專利名稱：Anti-HBc 定量檢測(cè)方法及其在監(jiān)控慢性乙肝患者病情發(fā)展和預(yù)測(cè)治療療效中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)檢測(cè)及乙型病毒性肝炎臨床診斷領(lǐng)域，更具體地涉及通過定量檢測(cè)乙型肝炎病毒核心蛋白抗體(Antibodies againsthepatitis B core protein, Ant1-HBc),監(jiān)控慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展,并有效預(yù)測(cè)慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B)患者接受抗乙型肝炎病毒治療(特別是基于干擾素的治療和基于核苷/核苷酸類似物抗HBV藥物的治療)的療效，從而指導(dǎo)病人進(jìn)行合理藥物選擇的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性乙型肝炎病毒感染是全球最為重要的公共衛(wèi)生問題之一，目前全球約有超過3.5億的慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎病毒感染可造成慢性乙型病毒性肝炎(Chronichepatitis B, CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis, LC)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)等肝臟疾病，由慢性乙型肝炎病毒感染及其所引起的相關(guān)疾病所導(dǎo)致的死亡，全球每年超過100萬人[I]。
當(dāng)前針對(duì)慢性乙型肝炎病毒感染的治療藥物主要可分為干擾素(Interfeixm，IFNs)和核苷/核苷酸類似物(nucleoside or nucleotide, NAs)兩類。前者包括普通干擾素(IFN)和聚乙二醇干擾素(Peginterfeixm，Peg-1FN，又稱為長(zhǎng)效干擾素)，主要通過整體增強(qiáng)患者免疫能力，來達(dá)到抑制HBV和治療CHB的效果；后者主要包括拉米夫定(lamivudine, LMV)、阿德福韋酯(adefovir dipivoxil, ADV)、恩替卡韋(Entecavir, ETV) >替比夫定(Telbivudine, LdT)、替諾福韋(Tenofovir)等5種，主要通過直接抑制HBV的聚合酶活性從而抑制HBV復(fù)制。對(duì)慢性乙型肝炎病毒感染來說，采用上述藥物進(jìn)行慢性乙型肝炎治療的最終目標(biāo)是患者患者達(dá)到乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis Bsurfaceantigen,HBsAg)血清學(xué)陰轉(zhuǎn)或血清學(xué)轉(zhuǎn)換(HBsAg loss orHBsAg seroconversion)。但由于現(xiàn)有的上述藥物實(shí)現(xiàn)HBsAg血清學(xué)陰轉(zhuǎn)或血清學(xué)轉(zhuǎn)換的效果十分有限，常常需要持續(xù)治療數(shù)年以上的時(shí)間。而乙型肝炎病毒E抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換(HBeAg seroconversion)是慢性乙型肝炎病毒感染自然歷史過程中的另一個(gè)重要的里程碑事件，通常伴隨著臨床肝炎病情的緩解和良好的疾病預(yù)后，因此目前臨床醫(yī)生和研究者常以“接受治療后患者是否發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換”作為判斷治療是否有效的主要指標(biāo)。除HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換之外，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(Sustainedvirological response, SVR)也是臨床判斷慢性乙型肝炎治療療效的次要指標(biāo)[2, 3] ο
以能使慢性乙型肝炎病人達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的為治療終點(diǎn)來看，IFNs類藥物和NAs類藥物在治療療效和藥物可接受性上有較大區(qū)別。IFNs類藥物(主要指Peg-1FN或長(zhǎng)效干擾素)療效優(yōu)于NAs類藥物，前者治療I年(52周)可使得30-50%的HBeAg陽(yáng)性的病人實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，而后者通常只能使得10-30%的HBeAg陽(yáng)性的的病人實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。但I(xiàn)FNs類藥 物治療的副作用較NAs類藥物更大，受試者常伴有發(fā)熱、頭疼、乏力、頭發(fā)脫落、白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)，部分患者常無法忍受這些副作用；相比而言，口服NAs類藥物副作用很小，可接受性較強(qiáng)。在價(jià)格方面，IFNs類藥物(主要指Peg-1FN或長(zhǎng)效干擾素)治療一年的藥物費(fèi)用約在15000RMB以上，而NAs類藥物通常治療費(fèi)用在10000RMB以下。鑒于兩類治療藥物的上述區(qū)別，在患者治療前進(jìn)行有效評(píng)估預(yù)測(cè)，進(jìn)而選擇最優(yōu)藥物進(jìn)行慢性乙型肝炎治療，具有十分重要的意義。
