專(zhuān)利名稱(chēng)：圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)。某些實(shí)施方式涉及執(zhí)行用于多重應(yīng)用中顆粒圖像處理的一個(gè)或多個(gè)步驟的方法和系統(tǒng)。相關(guān)技術(shù)描述以下描述和示例并不因其包含在本節(jié)中而被歸入現(xiàn)有技術(shù)。使用諸如電荷耦合裝置(CXD)檢測(cè)器之類(lèi)的檢測(cè)器成像被應(yīng)用在生物技術(shù)應(yīng)用的若干當(dāng)前可用儀器中。許多商用系統(tǒng)被配置成對(duì)目標(biāo)人類(lèi)(或其它動(dòng)物)細(xì)胞成像。然而，這些系統(tǒng)不能用來(lái)使用不同波長(zhǎng)的光生成圖像以確定細(xì)胞的身份或者細(xì)胞所屬亞類(lèi)。對(duì)于將CCD檢測(cè)器用于測(cè)量細(xì)胞的熒光發(fā)射的多重應(yīng)用而言，細(xì)胞或其它顆粒的亞類(lèi)或類(lèi)基于熒光發(fā)射在圖像中的絕對(duì)位置而非諸如波長(zhǎng)成分的熒光發(fā)射特征。因此，期望開(kāi)發(fā)一種用于多重應(yīng)用中顆粒圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
以上所列問(wèn)題大部分可由一種執(zhí)行與顆粒的數(shù)據(jù)圖像處理相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)步驟的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)來(lái)解決。以下僅為該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的示例性實(shí)施方式，不應(yīng)以任何方式解讀為對(duì)權(quán)利要求書(shū)的主題的限制。該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的實(shí)施方式可被配置成將帶有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像劃分成分區(qū)陣列，確定對(duì)分區(qū)內(nèi)多個(gè)像素測(cè)得的光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值，并將所確定的統(tǒng)計(jì)值指派為對(duì)應(yīng)分區(qū)的背景信號(hào)。除此以外或作為替代，該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的其它實(shí)施方式可被配置成分析帶有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像，以標(biāo)識(shí)圖像內(nèi)呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)值高于第一預(yù)定閾值的一個(gè)或多個(gè)像素。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)還可以被配置成在一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素的集合內(nèi)確定在該集合內(nèi)分別呈現(xiàn)最大光學(xué)參數(shù)值的位置，并計(jì)算在這些位置中的至少一個(gè)周?chē)亩鄠€(gè)像素的光學(xué)參數(shù)強(qiáng)度變化率。除此之外或作為替代，該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn) 方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的其它實(shí)施方式可被配置成獲取顆粒的多個(gè)圖像的數(shù)據(jù)，其中多個(gè)圖像的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于一不同波長(zhǎng)帶。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)可被配置成創(chuàng)建多個(gè)圖像的合成圖像，并操控多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)使得對(duì)應(yīng)于多個(gè)圖像中每一個(gè)內(nèi)顆粒的斑點(diǎn)在隨后的合成圖像內(nèi)會(huì)聚。除此之外或作為替代，該計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)的其它實(shí)施方式可被配置成分析帶有均勻濃度的與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的第一圖像以及帶有未知濃度的與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的第二圖像，以分別標(biāo)識(shí)第一和第二圖像內(nèi)呈現(xiàn)高于第一預(yù)定閾值的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)可被配置成在第一和第二圖像的各自分區(qū)內(nèi)對(duì)分別在分析第一和第二圖像的步驟中標(biāo)識(shí)的像素集合進(jìn)行歸類(lèi)，其中第一和第二圖像中分區(qū)的尺寸基本上相等。該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)還可被配置成對(duì)第一圖像內(nèi)的每個(gè)相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生像素集合所歸類(lèi)到的熒光發(fā)射水平的統(tǒng)計(jì)代表量。此外，該方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)可被配置成分區(qū)將在分析第二圖像的步驟期間標(biāo)識(shí)的每個(gè)像素集合的熒光發(fā)射水平除以對(duì)相應(yīng)的第一圖像分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量，以獲得歸一化的熒光值。附圖簡(jiǎn)述
通過(guò)閱讀以下詳細(xì)描述并參照附圖，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)，在附圖中圖I是示出被配置成為多重應(yīng)用的獲取和處理圖像的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方式的橫截面圖的示意圖；圖2是描繪確定圖像內(nèi)背景信號(hào)的方法的流程圖；圖3是描繪發(fā)現(xiàn)顆粒并判定是接受還是拒絕對(duì)顆粒進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理的方法的流程圖；圖4是描繪圖像間對(duì)準(zhǔn)的方法的流程圖；以及圖5是描繪用于為成像系統(tǒng)創(chuàng)建歸一化矩陣并將該歸一化矩陣應(yīng)用于后續(xù)成像的方法的流程圖。雖然本發(fā)明允許各種變體和替換形式，但是在附圖中通過(guò)示例的方式示出其具體實(shí)施方式
，并在本文中進(jìn)行詳細(xì)描述。然而應(yīng)該理解，附圖和詳細(xì)描述并不旨在將本發(fā)明限制于所公開(kāi)的特定形式，相反，本發(fā)明涵蓋落在由所附權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有變體、等效方案和替換方案。較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述雖然本文針對(duì)顆粒描述各實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解，本文所述的系統(tǒng)和方法也可用于微球、聚苯乙烯小珠、微粒、金納米顆粒、量子點(diǎn)、納米點(diǎn)、納米顆粒、納米殼、小珠、微珠、膠乳顆粒、膠乳小珠、熒光小珠、熒光顆粒、著色顆粒、著色小珠、組織、細(xì)胞、微生物、有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、或本領(lǐng)域中已知的任何其它離散物質(zhì)。顆粒可用作分子反應(yīng)的媒介。在 Fulton 的美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，736，330、Chandler 等人的 No. 5，981，180、Fulton 的No. 6，057，107、Chandler 等人的 No. 6，268，222、Chandler 等人的 No. 6，449，562、Chandler等人的 No. 6，514，295、Chandler 等人的 No. 6，524，793 以及 Chandler 的 No. 6，528，165 中示出并描述了適當(dāng)顆粒的示例，這些專(zhuān)利被結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。本文所描述的系統(tǒng)和方法可用于在這些專(zhuān)利中描述的任何顆粒。此外，在本文所描述的方法和系統(tǒng)實(shí)施方式中使用的顆粒可從諸如得克薩斯州奧斯汀市的盧米尼克斯公司(LuminexCorporation)的制造商處購(gòu)得。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“顆?！焙汀拔⑶颉笨上嗷ソ粨Q。此外，與本文所描述的系統(tǒng)和方法兼容的顆粒類(lèi)型包括帶有附加到顆粒表面或者與顆粒表面相關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒。在Chandler等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 6，268，222以及Chandler等人的No. 6，649，414中示出并描述了這些顆粒類(lèi)型，其中熒光染料或熒光顆粒被直接耦聯(lián)到顆粒表面以提供歸類(lèi)熒光(即經(jīng)測(cè)量并用于確定顆粒身份或顆粒所屬亞類(lèi)的熒光發(fā)射)，這些專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣?？捎糜诒疚乃龇椒ê拖到y(tǒng)的顆粒類(lèi)型還包括將一種或多種熒光物或熒光染料納入顆粒核中的顆粒。可用于本文所描述的方法和系統(tǒng)的顆粒還包括到曝露在一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)光源下時(shí)其內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)熒光信號(hào)的顆粒。此外，還可以將顆粒制成在這些顆粒被激發(fā)時(shí)呈現(xiàn)多個(gè)熒光信號(hào)，每一個(gè)信號(hào)可單獨(dú)或結(jié)合起來(lái)用于確定顆粒的身份。如下所述，圖像數(shù)據(jù)處理可包括顆粒歸類(lèi)，尤其是對(duì)于多分析物流體，以及確定綁定到顆粒上的分析物的量。由于在操作過(guò)程中表示綁定到顆粒的分析物的量的指示信號(hào)通常是未知的，因此對(duì)本文所描述的過(guò)程可使用特殊染色的顆粒，這些顆粒不僅發(fā)射歸類(lèi)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶內(nèi)的熒光，而且發(fā)射指示波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶內(nèi)的熒光。
