專利名稱：一種蕨類植物配子體石蠟切片的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物石蠟切片的方法，尤其是一種蕨類植物配子體石蠟切片的方法。
背景技術(shù)：
至今為止沒有專門應(yīng)用于制備蕨類植物切片的技術(shù)，通常使用常規(guī)的石蠟切片技術(shù)來制備蕨類植物的解剖切片。然而常規(guī)的石蠟切片技術(shù)會(huì)導(dǎo)致蕨類植物配子體流失水分，嚴(yán)重變形從而改變了細(xì)胞內(nèi)部形狀，無法正常通過常規(guī)的石蠟切片技術(shù)觀察到配子體的解剖結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種蕨類植物配子體石蠟切片的方法，包括取材與固定、沖洗、染色與藍(lán)化、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片、貼片、脫蠟與封片、鏡檢及照相，其中固定中采用改良的FAA固定液體，其組成為福爾馬林冰醋酸30%乙醇= 1:1: 18，以解決蕨類植物配子體非常幼嫩的問題。所述脫水和透明過程中，純酒精和純二甲苯處理階段時(shí)間為5min，其它各階段時(shí)間均為10分鐘。染色采用蘇木精整體染色法。在石蠟切片法中，經(jīng)常使用的是FAA固定液(福爾馬林冰醋酸70%乙醇= 1:1: 18)和卡諾固定液(無水乙醇冰乙酸=3 I)，幼嫩材料使用50%酒精配置的 FAA固定液。蕨類植物配子體個(gè)體較小，配子體大部分僅有一層細(xì)胞構(gòu)成且含水量豐富，在高濃度酒精的固定液和長時(shí)間的脫水、透明過程中容易脫水過度而收縮。本發(fā)明針對蕨類植物配子體非常幼嫩的特點(diǎn)，探討了 FAA固定液和卡諾固定液中的酒精濃度，最后選擇改良的FAA(福爾馬林冰醋酸30%乙醇=I I 18)作為固定液。縮短脫水和透明時(shí)間間隔，即30%乙醇一50%乙醇一70%乙醇一85%乙醇一95%乙醇一無水乙醇I —無水乙醇II — 2/3乙醇+1/3 二甲苯一1/2乙醇+1/2 二甲苯一1/3無水乙醇+2/3 二甲苯一純二甲苯I —純二甲苯II，每級lOmin，其中純酒精和純二甲苯5min。改良FAA固定液中，可以良好的固定細(xì)胞分裂各時(shí)期，從后期的石蠟切片中，我們可以觀察到大量的有絲分裂的切片，能夠詳細(xì)的反映整個(gè)發(fā)育過程。本實(shí)驗(yàn)中采用改良的石蠟切片法，染色采用蘇木精整體染色法，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間和后期染色時(shí)間，并獲得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為幼嫩材料特別是蕨類植物配子體的固定和石蠟切片提供了更快更好的切片方法。


圖I采用本方法制備的石蠟切片A胚胎發(fā)育 B頸卵器發(fā)育
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圖2采用傳統(tǒng)方法制備的石蠟切片A胚胎發(fā)育 B頸卵器發(fā)育
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)介紹本發(fā)明采用的方法。I、取材與固定第一次培養(yǎng)材料時(shí)，根據(jù)發(fā)育時(shí)間確定精子器、頸卵器、胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的時(shí)間范圍，經(jīng)過多次重復(fù)培養(yǎng)，大量取材；在顯微鏡下觀察并取材，盡快將材料快速置于改良的 FAA固定液中，并在4°C冰箱中保存，在改良FAA固定液中固定24h。2、沖洗將固定好的材料，在小流量流水沖洗I 2h，沖后30%酒精，50%酒精，70%酒精各 30min。3、染色與藍(lán)化愛氏蘇木精染色2 5d，細(xì)胞核成紅紫色，再利用自來水沖洗，使細(xì)胞核成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，藍(lán)化時(shí)間為3 5h即可；藍(lán)化合適的材料放入30%的酒精中進(jìn)行梯度脫水。