由于患者能否獲得實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，主要依賴于患者自身是否具有足夠的針對(duì)HBV的特異性免疫能力，或能否通過藥物治療獲得足夠的針對(duì)HBV的特異性免疫能力。因此，定量測(cè)定慢性乙型肝炎患者針對(duì)HBV特異性免疫能力能夠預(yù)測(cè)慢性乙肝患者接受治療時(shí)發(fā)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換幾率的大小。長(zhǎng)期以來，慢乙肝患者血清ALT水平被作為衡量宿主抗HBV免疫能力的間接替代指標(biāo)。這主要是因?yàn)槁砸腋位颊哐錋LT水平能反映其肝細(xì)胞炎癥/壞死程度，而HBV是免疫致病病毒，其導(dǎo)致肝臟炎癥/肝細(xì)胞壞死是由于抗HBV T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此血清ALT水平與宿主抗HBV免疫能力之間存在一定的相關(guān)性。一般認(rèn)為，血清ALT水平大于2倍正常值上限(The upper normal Iimit7ULN)的患者抗HBV治療的療效(指通過治療達(dá)到HBeAg血清轉(zhuǎn)換的幾率)要顯著高于那些沒有肝炎反應(yīng)，亦即血清ALT水平小于正常值上限的慢性乙肝感染者，而血清ALT水平大于5倍正常值上限的患者抗HBV治療的療效又要優(yōu)于那些有肝炎反應(yīng)但ALT水平較低的患者。但ALT水平的測(cè)定，更多的是反應(yīng)肝臟炎癥的程度，ALT不是一個(gè)HBV特異性的指標(biāo)，易受其他因素的影響(如共發(fā)自身免疫性肝炎、酒精性肝病、感染HCV等其它肝炎病毒)，而且其半衰期較短，其預(yù)測(cè)慢乙肝治療療效并非十分可靠。除了血清ALT外，HBV特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)方法(如體外刺激細(xì)胞因子釋放試驗(yàn))等可能也具有預(yù)測(cè)慢性乙肝治療療效的應(yīng)用價(jià)值，但其操作比較繁瑣，臨床實(shí)踐推廣十分困難，且對(duì)檢測(cè)標(biāo)本的要求較高(需要檢測(cè)新鮮全血標(biāo)本)，應(yīng)用前景有限。綜上所述，本領(lǐng)域目前尚缺乏有效的治療前評(píng)估檢測(cè)方法。
乙型肝炎病毒核心蛋白抗體(Antibodiesagainst hepatitis Bcore protein,Ant1-HBc)是最經(jīng)典的HBV感染的血清學(xué)指標(biāo)之一，Ant1-HBc的定性檢測(cè)(判斷Ant1-HBc是否陽(yáng)性)迄今已在乙型肝炎病毒感染的臨床診斷中使用超過35年。血清Ant1-HBc陽(yáng)性指示受試者曾經(jīng)或正被HBV感染，同時(shí)該抗體在HBV感染者血清中常常持續(xù)終身存在。目前已經(jīng)發(fā)明的檢測(cè)血清Ant1-HBc抗體的方法主要是基于競(jìng)爭(zhēng)或抑制免疫檢測(cè)原理，此類方法可較好地應(yīng)用于Ant1-HBc的定性檢測(cè)，但受技術(shù)原理限制，其檢測(cè)動(dòng)力學(xué)線性范圍一般較窄(通常在I個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi))，且檢測(cè)穩(wěn)定性較差，不能很好地應(yīng)用于Ant1-HBc的定量檢測(cè)。綜述文獻(xiàn)可知，在本發(fā)明公布以前，尚無有效的Ant1-HBc定量檢測(cè)方法及試劑；同時(shí)尚不清楚Ant1-HBc定量檢測(cè)的臨床價(jià)值和對(duì)應(yīng)用途。發(fā)明內(nèi)容
由于乙型肝炎病毒核心蛋白的免疫原性極強(qiáng)，其血清抗體水平指示著宿主個(gè)體特異性針對(duì)HBV的體液免疫反應(yīng)能力(B cell immuneresponse),從而反映出宿主抗HBV的整體免疫能力。有鑒于此,本發(fā)明的研究者認(rèn)為,精確檢測(cè)慢性乙肝患者血清Ant1-HBc水平能指示患者針對(duì)HBV的特異性免疫應(yīng)答強(qiáng)弱，并能預(yù)測(cè)其接受藥物(包括干擾素類藥物、核苷/核苷酸類似物等)治療的最終療效。本發(fā)明涉及一種能精確定量檢測(cè)乙型肝炎病感染者血清/血漿中Ant1-HBc抗體水平的方法，以及Ant1-HBc定量檢測(cè)在監(jiān)控慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展和預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者治療療效中的應(yīng)用。
具體地，本發(fā)明涉及一種能精確定量檢測(cè)血清Ant1-HBc水平的免疫學(xué)檢測(cè)方法，該方法可以通過酶聯(lián)免疫或者化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)方式加以實(shí)現(xiàn)。
該方法的性能優(yōu)勢(shì)在于其單次檢測(cè)的線性動(dòng)力學(xué)范圍在1.5個(gè)數(shù)量級(jí)以上，亦即單次檢測(cè)準(zhǔn)確定量的上限值高于準(zhǔn)確定量的下限值32倍以上，這一特征是精確定量檢測(cè)血清Ant1-HBc水平的基礎(chǔ)，是本發(fā)明之前的Ant1-HBc檢測(cè)方法所不具備的。
使用該方法在慢性乙型肝炎病毒感染不同時(shí)期的病人標(biāo)本及病人病程自然進(jìn)展的系列標(biāo)本中所獲得的結(jié)果表明，血清Ant1-HBc的定量水平與病人的肝炎活動(dòng)性及宿主免疫狀態(tài)高度相關(guān)，Ant1-HBc的定量測(cè)定值能有效分辨患者是否處于免疫活化或肝炎活動(dòng)階段。這說明在臨床上使用本發(fā)明公布的Ant1-HBc定量檢測(cè)方法或其他等效方法有助于對(duì)慢性乙型肝炎患者疾病進(jìn)展情況的監(jiān)測(cè)和判斷。