本文所描述的方法通常包括分析一個(gè)或多個(gè)顆粒圖像并處理從圖像測(cè)得的數(shù)據(jù)以確定顆粒的一個(gè)或多個(gè)特征，諸如，但不限于表示顆粒在多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射大小的數(shù)值?？筛鶕?jù)Fulton的美國(guó)專(zhuān)利No. 5，736，330、Chandler等人的No. 5,981, 180、Chandler 等人的 No. 6, 449, 562、Chandler 等人的 No. 6, 524, 793、Chandler 的No. 6，592，822以及Chandler等人的No. 6，939，720中描述的方法對(duì)顆粒的一個(gè)或多個(gè)特征進(jìn)行后續(xù)處理，諸如使用一個(gè)或多個(gè)數(shù)值來(lái)確定表示顆粒所屬的多重復(fù)用亞類(lèi)的標(biāo)志ID和/或表示綁定到顆粒表面的分析物的存在和/或量的指示值，這些專(zhuān)利通過(guò)應(yīng)用結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。在一個(gè)示例中，Chandler等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 5,981，180中描述的技術(shù)可在多重復(fù)用方案中與本文描述的熒光測(cè)量一起使用，其中將顆粒歸類(lèi)歸類(lèi)成亞類(lèi)用以分析單個(gè)樣品中的多個(gè)分析物。參照附圖，注意，圖I并未按比例繪制。特別地，明顯放大圖中某些元件的比例，以強(qiáng)調(diào)這些元件的特征。為清楚起見(jiàn)，圖中并未包含系統(tǒng)的某些元件。圖I示出被配置成根據(jù)本文所述方法的各個(gè)實(shí)施方式生成、獲取或提供顆粒圖像并對(duì)圖像進(jìn)行處理的一個(gè)系統(tǒng)實(shí)施方式。圖I所示的系統(tǒng)可在諸如顆粒的多分析物測(cè)量的應(yīng)用中使用。該系統(tǒng)包括含有光源10的成像子系統(tǒng)。光源10可包括一個(gè)或多個(gè)光源，諸如發(fā)光二極管(LED)、激光器、弧光燈、白熾燈、或本領(lǐng)域中任何其它合適光源。除此之外或作為替代，光源可包括一個(gè)以上的光源(未示出)，每個(gè)光源被配置成生成不同波長(zhǎng)或不同波長(zhǎng)帶的光。用于圖I所示系統(tǒng)的適當(dāng)光源組合的一個(gè)示例包括，但不限于兩個(gè)或多個(gè)LED?？赏ㄟ^(guò)分束器(未示出)或本領(lǐng)域中已知的任何其它合適光學(xué)元件將來(lái)自一個(gè)以上光源的光組合到共用照明光路中，使得來(lái)自這些光源的光可被同時(shí)導(dǎo)向顆粒?；蛘?，成像子系統(tǒng)可以包括諸如反射鏡的光學(xué)元件(未示出)以及被配置成取決于使用哪個(gè)光源來(lái)照射顆粒而將該光學(xué)元件移進(jìn)和移出照射光路的器件(未示出)。以這種方式，可以使用光源來(lái)以不同光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶依次照射顆粒。(多個(gè))光源還可以從基板(未示出)上方而非下方照射基板。光源可被選擇成提供使顆粒或耦聯(lián)其上的材料發(fā)射熒光的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光。作為實(shí)例，可將波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶選擇成激發(fā)納入顆粒中和/或耦聯(lián)到顆粒表面的熒光染料或其它熒光材料。以這種方式，可將波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶選擇成使顆粒發(fā)射用于顆粒歸類(lèi)的熒光。此夕卜，波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶可以被選擇成使顆粒發(fā)射用于檢測(cè)和/或量化在顆粒表面上發(fā)生的反應(yīng)的突光。如圖I所示，成像子系統(tǒng)可以包括被配置成將光從光源10引導(dǎo)到顆粒16所固定的基板14的光學(xué)元件12。在一個(gè)示例中，光學(xué)元件12可以是準(zhǔn)直透鏡。然而，光學(xué)元件12可以包括能夠用于對(duì)從光源10到基板14的光進(jìn)行成像的任何其它適當(dāng)光學(xué)元件。此外，雖然在圖I中將光學(xué)元件示為單個(gè)光學(xué)元件，但是應(yīng)該理解，光學(xué)元件12可以包括一個(gè)以上的折射元件。此外，雖然在

圖1中將光學(xué)元件12示為折射光學(xué)元件，但是應(yīng)該理解，可使用一個(gè)或多個(gè)反射光學(xué)元件(可能與一個(gè)或多個(gè)折射光學(xué)元件組合)來(lái)對(duì)從光源10到基本14的光進(jìn)行成像。顆粒16可以包括以上所述的任何顆粒。基板14可以包括本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)基板。固定在基板14上的顆?？杀恢糜谟糜诒３只?4和在其上固定的顆粒16相對(duì)于成像子系統(tǒng)的位置的成像室(未示出)或任何其它器件中。用于保持基板14的位置的器件也可被配置成在成像之前改變?cè)摶宓奈恢?例如將成像系統(tǒng)聚焦在基板上)?？梢允褂么判晕?、真空過(guò)濾板、或本領(lǐng)域中已知的任何其它適當(dāng)方法在基板上對(duì)顆粒進(jìn)行固定。用于定位微球以供成像的方法和系統(tǒng)的示例在Pempsell的2005年11月9日提交的序列號(hào)為11/270，786的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中有描述，該申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合于此，如同在本文中詳盡闡述一樣。顆粒固定方法本身對(duì)本文所述的方法和系統(tǒng)并不十分重要。然而，較佳地將顆粒固定成使顆粒在檢測(cè)器積分時(shí)段沒(méi)有可感知的運(yùn)動(dòng)，該時(shí)段可能幾秒鐘長(zhǎng)。如圖I所示，成像子系統(tǒng)可包括光學(xué)元件18和分束器20。光學(xué)元件18被配置成將來(lái)自基板14和在其上固定的顆粒16的光聚焦到分束器20。還可以如上相對(duì)于光學(xué)元件12所述地配置光學(xué)元件18。分束器20可以包括本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)分束器。分束器20可被配置基于光的波長(zhǎng)將來(lái)自光學(xué)元件18的光導(dǎo)向不同的檢測(cè)器。例如，具有第一波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光可透過(guò)分束器20，而具有與第一波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶不同的第二波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光可被分束器20反射。成像子系統(tǒng)還可以包括光學(xué)元件22和檢測(cè)器24。透過(guò)分束器20的光可被導(dǎo)向光學(xué)元件22。光學(xué)元件22被配置成將透過(guò)分束器的光聚焦到檢測(cè)器24上。成像子系統(tǒng)還可以包括光學(xué)兀件26和檢測(cè)器28。被分束器20反射的光可被導(dǎo)向光學(xué)兀件26。光學(xué)元件26被配置成將由分束器反射的光聚焦到檢測(cè)器28上?？梢匀缟舷嚓P(guān)于光學(xué)元件12所述地配置光學(xué)元件22和26。檢測(cè)器24和28可以包括例如，電荷耦合裝置(CCD)檢測(cè)器或本領(lǐng)域中已知的任何其它合適成像檢測(cè)器，諸如CMOS檢測(cè)器、光敏元件的二維陣列、時(shí)間延遲積分(TDI)檢測(cè)器等。在某些實(shí)施方式中，可使用諸如二維CCD成像陣列的檢測(cè)器來(lái)同時(shí)獲取基本上整個(gè)基板的圖像或固定在基板上的全部顆粒的圖像。以這種方式，來(lái)自基板上所照射區(qū)域的所有光子可被同時(shí)采集，由此消除因在包括光電倍增管(PMT)和掃描器件的其它當(dāng)前可用系統(tǒng)中使用采樣開(kāi)口而導(dǎo)致的誤差。此外，該系統(tǒng)中包含的檢測(cè)器的數(shù)目可以等于感興趣的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶數(shù)，使得每個(gè)檢測(cè)器用于生成波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶之一下的圖像?？墒褂迷O(shè)置在從分束器到檢測(cè)器的光路中的光學(xué)帶通元件(未示出)或者本領(lǐng)域中已知的任何其它合適光學(xué)元件，來(lái)對(duì)由檢測(cè)器生成的每個(gè)圖像進(jìn)行光譜濾波。所捕捉的每個(gè)圖像使用不同的濾波“帶”。可以將獲取圖像的每個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的檢測(cè)波長(zhǎng)中心和寬度可與感興趣的熒光發(fā)射相匹配，無(wú)論是用于顆粒歸類(lèi)還是指示信號(hào)。以這種方式，可將圖I所示的系統(tǒng)的成像子系統(tǒng)配置成同時(shí)在不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上生成多個(gè)圖像。雖然圖I所示的系統(tǒng)包括兩個(gè)檢測(cè)器，但是應(yīng)該理解，該系統(tǒng)可以包括兩個(gè)以上的檢測(cè)器(例如三個(gè)檢測(cè)器、四個(gè)檢測(cè)器等等)。如上所述，可將每個(gè)檢測(cè)器配置成通過(guò)包括用于同時(shí)將不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光導(dǎo)向不同檢測(cè)器的一個(gè)或多個(gè)光學(xué)元件，來(lái)同時(shí)在不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上生成圖像。此外，雖然在圖I中將該系統(tǒng)示為包括多個(gè)檢測(cè)器，但是應(yīng)該理解，該系統(tǒng)可以包括單個(gè)檢測(cè)器。單個(gè)檢測(cè)器可用于在多個(gè)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上依次生成多個(gè)圖像。例如，可將不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的光依次導(dǎo)向基板，并在使用不同波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的每一個(gè)照射基板的過(guò)程中生成不同的圖像。在另一示例中，可以更改用于選擇導(dǎo)向單個(gè)檢測(cè)器的光的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶(例如通過(guò)將不同的濾波器移進(jìn)和移出成像光路)，以在不同的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上依次生成圖像。因此，將圖I所示的成像子系統(tǒng)配置成生成表示顆粒在若干感興趣的波長(zhǎng)上的熒光發(fā)射的多個(gè)圖像或一個(gè)圖像系列。此外，該系統(tǒng)可被配置成向處理器(即處理引擎)提供表示顆粒的熒光發(fā)射的多個(gè)數(shù)字圖像或數(shù)字圖像系列。在一個(gè)這種示例中，該系統(tǒng)可以包括處理器30。