4、脫水與透明采用乙醇逐級脫水法，即30%乙醇一50%乙醇一70%乙醇一85%乙醇一95% 乙醇一無水乙醇I —無水乙醇II,每級IOmin,其中無水乙醇5min ;脫水后經(jīng)過二甲苯以過渡，當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)；2/3 乙醇+1/3 二甲苯一1/2乙醇+1/2 二甲苯一1/3無水乙醇+2/3 二甲苯一純二甲苯I —純二甲苯II,每級IOmin,其中純二甲苯5min。5、浸蠟與包埋用石蠟逐漸取代二甲苯，具體過程是常溫下將削好的蠟屑，逐漸投入盛有材料的二甲苯小瓶中至飽和一37°C溫箱中加蠟屑，置于恒溫箱過夜一將小瓶中原液倒去1/2后補(bǔ)入1/2已熔化的純蠟，此過程重復(fù)2 3次一全部換純蠟2次，每步驟O. 5 Ih ;先疊成小的紙盒，再將熔化的石蠟倒入其中，迅速將材料移至盛石蠟的紙盒中，用鑷子或解剖針將材料擺正位置后，盒中石蠟逐漸凝固。為加速凝固，當(dāng)石蠟表面凝結(jié)成乳白色時(shí)，將盒移入冷臺上即可迅速變成硬塊。6、切片將已修好并固定的石蠟塊臺木裝在切片機(jī)的夾物臺上，切片刀固定在刀夾上，扭動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，并調(diào)整它們之間的角度，調(diào)整厚度計(jì)，控制切片厚度為 8 μ m，切片時(shí)，右手搖動(dòng)旋轉(zhuǎn)輪手柄，左手持毛筆將蠟帶提起，移至一張紙板上，準(zhǔn)備粘片。7、貼片在一清潔的載玻片上涂一薄層粘貼劑(由蛋清、甘油調(diào)制)，再滴加I 2滴蒸餾水，用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，擺好位置，注意蠟片光亮平整的一面貼于載玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽，然后將載片在酒精燈上微熱或置于預(yù)先加熱的展片臺(溫度保持在40 45°C)上，使蠟片展開，然后把載玻片放在展片夾上編好記號置于37°C溫箱烘干12h。
8、脫蠟與封片將干燥好的切片泡在二甲苯中I 2h進(jìn)行脫蠟處理，之后取出；等切片表面的二甲苯揮發(fā)后，滴一滴加拿大樹膠，取干凈的蓋玻片從樹膠滴一側(cè)放下蓋好，避免產(chǎn)生氣泡； 貼上標(biāo)簽，放在烘箱中充分脫苯，之后收入切片盒中。9、鏡檢及照相光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄,顯微攝影裝置(Olympus BH2 C5060WZ)下顯微拍照， 采用本方法獲得的結(jié)果如圖I所示，采用常規(guī)方法獲得的結(jié)果如圖2所示。。
權(quán)利要求
1.一種蕨類植物配子體石蠟切片的方法，包括取材與固定、沖洗、染色與藍(lán)化、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片、貼片、脫蠟與封片、鏡檢及照相，其特征在于固定采用改良的FAA 固定液體，其組成為福爾馬林冰醋酸30%乙醇=I : I : 18。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述脫水和透明過程中，純酒精和純二甲苯處理階段時(shí)間為5min，其它各階段時(shí)間均為10分鐘。
3.權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于染色采用蘇木精整體染色法。
