶液通過固相萃取柱，再用ImL水通過固相萃取柱；
(3 )分別吸取步驟(I)所得對照品溶液與步驟(2 )所得供試品溶液，按常規(guī)采用高效液相色譜法進行測定后，再通過峰面積與溶液濃度的比例進行常規(guī)計算，得到抗蛇毒血清中 Triton X-100的殘留量為2. I μ g/mL。其中色譜條件為反相液相色譜柱，以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑，以甲醇水=7 3體積比的混合溶液為流動相，并采用檢測波長為 240nm的紫外檢測器,色譜柱的理論板數(shù)按Triton X-100計算不低于1500。
權(quán)利要求
1.一種抗毒素/抗血清中Triton X-100殘留量的測定方法，包括分別吸取對照品溶液與供試品溶液，采用高效液相色譜法進行測定，再通過峰面積與溶液濃度的比例進行計算， 得到抗毒素、抗血清中Triton X-100的殘留量，其特征在于所述對照品溶液與供試品溶液的制備經(jīng)過下列各步驟Cl)將對照品Triton X-100溶解于水中，制成每ImL溶液含有5 20 μ g的Triton X-100的對照品溶液；(2)取供試品抗毒素/抗血清O. 5 lmL，過預先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用體積濃度為5% 10%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脫，收集洗脫液即為供試品溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于所述高效液相色譜法測定的色譜條件為反相液相色譜柱，以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑，以甲醇水溶液為流動相，并采用紫外檢測器，其檢測波長為220 240nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于所述甲醇水溶液中，甲醇與水的體積比為9 : I 7 : 3。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于所述步驟(2)中的固相萃取柱的活化是先用ImL的甲醇通過固相萃取柱，再用ImL水通過固相萃取柱，得活化的固相萃取柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于所述步驟(2)中的固相萃取柱為親水親脂平衡型固相萃取柱，為ProElut PLS, Oasis HLB, BOND ELUT PLEXA中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測定方法，其特征在于所述步驟(2)中的供試品抗毒素/抗血清是指經(jīng)過有機溶劑/去污劑法滅活后的抗毒素/抗血清。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗毒素/抗血清中TritonX-100殘留量的測定方法，包括分別吸取對照品溶液與供試品溶液，采用高效液相色譜法進行測定，再通過峰面積與溶液濃度的比例進行常規(guī)計算，得到抗毒素、抗血清中TritonX-100的殘留量。該法能有效除去大分子物質(zhì)及雜質(zhì)，并且在測定過程中有效防止被測定物TritonX-100的損失，確保測定結(jié)果的準確性，同時本發(fā)明提供的方法快速、簡便，能客觀地評價制品質(zhì)量。
文檔編號G01N30/89GK102590427SQ20121004373
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者吳笛, 楊冬, 羅靖雄 申請人:玉溪九洲生物技術(shù)有限責任公司