處理器30可被配置成從檢測(cè)器24和28獲取(例如接收)圖像數(shù)據(jù)。例如，可采用本領(lǐng)域中已知的任何合適方式(例如經(jīng)由傳輸介質(zhì)(未示出)，每個(gè)介質(zhì)通過(guò)各自耦合在檢測(cè)器之一與處理器之間的諸如模數(shù)轉(zhuǎn)換器的一個(gè)或多個(gè)電子組件將檢測(cè)器之一耦合到處理器)將處理器30耦合到檢測(cè)器24和28。較佳地，處理器30被配置成處理和分析這些圖像以確定顆粒16的一個(gè)或多個(gè)特性，諸如顆粒歸類(lèi)以及與在顆粒表面上發(fā)生的反應(yīng)有關(guān)的信息?？捎商幚砥饕匀魏魏线m格式輸出該一個(gè)或多個(gè)特性，諸如具有在每個(gè)波長(zhǎng)下每個(gè)顆粒的熒光大小的條目的數(shù)據(jù)陣列。具體而言，處理器可被配置成執(zhí)行本文所述的方法實(shí)施方式的一個(gè)或多個(gè)步驟來(lái)處理和分析圖像。處理器30可以是諸如通常包括在典型的個(gè)人計(jì)算機(jī)、大型計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、工作站等中的處理器。一般而言，術(shù)語(yǔ)“計(jì)算機(jī)系統(tǒng)”可以被寬泛地定義成涵蓋具有執(zhí)行來(lái)自存儲(chǔ)器介質(zhì)的指令的一個(gè)或多個(gè)處理器的任何設(shè)備?？梢允褂萌魏纹渌m當(dāng)功能硬件來(lái)實(shí)現(xiàn)處理器。例如，處理器可以包括在固件中含有固定程序的數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門(mén)陣列(FPGA)、或者采用以諸如極高速集成電路(VHSIC)硬件描述語(yǔ)言(VHDL) “編寫(xiě)”的順序邏輯的其它可編程邏輯器件(PLD)。在另一示例中，可在處理器30上執(zhí)行以執(zhí)行本文所述的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法的一個(gè)或多個(gè)步驟的程序指令(未示出)可以按需采用諸如C#(部分適當(dāng)采用C++)、ActiveX控件、JavaBeans、微軟基礎(chǔ)類(lèi)(MFC)的高級(jí)語(yǔ)言或其它技術(shù)或方法來(lái)編碼?？刹捎酶鞣N方式中的任一種來(lái)實(shí)現(xiàn)程序指令，包括基于過(guò)程的技術(shù)、基于組件的技術(shù)、和/或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)等。實(shí)現(xiàn)諸如本文所述的方法的程序指令可在存儲(chǔ)介質(zhì)上傳送或者在其上存儲(chǔ)。存儲(chǔ)介質(zhì)可以包括，但不限于只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、磁盤(pán)或光盤(pán)、或者磁帶。對(duì)于每個(gè)圖像，可將所有定位的顆粒以及針對(duì)每個(gè)所標(biāo)識(shí)顆粒確定的值和/或統(tǒng)計(jì)量存儲(chǔ)在存儲(chǔ)介質(zhì)內(nèi)的存儲(chǔ)器介質(zhì)中。本文所述的圖像處理方法可以通過(guò)采用一個(gè)或多個(gè)算法來(lái)執(zhí)行。如以下更詳細(xì)描述地，這些算法可能是復(fù)雜的，因此最好通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)。這樣，本文中特別參照?qǐng)D2-5所述的方法可被稱(chēng)為“計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法”，因此在本文中，術(shù)語(yǔ)“方法”和“計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法”可以交換使用。注意，在某些情況下，計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法和本文所述系統(tǒng)的程序指令可被配置成執(zhí)行除了與本文所述方法相關(guān)聯(lián)的那些之外的進(jìn)程，因此，計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法和本文所述系統(tǒng)的程序指令沒(méi)有必要局限于圖2-5的描述。
本文所述的基于成像的系統(tǒng)是替代傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)類(lèi)型的測(cè)量系統(tǒng)的可行候選。本文所述的方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)在數(shù)據(jù)處理方面可以比基于流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用所必需的更加復(fù)雜。然而，本文所述系統(tǒng)的硬件(例如光源、光學(xué)元件、檢測(cè)器等)具有比典型流式細(xì)胞術(shù)便宜和耐用得多的可能。期望對(duì)本文所述的方法的進(jìn)一步評(píng)估和改進(jìn)(例如可用于實(shí)現(xiàn)這些方法的算法的進(jìn)一步評(píng)估和改進(jìn))會(huì)導(dǎo)致對(duì)處理能力的需要降低、對(duì)熒光發(fā)射值的確定更加準(zhǔn)確、以及因此對(duì)顆粒的一個(gè)或多個(gè)特性的確定更加準(zhǔn)確。根據(jù)一實(shí)施方式，用于圖像數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法包括以下步驟(即高級(jí)操作)的一個(gè)或多個(gè)背景信號(hào)測(cè)量、使用歸類(lèi)染料發(fā)射和群集排異來(lái)標(biāo)識(shí)(即發(fā)現(xiàn))顆粒、圖像間對(duì)準(zhǔn)、圖像間顆粒校正、指示發(fā)射的熒光積分、以及圖像平面歸一化。這些步驟可通過(guò)以上所列次序來(lái)依次執(zhí)行。一般而言 ，可以執(zhí)行背景信號(hào)測(cè)量，使得從顆粒發(fā)射的熒光被準(zhǔn)確確定(即來(lái)自顆粒的熒光測(cè)量可獨(dú)立于圖像背景中的反射光水平以及來(lái)自用于對(duì)顆粒成像的成像系統(tǒng)的噪聲和暗電流偏移來(lái)確定)。圖2示出表示用于測(cè)量圖像的背景信號(hào)的示例性步驟序列的流程圖。如圖2的框40所示，該方法可以包括將具有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像分成分區(qū)陣列。這一陣列可以包括任意數(shù)目的行和列，這取決于所需背景信號(hào)的清晰度、系統(tǒng)的處理能力、和/或正在分析的顆粒數(shù)。如圖2進(jìn)一步示出的，該方法在框40之后所沿的路徑可以取決于圖像內(nèi)顆粒的占有率。具體而言，在框40之后，該流程進(jìn)行到框42，其中對(duì)圖像內(nèi)的顆粒占有率是否被量化進(jìn)行判定。在其中顆粒占有率已被量化的實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)行到框44，其中對(duì)占有率是否小于預(yù)定閾值進(jìn)行判定。圖2的流程圖在框44中具體指出了 50%占有率的閾值，但是注意，該方法并不受限于此。特別地，可以將該方法更改成考慮任何預(yù)定的占有率值，由此確定測(cè)量圖像背景信號(hào)的動(dòng)作路線(xiàn)。在感興趣的顆粒占據(jù)小于預(yù)定閾值(例如小于約50% )的圖像區(qū)域的實(shí)施方式中，背景信號(hào)測(cè)量可以包括在分區(qū)內(nèi)的所有像素中確定光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值，如框46所示。因此，可將與該分區(qū)內(nèi)的顆粒對(duì)應(yīng)的相對(duì)較亮像素的熒光值與來(lái)自該分區(qū)內(nèi)背景像素(不與像素出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的像素)的信號(hào)合并。然而，由于顆粒占據(jù)較小量的分區(qū)，所以統(tǒng)計(jì)值更能代表背景像素。一般而言，統(tǒng)計(jì)值可以包括任意數(shù)目的統(tǒng)計(jì)參數(shù)，包括但不限于，中值、平均值、模和截尾平均值。在某些實(shí)施方式中，確定中值是特別有益的。在其它實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)行到框50、52和54，以確定小于分區(qū)內(nèi)全部像素的光學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)值。特別地，在感興趣的顆粒的占有率大于或等于成像區(qū)域的預(yù)定閾值(例如大于或等于約50%，如連接框44和框50的箭頭所示)的實(shí)施方式中，或者當(dāng)顆粒對(duì)成像區(qū)域的占有率尚為未知(例如如連接框42和框50的箭頭所示)的實(shí)施方式中，背景信號(hào)測(cè)量的方法可以通過(guò)確定小于分區(qū)內(nèi)全部像素的光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值來(lái)補(bǔ)償顆粒區(qū)域與背景區(qū)域的較大或未知比值。特別地，可以標(biāo)識(shí)圖像內(nèi)呈現(xiàn)預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的像素，如框50所示。在某些情況下，在框50中標(biāo)識(shí)的像素可以與緊鄰排列的像素形成組，如框52所示。然而，這一過(guò)程步驟是可任選地，如該框的虛線(xiàn)邊界所示，因此在某些情況下可從該方法刪除。在任一情況下，該方法可以進(jìn)行到框54，其中只在該分區(qū)內(nèi)未被標(biāo)識(shí)為呈現(xiàn)預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)(如框50所述)的一組像素中確定光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值。在某些實(shí)施方式中，也可以根據(jù)光學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)值的確定排除與這些所標(biāo)識(shí)像素形成組的像素。以這種方式，在框50中標(biāo)識(shí)的像素以及(在某些情況下)與在框52所標(biāo)識(shí)的像素形成組的像素可被與背景信號(hào)的測(cè)量隔離。在任一情況下，無(wú)論所使用的過(guò)程步驟序列如何，其統(tǒng)計(jì)值被確定的光學(xué)參數(shù)可以是在一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下所測(cè)量的顆粒的任何熒光發(fā)射、圖像背景中的散射光發(fā)射、以及來(lái)自用于對(duì)顆粒成像的成像系統(tǒng)的任何噪聲和暗電流偏移。此外，無(wú)論所使用的過(guò)程步驟序列如何，該方法可以進(jìn)行到框56，以將所確定的統(tǒng)計(jì)值指派為對(duì)應(yīng)分區(qū)的背景信號(hào)。更具體地，分區(qū)內(nèi)全部像素的背景信號(hào)水平可被賦予對(duì)該分區(qū)計(jì)算的統(tǒng)計(jì)值。在某些情況下，可對(duì)圖像中的其它分區(qū)重復(fù)框46、50、52、54和56的過(guò)程步驟，并且在某些情況下，對(duì)圖像中的全部分區(qū)重復(fù)。以這種方式，對(duì)多個(gè)分區(qū)的每一個(gè)以及在某些情況下對(duì)全部分區(qū)，確定光學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)值。在某些情況下，在兩個(gè)分區(qū)的邊界處可能會(huì)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)值的相對(duì)尖銳的反差。為了平滑相鄰分區(qū)之間統(tǒng)計(jì)值的不連續(xù)差異，可對(duì)分區(qū)陣列執(zhí)行二維統(tǒng)計(jì)濾波(例如中值濾波或均值濾波)。結(jié)果，分區(qū)可在其邊界處得到平滑。無(wú)論是否使用統(tǒng)計(jì)濾波，可將包含所計(jì)算統(tǒng)計(jì)值的所得nxm像素分區(qū)矩陣存儲(chǔ)為“背景圖像”，可如下進(jìn)一步所述地使用該矩陣。