4.權(quán)利要求I或2所述的片法，其特征在于具體步驟如下1)取材與固定第一次培養(yǎng)材料時(shí)，根據(jù)發(fā)育時(shí)間確定精子器、頸卵器、胚胎發(fā)育和孢子囊發(fā)育各個(gè)時(shí)期的時(shí)間范圍，然后經(jīng)過多次重復(fù)培養(yǎng)，大量取材；在顯微鏡下觀察并取材，盡快將材料快速置于改良的FAA固定液中，并在4°C冰箱中保存，在改良FAA固定液中固定24h ；2)沖洗將固定好的材料，在小流量流水沖洗I 2h，沖后30%酒精，50%酒精，70%酒精各 30min ；3)染色與藍(lán)化愛氏蘇木精染色2 5d，細(xì)胞核成紅紫色，再利用自來水沖洗，使細(xì)胞核成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成淺藍(lán)色，藍(lán)化時(shí)間為3 5h即可；藍(lán)化合適的材料放入30%的酒精中進(jìn)行梯度脫水；4)脫水與透明采用乙醇逐級脫水法，即30%乙醇一50%乙醇一70%乙醇一85%乙醇一95%乙醇 —無水乙醇I —無水乙醇II,每級IOmin,其中無水乙醇5min ;脫水后經(jīng)過二甲苯以過渡， 當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)；2/3乙醇 +1/3 二甲苯一1/2乙醇+1/2 二甲苯一1/3無水乙醇+2/3 二甲苯一純二甲苯I —純二甲苯II,每級IOmin,其中純二甲苯5min ；5)浸蠟與包埋用石蠟逐漸取代二甲苯，具體過程是常溫下將削好的蠟屑，逐漸投入盛有材料的二甲苯小瓶中至飽和一37°C溫箱中加蠟屑，置于恒溫箱過夜一將小瓶中原液倒去1/2后補(bǔ)入 1/2已熔化的純蠟，此過程重復(fù)2 3次一全部換純蠟2次，每步驟O. 5 Ih ;先疊成小的紙盒，再將熔化的石蠟倒入其中，迅速將材料移至盛石蠟的紙盒中，用鑷子或解剖針將材料擺正位置后，盒中石蠟逐漸凝固。為加速凝固，當(dāng)石蠟表面凝結(jié)成乳白色時(shí)，將盒移入冷臺上即可迅速變成硬塊；6)切片將已修好并固定的石蠟塊臺木裝在切片機(jī)的夾物臺上，切片刀固定在刀夾上，扭動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，并調(diào)整它們之間的角度，調(diào)整厚度計(jì)，控制切片厚度為8 μ m， 切片時(shí)，右手搖動(dòng)旋轉(zhuǎn)輪手柄，左手持毛筆將蠟帶提起，移至一張紙板上，準(zhǔn)備粘片；7)貼片在一清潔的載玻片上涂一薄層粘貼劑(由蛋清、甘油調(diào)制)，再滴加I 2滴蒸餾水，用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，擺好位置，注意蠟片光亮平整的一面貼于載玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽，然后將載片在酒精燈上微熱或置于預(yù)先加熱的展片臺(溫度保持在40 45°C)上，使蠟片展開，然后把載玻片放在展片夾上編好記號置于37°C溫箱烘干12h ；.8)脫蠟與封片將干燥好的切片泡在二甲苯中I 2h進(jìn)行脫蠟處理，之后取出；等切片表面的二甲苯揮發(fā)后，滴一滴加拿大樹膠，取干凈的蓋玻片從樹膠滴一側(cè)放下蓋好，避免產(chǎn)生氣泡；貼上標(biāo)簽，放在烘箱中充分脫苯，之后收入切片盒中；.9)鏡檢及照相光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄，顯微攝影裝置下顯微拍照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蕨類植物配子體石蠟切片的方法，包括取材與固定、沖洗、染色與藍(lán)化、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片、貼片、脫蠟與封片、鏡檢及照相，其中固定中采用改良的FAA固定液體，其組成為福爾馬林∶冰醋酸∶30％乙醇＝1∶1∶18。采用本發(fā)明提供的方法，能有效克服蕨類植物配子體非常幼嫩的特點(diǎn)，可以良好的固定細(xì)胞分裂各時(shí)期，從后期的石蠟切片中，我們可以觀察到大量的有絲分裂的切片，能夠詳細(xì)的反映整個(gè)發(fā)育過程，具有很好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號G01N1/28GK102607907SQ20121004306
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者常纓, 樊銳鋒, 黃慶陽 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)