注意，參照?qǐng)D2所述的方法可以包括上述用于背景信號(hào)測(cè)量的方法的附加步驟，因此，該方法沒(méi)有必要受限于圖2的描述。例如，省略圖2的框46、50、52、54和56的重復(fù)并非必然限制本文所述的方法對(duì)這一可能性的包含。如上所述，本文所述的用于圖像數(shù)據(jù)處理的方法可以包括使用來(lái)自歸類(lèi)染料和群集排斥(即位置相對(duì)靠近的顆粒的排斥)的熒光發(fā)射來(lái)發(fā)現(xiàn)顆粒的過(guò)程。在某些實(shí)施方式中，本文所述的顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程可在確定圖像內(nèi)背景信號(hào)的水平之后進(jìn)行，并且在某些情況下，具體地可在參照?qǐng)D2所述的背景信號(hào)測(cè)量方法之后進(jìn)行。然而，在其它實(shí)施方式中，本文所述的顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程可以獨(dú)立于背景信號(hào)測(cè)量來(lái)執(zhí)行。圖3示出表示顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程的示例性步驟序列的流程圖。如圖3的框60所示，該方法可以包括分析具有與其關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的圖像，以標(biāo)識(shí)圖像內(nèi)呈現(xiàn)預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。例如，在歸類(lèi)圖像(即從在歸類(lèi)染料的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶上發(fā)射的光生成的圖像)中搜索呈現(xiàn)強(qiáng)度比該圖像的背景信號(hào)更高的熒光的像素。在某些實(shí)施方式中，可在該圖像中搜索強(qiáng)度大大高于該圖像的背景信號(hào)的像素，諸如強(qiáng)度高2-1000倍的量級(jí)。也可以使用相對(duì)于圖像的背景信號(hào)相對(duì)較小或較大的強(qiáng)度水平。在其它情況下，可在該圖像中搜索呈現(xiàn)固定熒光值的像素，該值可以取決于圖像的背景信號(hào)或者與其無(wú)關(guān)。在任一情況下，像素或像素集合的更高水平的熒光發(fā)射可以表明熒光發(fā)射顆粒的存在。在某些實(shí)施方式中，顆粒可被包含在單個(gè)像素內(nèi)。然而，在其它實(shí)施方式中，顆?？缮⒉荚诙鄠€(gè)像素中。在任一情況下，可對(duì)在框60標(biāo)識(shí)的像素進(jìn)行評(píng)估，以確定顆粒在圖像內(nèi)的位置。特別地，圖3所示的方法可以進(jìn)行到框62，以確定多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素內(nèi)各自呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置，由此檢測(cè)圖像內(nèi)顆粒的存在。雖然這些像素可被單個(gè)地評(píng)估，且因此單個(gè)像素內(nèi)的位置可通過(guò)框62確定，框62還可以包括在所標(biāo)識(shí)的像素集合中確定一位置。如本文所使用的，“像素集合”一般可以指彼此緊鄰排列的像素分組(即連續(xù)排列像素的群集或聚集)。在某些實(shí)施方式中，評(píng)估像素集合以確定圖像內(nèi)顆粒的位置是有益的。特別地，如上所述，顆?？梢陨⒉荚诙鄠€(gè)像素中，并且如果是這樣，確定單個(gè)像素內(nèi)的位置可能會(huì)錯(cuò)誤地傳達(dá)比實(shí)際成像更多的顆粒的存在。此外，如果在圖像中顆粒的位置與一個(gè)或多個(gè)其它顆粒相對(duì)靠近，則這些顆粒的熒光可能會(huì)影響對(duì)彼此特性的評(píng)估。因此，不能準(zhǔn)確地確定顆粒的數(shù)據(jù)。在某些情況下，如果判定不能準(zhǔn)確評(píng)估所包含顆粒的特性，則像素集合可能被拒絕(例如從任何進(jìn)一步成像處理中排除)。以下參照?qǐng)D3的框70-78更詳細(xì)地描述確定是接受還是拒絕對(duì)像素集合進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理的示例性方式。一般而言，可以通過(guò)許多不同方式進(jìn)行在框62所示的用于確定多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素內(nèi)的位置。在圖3的框64、66和68 (框64、66和68通過(guò)虛線(xiàn)從框62延伸，并由虛線(xiàn)作為邊界，這表明這些過(guò)程是示例性的)示出某些示例性方法。如圖3所示，框64簡(jiǎn)述用于確定多組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素中各自呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的峰值像素的過(guò)程。在這一過(guò)程中，可對(duì)每組像素進(jìn)行迭代，以確定在該組像素內(nèi)對(duì)每個(gè)像素測(cè)量的熒光值是否具有最大值。具有最大值的像 素可被確定為“峰值像素”。在某些情況下，可以將峰值像素的中心部分指定為該位置。在這種情況下，可以通過(guò)框64所示過(guò)程簡(jiǎn)單地執(zhí)行框62所示的位置確定過(guò)程。然而，在某些實(shí)施方式中，判定峰值像素的可選部分是否更適于呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置是有益的。作為實(shí)例，在圖像的像素中，顆粒可能未被理想對(duì)齊，由此來(lái)自顆粒的能量可能未在一組所標(biāo)識(shí)的像素中平均分布。在這一情形中，峰值像素的中心部分可能不代表顆粒的最大熒光測(cè)量值，因此，判定峰值像素的偏心部分是否更好地代表顆粒的最大熒光測(cè)量是有益的。在這一情形中，該方法可以進(jìn)行到框66，以計(jì)算至少一組一個(gè)或多個(gè)所標(biāo)識(shí)像素中呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的質(zhì)心位置。具體地，該方法可以包括對(duì)靠近峰值像素的及其預(yù)定半徑之內(nèi)的像素的熒光測(cè)量值進(jìn)行積分。距峰值像素的示例性半徑可從ι- ο個(gè)像素的范圍內(nèi)選擇，但是可以考慮其它半徑。注意，在預(yù)定半徑涵蓋未被標(biāo)識(shí)為具有預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)的像素的實(shí)施方式中，可從該積分中減去全部這些“背景像素”的背景信號(hào)。在某些情況下，對(duì)是否將計(jì)算出的質(zhì)心位置指派為呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置進(jìn)行分析是有益的。這樣，在某些實(shí)施方式中，該方法可取決于計(jì)算出的質(zhì)心位置的特性而進(jìn)行到框68。例如，如果質(zhì)心位置在任何方向上大于像素寬度的一半，則可將向下一整數(shù)值上舍入的所計(jì)算位置(例如在X和y坐標(biāo)上)指派為呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的位置。雖然框68將所計(jì)算質(zhì)心位置的尺寸閾值指定為大于像素尺寸的50%以指派質(zhì)心位置，但是偶然過(guò)程卻沒(méi)有必要如此受限。具體而言，可以使用質(zhì)心位置的任何尺寸閾值(包括與像素尺寸無(wú)關(guān)的那些)來(lái)判定是否指派質(zhì)心位置。確定呈現(xiàn)光學(xué)參數(shù)最大值的過(guò)程之后，該方法可以進(jìn)行到接受和拒絕對(duì)像素進(jìn)行進(jìn)一步處理的過(guò)程。例如，在某些實(shí)施方式中，該方法可以進(jìn)行到框70，其中計(jì)算兩個(gè)峰值像素之間的距離。峰值像素的標(biāo)識(shí)一般可以通過(guò)以上參照框64所述的過(guò)程來(lái)執(zhí)行，因此，圖3的流程圖包括虛線(xiàn)連接的框64和70以表明該相關(guān)?；诳?0中計(jì)算出的距離，可以接受或拒絕對(duì)與兩個(gè)峰值像素之一對(duì)應(yīng)的一組像素進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理，如框72所示。例如，如果峰值像素之間的距離小于(和/或等于)預(yù)定閾值，諸如但不限于與一個(gè)或兩個(gè)成像顆粒的投影直徑或其間的任何距離等效的閾值，則可以拒絕對(duì)與兩個(gè)峰值像素之一對(duì)應(yīng)的一組像素進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理。以這種方式，可以避開(kāi)與感興趣顆粒靠得過(guò)近的顆粒的熒光發(fā)射，該熒光發(fā)射可能會(huì)妨礙對(duì)感興趣顆粒進(jìn)行評(píng)估。一般而言，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“成像顆粒的投影直徑”可以是指基于用于對(duì)顆粒成像的系統(tǒng)的組件配置對(duì)成像顆粒估計(jì)的直徑。一般而言，成像顆粒的大小可以與實(shí)際顆粒的尺寸不同，這取決于用于對(duì)顆粒成像的成像系統(tǒng)的放大倍率。此外，成像系統(tǒng)的其它組件配置也可能影響該直徑。例如，缺陷透鏡、光學(xué)孔徑的衍射、光學(xué)濾波器失真、以及成像系統(tǒng)的若干其它組件可能影響成像像素的尺寸并在某些情形中使其失真(本文中稱(chēng)為成像顆粒的拖影)。在某些情況下，成像透鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)(或者量化為調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF))可能是失真的主要因素。雖然可以拒絕與兩個(gè)峰值像素對(duì)應(yīng)的任一組像素，但是拒絕與具有較低熒光測(cè)量值的峰值像素對(duì)應(yīng)的那組像素是有益的，因?yàn)樵谶M(jìn)一步的圖像處理過(guò)程中，這一組像素的特性可能比另一組像素更不易辨識(shí)。在某些情況下，該方法可以進(jìn)行到評(píng)估剩余一組像素以判定它是否足以進(jìn)行進(jìn)一步圖像處理。例如，該方法可以進(jìn)行到框70，以判定該組像素中光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率是表示單個(gè)顆粒還是顆粒團(tuán)。通常，由于難以對(duì)每個(gè)顆粒獲得準(zhǔn)確和不同的信息，因此需要拒絕顆粒團(tuán)。在其它實(shí)施方式中，可以通過(guò)計(jì)算兩組像素中光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率來(lái)在框72中確定對(duì)要拒絕的兩組像素的選擇。特別地，在判定峰值像素之間的距離小于預(yù)定閾值時(shí)，可對(duì)每組像素計(jì)算光學(xué)參數(shù)強(qiáng)度變化率，作為應(yīng)該拒絕哪一組的指標(biāo)?？?6-78和80-82中分別示出計(jì)算一組像素中強(qiáng)度變化率的不同方式，并在以下更詳細(xì)地描述。由于顆粒拒絕的方法可以包括框72和74的組合或依次處理，圖3的流程圖包括框72和74之間的虛線(xiàn)以表明在相應(yīng)過(guò)程之間這一連接的可能性。然而，這一連接是可任選的。特別地，在某些實(shí)施方式中，框72和74可以不結(jié)合執(zhí)行，因此框72和74之間的箭頭可以省略。在其它實(shí)施方式中，框74和72的處理可以反向，并且如果如此，則本文所述的方法可以包括框78和/或82與框70之間的連接。在其它實(shí)施方式中，可從該方法中略去框70和72。或者可從該方法中略去框74(以及其用于執(zhí)行在框76-82所示過(guò)程的示例性程序)。在其它情況下，該方法可被配置成在框62之后對(duì)圖象處理的路徑進(jìn)行選擇，并因此可通向框70和74中的任一個(gè)，如圖3所示。參照框74，可以計(jì)算圍繞在框62確定的位置中至少一個(gè)的多個(gè)像素中的光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率。如上所述，該變化率可用于接受或拒絕對(duì)顆粒進(jìn)行進(jìn)一步圖像數(shù)據(jù)處理。更加具體地，該變化率可以是顆粒發(fā)射特性的空間梯度(即熒光發(fā)射水平的分布)的量度，并且該空間梯度可用于確定感興趣的顆粒與相鄰顆粒的隔離程度。在某些實(shí)施方式中，框74的過(guò)程之后可以是框76和78所示的步驟序列。特別地，該方法可以包括對(duì)圍繞框62中確定的位置的預(yù)定半徑內(nèi)排列的一組像素計(jì)算光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率。在某些實(shí)施方式中，預(yù)定半徑可大致等于由所確定位置表示的顆粒的投影直徑。在其它情況下，預(yù)定半徑可以大于或小于由所確定位置表示的成像顆粒的投影直徑。在計(jì)算光學(xué)參數(shù)的強(qiáng)度變化率之后，該方法可進(jìn)行到框78，其中可以通過(guò)將強(qiáng)度變化率與預(yù)定閾值進(jìn)行比較來(lái)接受或拒絕對(duì)該組顆粒進(jìn)行進(jìn)一步圖像數(shù)據(jù)處理。在某些實(shí)施方式中，框78可以包括在計(jì)算強(qiáng)度變化率大于或等于預(yù)定閾值時(shí)接受該組像素進(jìn)行進(jìn)一步處理。特別地，光學(xué)參數(shù)相對(duì)較高的強(qiáng) 度變化率可以表示該組像素內(nèi)的單個(gè)顆粒，這是進(jìn)一步圖像處理所需要的。除了這一過(guò)程之外，框78可以包括在計(jì)算強(qiáng)度變化率小于預(yù)定閾值時(shí)拒絕對(duì)該組像素進(jìn)行進(jìn)一步處理。特別地，光學(xué)參數(shù)相對(duì)較低的強(qiáng)度變化率表示該組像素內(nèi)的顆粒團(tuán)，如上所述，這是進(jìn)一步圖像處理不需要的。在圖3的框80和82示出計(jì)算一組像素內(nèi)光學(xué)參數(shù)強(qiáng)度變化率的替換方式。特別地，除此之外或作為替代，該方法可以被路由到框80，以對(duì)分別排列在圍繞框62中確定的位置之一的不同預(yù)定半徑內(nèi)的兩組不同像素的光學(xué)參數(shù)值求和。注意，可將這些半徑調(diào)節(jié)成與顆粒在檢測(cè)器像素陣列上的擴(kuò)散有最佳匹配，這種擴(kuò)散通?；诔上裢哥R的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)(或者量化為調(diào)制傳遞函數(shù)(MTF))、顆粒相對(duì)于成像系統(tǒng)焦平面的位置以及顆粒自身大小而發(fā)生變化。例如，在某些實(shí)施方式中，一個(gè)預(yù)定半徑大致等于圖像內(nèi)單個(gè)顆粒的投影直徑而另一個(gè)預(yù)定直徑是圖像內(nèi)單個(gè)顆粒的投影直徑的約I. 5倍是有益的。然而，也可以使用其它半徑，并且可以使用不同的半徑比值。還應(yīng)該注意，如果從一個(gè)半徑內(nèi)的像素減去背景信號(hào)的值，則也可以將背景信號(hào)從其它半徑內(nèi)的像素值中減去。
對(duì)光學(xué)參數(shù)值求和之后，可以計(jì)算對(duì)應(yīng)于半徑的每一個(gè)的求和值的比值。特別地，使用較小半徑獲得的求和值可以除以用較大半徑獲得的求和值，或者反之。在任一情形中，該比值都可用于接受或拒絕對(duì)該組像素進(jìn)行進(jìn)一步圖像數(shù)據(jù)處理，如框82所示。特別地，框82可以包括在確定比值與設(shè)定值相差小于或等于預(yù)定閾值的量時(shí)接受該組像素以進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。此外，框83可以包括在確定比值與設(shè)定值相差大于預(yù)定閾值的量時(shí)拒絕對(duì)該組像素進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。對(duì)閾值的確定可以基于各種因素，包括但不限于選擇用來(lái)執(zhí)行框80所示過(guò)程的半徑、要成像顆粒的大小、圖像內(nèi)顆粒的拖影、以及所用成像系統(tǒng)的設(shè)置。因此，在不同應(yīng)用中，在框83中用于接受和拒絕一組像素的預(yù)定閾值可以有很大變化。然而，一般準(zhǔn)則是更接近單位值的比值可能表示進(jìn)一步處理所需的一組像素，因?yàn)閬?lái)自更小半徑之外的像素的貢獻(xiàn)很少。換言之，來(lái)自相鄰顆粒的光學(xué)參數(shù)值的影響很可能是最小，因而，感興趣的光學(xué)參數(shù)值的誤差相對(duì)較小?；蛘?，如果該比值大大小于單位值，則相鄰明亮顆粒有可能影響感興趣顆粒的光學(xué)參數(shù)值。在這種實(shí)例中，感興趣的顆?？赡鼙粊G棄，或者積分半徑可能被不恰當(dāng)?shù)剡x擇。以這種方式，在丟棄感興趣顆粒的圖像數(shù)據(jù)之前，可用不同半徑執(zhí)行上述積分。用于執(zhí)行這一附加積分的算法可以包括對(duì)每個(gè)小珠以某一固定比例(諸如I. 5x)建立內(nèi)徑和外徑并存儲(chǔ)該結(jié)果。在這些情形中，內(nèi)徑可以稍大于期望的小珠投影，諸如是比期望的小珠投影大I. 5倍。然后，對(duì)于每個(gè)小珠，可以稍稍減小內(nèi)徑和外徑(保持如上相同的比值)。隨后，可對(duì)比值集合進(jìn)行比較以查看大多數(shù)比值是否已經(jīng)改變。如果大多數(shù)比值并未改變，則內(nèi)徑仍然過(guò)大，并且在內(nèi)圈外到外圈中(仍)沒(méi)有獲得能量，所以對(duì)每個(gè)小珠，仍然需要再次減小內(nèi)徑和外徑。相反，如果某些比值已經(jīng)改變，則表示某些能量可能正向外圈移動(dòng)。基于來(lái)自上一直徑的比值集合的變化分布，可將該過(guò)程迭代數(shù)次。例如，如果重合顆粒的百分比(隨后應(yīng)該被丟棄)已知，則將該百分比等于比值的期望百分比，以結(jié)束該迭代?？梢栽谙律a(chǎn)線(xiàn)之后從根據(jù)先前數(shù)據(jù)系統(tǒng)通常如何表現(xiàn)的認(rèn)知中，或者從測(cè)試圖像的視覺(jué)檢查中來(lái)導(dǎo)出對(duì)重合顆粒的百分比的估算。如果重合顆粒的百分比未知，則新出現(xiàn)百分比隨著內(nèi)徑減小而變化然后保持恒定的逐步變化“歷史”可以是結(jié)束迭代的指示。作為示例，一次減小給定5%的比值變化，然后是10%，再是10%，第四次是12%。在該示例中10%可能是應(yīng)該丟棄的顆粒數(shù)量。當(dāng)達(dá)到百分比12%時(shí)，內(nèi)圈過(guò)小，截除了更小的單個(gè)好小珠。這樣，先前直徑應(yīng)該用作截止點(diǎn)。可以用不同的內(nèi)徑/外徑比值重復(fù)全部這些過(guò)程步驟，以查看是否出現(xiàn)百分比變化的更清晰趨勢(shì)。在這些情形中，該過(guò)程可包括在算法中的“外循環(huán)”，其中首先以過(guò)較大比值開(kāi)始，然后步進(jìn)掃描比值直到實(shí)際上比原始比值更小(可任選地跳過(guò)原始比值，因?yàn)樗驯挥?jì)算過(guò))。如上所述，本文所述的圖像數(shù)據(jù)處理方法可以包括圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。在某些實(shí)施方式中，本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可在確定圖像內(nèi)背景信號(hào)水平之后進(jìn)行和/或在圖像內(nèi)發(fā)現(xiàn)顆粒之后進(jìn)行。在某些情況下，圖像內(nèi)對(duì)準(zhǔn)過(guò)程特別地可在參照?qǐng)D2所述的背景信號(hào)測(cè)量方法之后進(jìn)行，和/或在參照?qǐng)D3所述的顆粒發(fā)現(xiàn)方法之后進(jìn)行。然而，在其它實(shí)施方式中，本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可以獨(dú)立于背景信號(hào)測(cè)量和/或顆粒發(fā)現(xiàn)過(guò)程而進(jìn)行。在任一種情況中，可以在組裝設(shè)備之后在工廠(chǎng)中進(jìn)行圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。除此之外或作為替代，圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可以在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，尤其是在從工廠(chǎng)運(yùn)出之后系統(tǒng)部件有變化的情況下。
一般而言，如果使用各自如上所述地耦合到濾光器的兩個(gè)或更多檢測(cè)器獲取顆粒的多個(gè)圖像，或者如果在使用單個(gè)相機(jī)拍攝的圖像之間替換可互換濾光器，則可以進(jìn)行圖像間對(duì)準(zhǔn)，因?yàn)闉V光器自身可能影響圖像。多個(gè)圖像通常是在不同波長(zhǎng)下取得的，使得不同水平的熒光被測(cè)量并用于對(duì)顆粒歸類(lèi)。然而，由于成像子系統(tǒng)硬件的機(jī)械公差，與多個(gè)圖像的每一個(gè)中的顆粒相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)在多個(gè)圖像合成期間可能沒(méi)有絕對(duì)對(duì)準(zhǔn)。這種斑點(diǎn)的失配準(zhǔn)可能不利地制約對(duì)顆粒在所有成像通道中的位置進(jìn)行關(guān)聯(lián)的能力。然而，可以使用本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)更改圖像與圖像的配準(zhǔn)，以更好地將斑點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)。如下所述，圖像間對(duì)準(zhǔn)校正過(guò)程可以是圖像坐標(biāo)在X和/或y方向上的簡(jiǎn)單平移。除此之外或作為替代，圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程可以包括旋轉(zhuǎn)多個(gè)圖像中的一個(gè)或多個(gè)。圖4示出描繪圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程的示例性步驟序列的流程圖。如圖4的框90所示，該過(guò)程可以包括獲取具有與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒的多個(gè)圖像的數(shù)據(jù)，其中多個(gè)圖像的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于不同波長(zhǎng)帶。在某些情況下，該數(shù)據(jù)可直接從成像系統(tǒng)獲取，但是在其它情況下，該數(shù)據(jù)可從存儲(chǔ)介質(zhì)獲取。在任一情況下，該數(shù)據(jù)可以表示在不同波長(zhǎng)下取得的多個(gè)圖像，如上所述?？梢允褂玫氖纠圆ㄩL(zhǎng)可以對(duì)應(yīng)于不同色彩通道，諸如但不限于，歸類(lèi)通道I的紅色、歸類(lèi)通道2的綠色、指示通道的藍(lán)色。如上進(jìn)一步描述，為了適應(yīng)每個(gè)色彩通道，用于本文所述方法的顆?？杀惶囟ǖ厝旧栽诟信d趣的所有波長(zhǎng)或所有波長(zhǎng)帶下發(fā)光。特別地，為了測(cè)量多個(gè)圖像內(nèi)的歸類(lèi)和指示信號(hào)兩者，可以使用不僅發(fā)射歸類(lèi)波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的熒光而且發(fā)射指示波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶的熒光的特定染色顆粒，來(lái)執(zhí)行本文所述的圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。在已獲取了多個(gè)圖像的數(shù)據(jù)之后，該方法可進(jìn)行到框92，其中創(chuàng)建多個(gè)圖像的合成圖像。一般而言，合成圖像是多個(gè)圖像相對(duì)彼此重疊的單個(gè)圖像。如上所述，由于成像子系統(tǒng)硬件的機(jī)械公差，與多個(gè)圖像的每一個(gè)內(nèi)的顆粒對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)在多個(gè)圖像的合成中可能并沒(méi)有絕對(duì)對(duì)準(zhǔn)。這樣，可能需要圖像間對(duì)準(zhǔn)。特別地，該方法可以包括操縱多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)，使得與多個(gè)圖像的每一個(gè)內(nèi)顆粒對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)在隨后的合成圖像內(nèi)會(huì)聚，如框94所示。在某些實(shí)施方式中，除了一個(gè)(本文中稱(chēng)為“參考圖像”)之外的所有多個(gè)圖像的坐標(biāo)值都可被操縱?；蛘撸俚亩鄠€(gè)圖像的坐標(biāo)值可被操縱。以這種方式，參考圖像之外的圖像的坐標(biāo)值可保持用于圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程。在某些情況下，可將在由指示染料發(fā)射的光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶下獲取的圖像被指定為參考圖像。在其它實(shí)施方式中，可將在由歸類(lèi)染料發(fā)射的光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶下獲取的圖像指定為參考圖像。
如上所述和如圖4所示，在某些情況下，對(duì)坐標(biāo)的操縱包括圖像坐標(biāo)在X和/或y方向上的垂直偏移，如框96所示。除此之外或作為替代，坐標(biāo)的操縱可以包括旋轉(zhuǎn)多個(gè)圖像的一個(gè)或多個(gè)，如框98所示?？?6和98的輪廓為虛線(xiàn)，表示可以使用這些過(guò)程的任一個(gè)或兩者來(lái)操縱圖像坐標(biāo)。在垂直平移的過(guò)程中，可確定在X或y方向上的正或負(fù)整數(shù)平移偏移量以操縱坐標(biāo)值?？蓪⑾鄳?yīng)的偏移量添加到一個(gè)或多個(gè)非參考圖像的坐標(biāo)，并且可使用多個(gè)圖像來(lái)創(chuàng)建新的合成圖像，其中某些圖像具有新坐標(biāo)。一般而言，可以一直執(zhí)行垂直平移校正步驟，直到在合成圖像內(nèi)的對(duì)準(zhǔn)不再可能有進(jìn)一步改進(jìn)。在確定不可獲得通過(guò)垂直平移的進(jìn)一步改進(jìn)時(shí)，可以保存具有通過(guò)該過(guò)程操縱的 坐標(biāo)的每個(gè)非參考圖像的X平移和y平移值，用于隨后的顆粒成像。諸如表格的任何適當(dāng)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可適用于這些值。如上所述，除此之外或作為替代，坐標(biāo)值的操縱包括旋轉(zhuǎn)一個(gè)或多個(gè)非參考圖像的坐標(biāo)。在某些實(shí)施方式中，如果經(jīng)由平移校正并未使圖像充分對(duì)齊，則可以采用旋轉(zhuǎn)過(guò)程。在其它實(shí)施方式中，可在垂直平移過(guò)程之前、取代平移過(guò)程、或與之交替地執(zhí)行旋轉(zhuǎn)過(guò)程。在其它情況下，旋轉(zhuǎn)過(guò)程可與垂直平移過(guò)程并發(fā)地進(jìn)行。特別地，對(duì)于圖像坐標(biāo)操縱，可以旋轉(zhuǎn)一個(gè)或多個(gè)非參考圖像，并且可以將一個(gè)或多個(gè)其它非參考圖像平移垂直偏移量。在其它實(shí)施方式中，可以對(duì)單個(gè)非參考圖像的坐標(biāo)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)和垂直偏移。在任一情形中，在某些實(shí)施方式中，可用于圖像間對(duì)準(zhǔn)過(guò)程的垂直偏移范圍可以是+/-10像素，并且旋轉(zhuǎn)偏移范圍可以是+/-2度。然而，更大或更小的偏移量可用于操縱坐標(biāo)的任一或兩種方式。不管圖像旋轉(zhuǎn)相對(duì)于圖像坐標(biāo)的垂直偏移的結(jié)合方式如何，旋轉(zhuǎn)過(guò)程通常可包括將原點(diǎn)(即旋轉(zhuǎn)中心)選擇在圖像的X和y尺寸的中點(diǎn)附近(標(biāo)為XgM ygA)?？墒褂门c源圖像(即要旋轉(zhuǎn)的非參考圖像)相同的尺寸來(lái)創(chuàng)建新的空白圖像緩沖區(qū)。對(duì)于源圖像中的每個(gè)像素，可以確定來(lái)自旋轉(zhuǎn)中心的當(dāng)前矢量。特別地，從感興趣像素到圖像旋轉(zhuǎn)中心的距離可由
的平方根確定，X和y是該像素的坐標(biāo)。此外，根據(jù)y距s除以&_的反正切并且向反正切值加上或從其減去象限相關(guān)的修改量以調(diào)節(jié)每個(gè)象限的角度，可以確定當(dāng)前矢量的角度。在這些情形中，是在ygg與感興趣像素之間沿y軸的距離，而Xsw是在X gA與感興趣像素之間沿X軸的距離。在上述計(jì)算之后，可將用戶(hù)定義的恒定“調(diào)節(jié)”角加到當(dāng)前像素的矢量以確定像素的旋轉(zhuǎn)角?？赏ㄟ^(guò)以下等式確定像素的新位置(例如X和y坐標(biāo))新X坐標(biāo)=[(x-x )2+ (y-y )2]的平方根*cos (旋轉(zhuǎn)角)+x原點(diǎn)+x平移(如果可應(yīng)用)+0.5(I)新y坐標(biāo)=[(x-x原點(diǎn))2+(y-y原點(diǎn))2]的平方根*sin (旋轉(zhuǎn)角)+y原點(diǎn)+y平移(如果可應(yīng)用)+0.5(2)在新的X和y坐標(biāo)下可將所考慮像素值拷貝到空白圖像緩沖區(qū)的像素中。在處理了要旋轉(zhuǎn)的非參考圖像之后，可以重新創(chuàng)建新的合成偽彩色圖像。一般而言，以上對(duì)旋轉(zhuǎn)過(guò)程列出的步驟可以重復(fù)，以使每個(gè)非參考圖像上的色彩變化最小化?？刹捎弥T如調(diào)節(jié)表的合適數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)對(duì)每個(gè)非參考圖像存儲(chǔ)最終的旋轉(zhuǎn)值，用于后續(xù)成像。一般而言，可參考多個(gè)不同參數(shù)來(lái)進(jìn)行以上參照框94描述的坐標(biāo)操縱的迭代。作為實(shí)例，坐標(biāo)操縱的迭代可以取決于合成圖像斑點(diǎn)之間色彩變化量、與合成圖像斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的像素之間強(qiáng)度的集合誤差或均方差、和/或合成圖像內(nèi)斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差。每種技術(shù)的概要在圖4的框100-128中列出并在以下詳細(xì)描述。特別地，框100包括如下過(guò)程算術(shù)上確定(即通過(guò)一算法)偏移以修改多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)，使得下一合成圖像中斑點(diǎn)之間的色彩變化量相對(duì)于前一合成圖像減小。合成圖像的色彩變化通常是由多個(gè)圖像中至少一個(gè)的失準(zhǔn)而引起的。例如，在對(duì)相應(yīng)多個(gè)圖像使用紅色、綠色和藍(lán)色通道的實(shí)施方式中，期望對(duì)應(yīng)于合成圖像中顆粒的斑點(diǎn)的會(huì)聚色彩是白色。然而，多個(gè)圖像的對(duì)準(zhǔn)變動(dòng)可能導(dǎo)致各個(gè)圖像上與紅色、綠色和藍(lán)色通道對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)相對(duì)彼此偏移。因此，合成圖像中的各個(gè)色彩可能會(huì)延伸超出白斑的邊界，從而在此斑點(diǎn)處引起色彩變動(dòng)。注意，合成圖像中白斑的形成是對(duì)由紅色、綠色和藍(lán)色通道產(chǎn)生的圖像進(jìn)行組合的結(jié)果，但是本文所述的方法并非必然被限制在使用這些通道來(lái)制作圖像。特別地，可通過(guò)若干不同色彩的通道來(lái)形成任意數(shù)量的多個(gè)圖像，因此，本文所述的方法并不限于形成三個(gè)圖像或者紅色、綠色和藍(lán)色的色彩通道。如上所述以及如圖4的框102所示，圖像的失準(zhǔn)可通過(guò)將多個(gè)圖像中一個(gè)或多個(gè)的坐標(biāo)調(diào)節(jié)預(yù)定偏移來(lái)減小。這些預(yù)定偏移可包括以上參照框96和98所述垂直偏移和/或旋轉(zhuǎn)偏移。在框102之后，可以創(chuàng)建包括預(yù)定偏移的多個(gè)圖像的不同合成圖像，如框104所示。該方法可以進(jìn)行到框106，其中確定新近創(chuàng)建的合成圖像中斑點(diǎn)之中的色彩變化。如 判定框108所示，在色彩變化大于(和/或等于)特定偏移量的預(yù)定容許誤差的實(shí)施方式中，可以重復(fù)框100-106。相反，在色彩變化小于(和/或等于)預(yù)定容許誤差的實(shí)施方式中，圖像間對(duì)準(zhǔn)的方法可在框110結(jié)束。一般而言，對(duì)框108設(shè)定的預(yù)定容許誤差可取決于合成圖像所需的準(zhǔn)確度以及偏移量，因此可隨應(yīng)用而變化。參照?qǐng)D4中的框112-128描述基于合成圖像內(nèi)像素強(qiáng)度和/或斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差的坐標(biāo)操縱的迭代技術(shù)。特別地，兩種技術(shù)都可在框112開(kāi)始，在此將i設(shè)定為I。這一指定用于引用若干預(yù)定偏移的第一個(gè)來(lái)調(diào)節(jié)多個(gè)圖像中至少一個(gè)的坐標(biāo)，如框114所示。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)迭代該過(guò)程的預(yù)定偏移的選擇可特定于測(cè)量合成圖像中對(duì)準(zhǔn)的參數(shù)(即合成圖像內(nèi)像素強(qiáng)度或斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差)。在其它實(shí)施方式中，預(yù)定偏移的選擇可與所使用的技術(shù)無(wú)關(guān)。在任一情形中，該過(guò)程可進(jìn)行到框116，以創(chuàng)建包括預(yù)定偏移的多個(gè)圖像的不同合成圖像。之后，可以采用對(duì)這些技術(shù)專(zhuān)用的過(guò)程。例如，該方法可以進(jìn)行到框118來(lái)確定在框116創(chuàng)建的合成圖像的像素之間強(qiáng)度的集合誤差或均方差。或者，該方法可以進(jìn)行到框120，以確定在框116中創(chuàng)建的合成圖像內(nèi)斑點(diǎn)位置的集合誤差或平均方差。在任一情形中，隨后可在框122對(duì)i是否等于η進(jìn)行判定，η是調(diào)節(jié)多個(gè)圖像的坐標(biāo)的預(yù)定偏移的數(shù)量。在i不等于η的情形中，該方法可以進(jìn)行到框124，以將i的值增一，并重復(fù)在框114-120列出的過(guò)程。在判定i等于η時(shí)，該方法可以進(jìn)行到框126，其中對(duì)不同合成圖像的每一個(gè)的集合誤差或均方差的計(jì)算值進(jìn)行評(píng)估。特別地，可以對(duì)不同合成圖像的每一個(gè)的集合誤差或均方差的計(jì)算值進(jìn)行評(píng)估，以標(biāo)識(shí)使合成圖像獲得最小誤差的偏移(即平移和/或旋轉(zhuǎn))值?？梢詫?duì)坐標(biāo)被調(diào)節(jié)的每個(gè)非參考圖像保存所標(biāo)識(shí)的偏移值，如框128所示。諸如表格的任何適當(dāng)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可以適用于這些值。在上述兩個(gè)實(shí)施方式中，可將所標(biāo)識(shí)的偏移值應(yīng)用到在后續(xù)成像期間創(chuàng)建的歸類(lèi)圖像的坐標(biāo)系。特別地，可以使用上述等式將歸類(lèi)圖像直接平移和/或旋轉(zhuǎn)到新的圖像緩沖區(qū)，然后可以將原始?xì)w類(lèi)圖像緩沖區(qū)丟棄。
可以在對(duì)齊圖像坐標(biāo)系之后執(zhí)行圖像間顆粒關(guān)聯(lián)。特別地，假設(shè)在一個(gè)以上的波長(zhǎng)或波長(zhǎng)帶下獲取了一個(gè)以上的歸類(lèi)圖像，則在對(duì)準(zhǔn)圖像坐標(biāo)系之后，可根據(jù)位置來(lái)丟棄實(shí)際顆粒。簡(jiǎn)而言之，如果顆粒并不存在于所有歸類(lèi)圖像上，則可將其從進(jìn)一步處理中去除。
在一示例中，使用先前使用上述顆粒發(fā)現(xiàn)方法標(biāo)識(shí)的每個(gè)歸類(lèi)圖像的顆粒集合以及每個(gè)歸類(lèi)圖像的平移/旋轉(zhuǎn)值，可以標(biāo)識(shí)位于給定半徑內(nèi)的最佳匹配顆粒。標(biāo)識(shí)最佳匹配顆粒可以包括創(chuàng)建一個(gè)η個(gè)循環(huán)的嵌套系列，用于遍歷每個(gè)顆粒集合迭代，其中該循環(huán)嵌套系列的每個(gè)層次表示一歸類(lèi)圖像。在最深的嵌套層次，該方法可以包括判定來(lái)自所有外循環(huán)的顆粒的已調(diào)節(jié)坐標(biāo)是否位于給定半徑內(nèi)。可以在確定距離之前根據(jù)以上針對(duì)圖像間對(duì)準(zhǔn)描述的對(duì)準(zhǔn)表和等式來(lái)平移每個(gè)嵌套層次的坐標(biāo)。如果該距離小于給定半徑，則最內(nèi)層循環(huán)的顆粒位置可被暫時(shí)存儲(chǔ)，以供隨后與最內(nèi)層的其它匹配進(jìn)行比較。如果最內(nèi)層中第二顆粒的距離小于先前所找到顆粒的距離，則暫時(shí)存儲(chǔ)的顆粒位置被當(dāng)前距離代替。如果為否，則該方法可以對(duì)下一顆粒繼續(xù)。在來(lái)自最外層循環(huán)的第二顆粒迭代結(jié)束處，可以將與最外位置的最佳匹配的暫時(shí)位置存儲(chǔ)到一集合中。如果在外循環(huán)顆粒的給定半徑內(nèi)沒(méi)有匹配，則自動(dòng)將該顆粒的實(shí)例從進(jìn)一步考慮中刪除，從而關(guān)聯(lián)算法的輸出是如上創(chuàng)建的
集合。為了加速整個(gè)過(guò)程，如果存在如上標(biāo)識(shí)的匹配，則可在每個(gè)后續(xù)循環(huán)中將該顆粒表示為“已使用”，這樣不必將處理時(shí)間花在再次對(duì)其進(jìn)行考慮。也可以將圖像分成多個(gè)分區(qū)，對(duì)每個(gè)分區(qū)進(jìn)行分開(kāi)關(guān)聯(lián)以減少處理時(shí)間。在這一實(shí)例中，分區(qū)的數(shù)量較佳地被選擇成在將圖像分解成區(qū)域時(shí)不會(huì)損失循環(huán)迭代的總體省時(shí)。此外，為了避免失去分區(qū)邊界處的比較能力，這些區(qū)域可以稍稍重疊。此外，如果這些區(qū)域重疊，則區(qū)域重疊程度可被選擇成減小重復(fù)重疊處顆粒的可能性。該方法還可以包括指示熒光發(fā)射的熒光積分。由于指示發(fā)射水平不恒定并且未知，不可能或者沒(méi)有必要使用歸類(lèi)圖像所采用的顆粒發(fā)現(xiàn)技術(shù)來(lái)在指示圖像中標(biāo)識(shí)用于積分的像素。相反，可以使用在歸類(lèi)圖像中所找到顆粒的相同X和y坐標(biāo)下的熒光。在一個(gè)這種示例中，使用來(lái)自由圖像間關(guān)聯(lián)確定的調(diào)節(jié)表的平移和旋轉(zhuǎn)值，可將每個(gè)所發(fā)現(xiàn)的顆粒映射到指示圖像的適當(dāng)坐標(biāo)。對(duì)于每個(gè)顆粒的起始位置，可以使用來(lái)自未調(diào)節(jié)參考?xì)w類(lèi)圖像的坐標(biāo)系。對(duì)指示確定的平移X、y值和旋轉(zhuǎn)角表示指示圖像中成像顆?？梢苿?dòng)由此與歸類(lèi)參考圖像中的顆粒位置重合的方向。然而，在此進(jìn)行的變換涉及將參考坐標(biāo)系平移到指示坐標(biāo)系?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單地將每個(gè)調(diào)節(jié)參數(shù)的符號(hào)反轉(zhuǎn)(負(fù)值變成正值，反之亦然)，將X和y的平移值“轉(zhuǎn)換”。類(lèi)似地，在找到指示坐標(biāo)之前，也可將旋轉(zhuǎn)角的符號(hào)反轉(zhuǎn)。在將所有參數(shù)的符號(hào)反轉(zhuǎn)之后，以上對(duì)圖像間對(duì)準(zhǔn)步驟描述的方程可用于標(biāo)識(shí)積分的中心。位于給定積分半徑內(nèi)的所有指示像素的積分可被確定。如上所述，本文所述的圖像數(shù)據(jù)處理方法可以包括圖像平面歸一化過(guò)程。理想地，對(duì)成像系統(tǒng)進(jìn)行均勻照射，以防止顆粒之間依賴(lài)于位置的發(fā)射變化。然而，實(shí)際上，成像場(chǎng)中的每個(gè)斑點(diǎn)具有給定的照射水平。此外，在系統(tǒng)內(nèi)使用的熒光帶通濾波器和一個(gè)或多個(gè)成像透鏡可能不會(huì)對(duì)圖像中所有點(diǎn)透射等量的光。為了補(bǔ)償圖像上的這些差異，可將歸一化方法或算法應(yīng)用到光學(xué)參數(shù)的測(cè)量值。在某些實(shí)施方式中，本文所述的圖像平面歸一化過(guò)程可在以上描述的過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)之后進(jìn)行，尤其是相關(guān)于參照?qǐng)D2-4描述的那些過(guò)程。然而，在其它實(shí)施方式中，本文所述的圖像平面歸一化可獨(dú)立于這些過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)來(lái)進(jìn)行。圖5示出描繪圖像平面歸一化過(guò)程的示例性步驟序列的流程圖。如圖5的框130所示，該過(guò)程可包括分析對(duì)具有均勻濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的第一組顆粒取得的第一組圖像，以在第一組圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。該第一組圖像可包括任何數(shù)量的圖像，包括單個(gè)圖像或多個(gè)圖像。在取得多個(gè)圖像的實(shí)施方式中，使用不同波長(zhǎng)的照射源來(lái)形成第一組圖像，這些不同波長(zhǎng)諸如但不限于對(duì)應(yīng)于紅色、綠色和藍(lán)色通道的波長(zhǎng)。在某些情況下，該方法可任選地(由虛線(xiàn)框表示)包括框132，其中分析對(duì)具有均勻濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的不同第二組顆粒取得的第二組圖像，以在第二組圖像中標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。與第一組圖像一樣，第二組圖像可包括任何數(shù)量的圖像，并且在取得多個(gè)圖像的情形中，可使用不同波長(zhǎng)的照射源形成多個(gè)圖像。在某些實(shí)施方式中，分析對(duì)濃度已知的不同組顆粒獲得的第二組圖像對(duì)減小隨后為第一和第二組圖像的相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量中的噪聲和顆粒不均勻的影響是有益的。特別地，通過(guò)如以下參照框140描述的對(duì)第一和第二組圖像的相應(yīng)分區(qū)的每一個(gè)測(cè)量的光學(xué)參數(shù)值取平均值，可以降低噪聲和顆粒不均勻的影響。不管該方法是否包括分析第二組圖像，該方法可進(jìn)行到框134以在第一組圖像以及在某些情形中的第二組圖像的相應(yīng)分區(qū)內(nèi)，對(duì)參照框130和132描述的過(guò)程中標(biāo)識(shí)的像素集合進(jìn)行歸類(lèi)。特別地，可以將多組圖像分成分區(qū)陣列，并且可基于其在圖像內(nèi)的位置將連續(xù)排列像素的集合或團(tuán)排列在分區(qū)內(nèi)。更具體地，對(duì)于所標(biāo)識(shí)的每個(gè)顆粒，可以確定在第一和第二組圖像中其所屬的分區(qū)。分區(qū)陣列可包括任何數(shù)量的行和列，這取決于期望背景信號(hào)的清晰度、系統(tǒng)的處理能力、和/或被分析的顆粒數(shù)量。如在圖5中進(jìn)一步示出的，該方法可以進(jìn)行到框136，以對(duì)第一組圖像以及在某些情形中的第二組圖像的每個(gè)相應(yīng)分區(qū)，產(chǎn)生表示歸類(lèi)到其中的像素集合的光學(xué)參數(shù)水平的單個(gè)統(tǒng)計(jì)量。一般而言，該統(tǒng)計(jì)量可從任何數(shù)量的統(tǒng)計(jì)參數(shù)中選擇，包括但不限于，中值、平均值、模和截尾平均值。在某些實(shí)施方式中，確定中值可以是特別有益的。如圖5的判定框138所示，在各實(shí)施方式中該方法可進(jìn)行到框140，其中分析對(duì)不同兩組顆粒取得的兩組圖像?？?40指示，計(jì)算對(duì)第一和第二組圖像的每個(gè)相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量的平均值。在框140之后或者在框138中判定對(duì)于像素集合歸類(lèi)只分析一組圖像時(shí)，該方法可以進(jìn)行到框142，以將對(duì)相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量保存到用于形成第一和第二組圖像的波長(zhǎng)所專(zhuān)用的矩陣中。這些矩陣用于為對(duì)具有未知濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的圖像顆粒測(cè)量的光學(xué)參數(shù)計(jì)算歸一化值，如以下參照框148所述。特別地，該方法可包括框144，用于分析對(duì)具有未知濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的顆粒取得的第三組圖像，以在第三組圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)呈現(xiàn)第一預(yù)定閾值以上的光學(xué)參數(shù)值的一個(gè)或多個(gè)像素。與第一組圖像一樣，第三組圖像可包括任何數(shù)量的圖像，并且在取得多個(gè)圖像的情形中，可使用不同波長(zhǎng)的照射源來(lái)形成多個(gè)圖像。該方法可以進(jìn)行到框146，其中，將在框144中標(biāo)識(shí)的像素集合歸類(lèi)到第三組圖像的相應(yīng)分區(qū)。為了補(bǔ)償具有未知濃度熒光材料的顆粒之間位置依賴(lài)的發(fā)射變化，可以對(duì)所測(cè)光學(xué)參數(shù)計(jì)算歸一化值。特別地，框148示出，可以將在圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)的每個(gè)像素的光學(xué)參數(shù)值除以對(duì)第一和第二組圖像的對(duì)應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)量，以獲得該光學(xué)參數(shù)的歸一化值。在某些實(shí)施方式中，可將每個(gè)所標(biāo)識(shí)像素的所得歸一化值乘以單個(gè)“校準(zhǔn)因子”值，以相對(duì)于外部標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)其最終校準(zhǔn)值。對(duì)于基本上均勻的一組已知濃度顆粒，可根據(jù)上述歸一化矩陣確定校準(zhǔn)因子值。特別地，該方法可任選地包括(由虛線(xiàn)框表示)框150，用于計(jì)算表示對(duì)第一和第二組圖像之一或兩者的相應(yīng)分區(qū)產(chǎn)生的全部統(tǒng)計(jì)量的統(tǒng)計(jì)值。該統(tǒng)計(jì)值可從任何數(shù)量的統(tǒng)計(jì)參數(shù)中選擇，包括但不限于中值、平均值、模、和截尾平均值。在某些實(shí)施方式中，確定中值是十分有益的。校準(zhǔn)值的確定還可包括將與關(guān)聯(lián)于具有均勻濃度的與之關(guān)聯(lián)的熒光材料的不同組顆 粒的光學(xué)參數(shù)水平相關(guān)聯(lián)的預(yù)定數(shù)值除以計(jì)算出的統(tǒng)計(jì)值，如框152所示。如以上所述以及圖5中的框154所示，可將校準(zhǔn)因子值乘以對(duì)具有未知濃度的顆粒的光學(xué)參數(shù)獲得的歸一化值，以根據(jù)外部標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)其值。注意，以上所述的歸一化和校準(zhǔn)技術(shù)并不限于歸一化所有圖像中的每個(gè)像素。相反，歸一化和校準(zhǔn)技術(shù)可應(yīng)用于在一圖像內(nèi)標(biāo)識(shí)的顆粒。相對(duì)于應(yīng)用專(zhuān)用的像素歸一化和校準(zhǔn)，這一過(guò)程對(duì)最小化計(jì)算特別有益。得益于本公開(kāi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，本發(fā)明被認(rèn)為是提供一種用于圖像數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)方法、存儲(chǔ)介質(zhì)和系統(tǒng)。就本說(shuō)明書(shū)而言，本發(fā)明諸方面的其它變體和替換實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。因此，本說(shuō)明書(shū)應(yīng)該只被解讀為是說(shuō)明性的，以及是出于示教本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明的一般方式的目的。應(yīng)該理解，本文示出和描述的本發(fā)明的形式采用當(dāng)前較佳實(shí)施方式。如在得益于本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)之后對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，可對(duì)本文所示和所述的元件和材料進(jìn)行替換，對(duì)部分和過(guò)程進(jìn)行反向，并且可以獨(dú)立使用本發(fā)明的某些方面?？蓪?duì)本文所述的元件進(jìn)行改變而不背離所附權(quán)利要求書(shū)所述的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種被配置成獲取和處理圖像數(shù)據(jù)的系統(tǒng)，包括 成像子系統(tǒng)，被配置成 在不同波長(zhǎng)帶下對(duì)置于所述成像子系統(tǒng)內(nèi)的顆粒進(jìn)行成像；以及 獲取與所成像顆粒的發(fā)射對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)；以及 存儲(chǔ)介質(zhì)，包括可由處理器執(zhí)行用于以下步驟的程序指令 存儲(chǔ)對(duì)所述顆粒的多個(gè)圖像獲取的數(shù)據(jù)，其中所述多個(gè)圖像的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于一不同波長(zhǎng)帶; 從所述多個(gè)圖像之一選擇參考圖像；以及 操縱所述多個(gè)圖像中不是參考圖像的至少一個(gè)的坐標(biāo)，使得與所述多個(gè)圖像的每一個(gè)內(nèi)的所述顆粒對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)與所述參考圖像中的斑點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)。
2.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述不同波長(zhǎng)帶是由具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的兩個(gè)或更多LED創(chuàng)建的。
3.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于，用于操縱所述坐標(biāo)參數(shù)的所述程序指令包括用于執(zhí)行坐標(biāo)的垂直偏移的程序指令。
4.如權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其特征在于，用于操縱所述坐標(biāo)參數(shù)的所述程序指令包括用于執(zhí)行坐標(biāo)的多個(gè)垂直偏移以使非參考圖像與所述參考圖像的對(duì)準(zhǔn)最大化的程序指令。
5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于，用于操縱所述坐標(biāo)參數(shù)的所述程序指令包括用于存儲(chǔ)使非參考圖像與所述參考圖像的對(duì)準(zhǔn)最大化所需的偏移并且將所存儲(chǔ)的偏移應(yīng)用于附加非參考圖像的程序指令。
6.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于，用于操縱所述坐標(biāo)參數(shù)的所述程序指令包括用于執(zhí)行所述多個(gè)圖像中至少一個(gè)的旋轉(zhuǎn)的程序指令。
7.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于，用于操縱所述坐標(biāo)參數(shù)的所述程序指令包括用于以下步驟的程序指令 將至少一個(gè)圖像的坐標(biāo)調(diào)節(jié)預(yù)定偏移量； 計(jì)算與不同圖像內(nèi)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的像素之間強(qiáng)度的集合誤差或均方差； 使用不同的預(yù)定偏移量，將調(diào)節(jié)所述至少一個(gè)圖像的坐標(biāo)以及計(jì)算強(qiáng)度的集合誤差或均方差的所述步驟重復(fù)預(yù)定迭代次數(shù)； 對(duì)于所述至少一個(gè)圖像的不同已調(diào)節(jié)坐標(biāo)的每一個(gè)，比較強(qiáng)度的集合誤差或均方差的計(jì)算值；以及 保存具有與具有最小強(qiáng)度集合誤差或均方差的一組圖像對(duì)應(yīng)的已調(diào)節(jié)坐標(biāo)的每個(gè)圖像的偏移量值。
8.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于，用于操縱所述坐標(biāo)參數(shù)的所述程序指令包括用于以下步驟的程序指令 將至少一個(gè)圖像的坐標(biāo)調(diào)節(jié)預(yù)定偏移量； 計(jì)算不同圖像內(nèi)斑點(diǎn)的位置之間的集合誤差或均方差； 使用不同的預(yù)定偏移量，將調(diào)節(jié)所述至少一個(gè)圖像的坐標(biāo)以及計(jì)算斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差的所述步驟重復(fù)預(yù)定迭代次數(shù)； 對(duì)于所述至少一個(gè)圖像的不同已調(diào)節(jié)坐標(biāo)的每一個(gè)，比較斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差的計(jì)算值；以及 保存具有與具有最小斑點(diǎn)位置的集合誤差或均方差的一組圖像對(duì)應(yīng)的已調(diào)節(jié)坐標(biāo)的每個(gè)圖像的偏移量值。
9.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述存儲(chǔ)介質(zhì)還包括可由處理器執(zhí)行用于以下步驟的程序指令 判定在用于對(duì)置于所述成像子系統(tǒng)內(nèi)的所述顆粒進(jìn)行歸類(lèi)的一個(gè)波長(zhǎng)帶下成像的所述顆粒是否在用于對(duì)顆粒歸類(lèi)的不同波長(zhǎng)帶下進(jìn)一步成像； 在判定所述顆粒在所述不同波長(zhǎng)帶下成像時(shí)，接受所述顆粒用于進(jìn)一步評(píng)估；以及 在判定所述顆粒不在所述不同波長(zhǎng)帶下成像時(shí)，拒絕所述顆粒用于進(jìn)一步評(píng)估。
全文摘要
提供一種用于圖像數(shù)據(jù)處理的方法和系統(tǒng)。該方法和系統(tǒng)的實(shí)施方式包括執(zhí)行以下步驟中一個(gè)或多個(gè)的配置背景信號(hào)測(cè)量、使用歸類(lèi)染料發(fā)射和群集拒絕的顆粒標(biāo)識(shí)、圖像間對(duì)準(zhǔn)、圖像間顆粒關(guān)聯(lián)、指示發(fā)射的熒光積分和圖像平面歸一化。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102621053SQ20121002109
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
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