使用該方法對(duì)接受阿德福韋酯和長(zhǎng)效干擾素治療的慢性肝炎病人隊(duì)列標(biāo)本中所獲得的結(jié)果表明，基線Ant1-HBc水平與患者的治療應(yīng)答率呈正相關(guān)。這說明在臨床上使用本發(fā)明公布的Ant1-HBc定量檢測(cè)方法或其他等效方法，能在慢性乙型肝炎患者接受阿德福韋酯、長(zhǎng)效干擾素或其他基于類似原理的藥物治療前評(píng)估預(yù)期療效，有利于指導(dǎo)治療藥物和治療時(shí)機(jī)的選擇，進(jìn)而提聞治療效率。
在另一方面，本發(fā)明涉及定量檢測(cè)乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平的試劑在制備用于監(jiān)控慢性乙型肝炎患者的病情發(fā)展和/或在慢性乙型肝炎患者接受抗乙型肝炎病毒治療前有效預(yù)測(cè)其治療效果的診斷劑中的用途。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的定量檢測(cè)通過如下方法中的一種或者幾種方法來實(shí)現(xiàn):酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法、時(shí)間分辨熒光檢測(cè)法、免疫比濁法、免疫層析法、免疫滲濾法。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平的單次檢測(cè)的線性動(dòng)力學(xué)范圍在1.5個(gè)數(shù)量級(jí)以上，亦即單次檢測(cè)準(zhǔn)確定量的上限值高于準(zhǔn)確定量的下限值32倍以上。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的定量檢測(cè)包括以下步驟:
a)提供可與乙型肝炎病毒核心蛋白抗體特異性結(jié)合的乙型肝炎病毒蛋白，該蛋白可以是包含乙型肝炎病毒核心蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列(從第I位氨基酸到第183位氨基酸)，也可以是只包含乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的氨基酸序列(如從第I位氨基酸到第149位氨基酸)，該蛋白被固相化于固相化載體上，作為固相抗原，用于捕獲血清樣品中存在的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體；
b)提供可與被捕獲到固相抗原上的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體特異性結(jié)合的抗原標(biāo)記物，該蛋白可以是包含乙型肝炎病毒核心蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列(從第I位氨基酸到第183位氨基酸)，也可以是只包含乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的氨基酸序列(如從第I位氨基酸到第149位氨基酸)，所標(biāo)記的信號(hào)產(chǎn)生物可以是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或吖啶酯；
c)提供用于繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度的定量標(biāo)準(zhǔn)品，通常為3-6份含不同濃度的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的樣品組成。濃度的單位可以是IU/mL，PEIU/mL，也可以是其他可以朔源的濃度或滴度單位；
d)樣品(待測(cè)樣品或定量標(biāo)準(zhǔn)品)與固相抗原相互接觸，使得樣品中的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體，如果存在的話，被捕獲，形成固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體復(fù)合物；
e)使抗原標(biāo)記物與步驟c)的產(chǎn)物，即固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體復(fù)合物相互接觸，從而形成固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體-抗原標(biāo)記物復(fù)合物；
f)使底物或能激發(fā)信號(hào)產(chǎn)生的溶液也步驟e)形成的固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體-抗原標(biāo)記物復(fù)合物相互接觸，從而生產(chǎn)可測(cè)量的信號(hào)，并以相應(yīng)的測(cè)定儀器測(cè)定所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度；
g)將測(cè)量得到的定量標(biāo)準(zhǔn)品(通常為3-6份)的信號(hào)，與其對(duì)應(yīng)的濃度值進(jìn)行線性回歸擬合，獲得由測(cè)量信號(hào)計(jì)算樣品濃度的數(shù)學(xué)公式；
h)將待測(cè)樣品測(cè)量得到的信號(hào)，引入步驟g)中得到的公式，從而計(jì)算出待測(cè)樣品含有的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體濃度；
i)如果步驟h)中計(jì)算出的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體濃度高于檢測(cè)方法能準(zhǔn)確定量的量值上限，則需對(duì)待側(cè)樣品進(jìn)行稀釋，重復(fù)步驟a)到h)，直至測(cè)定的濃度值落在相應(yīng)檢測(cè)方法能準(zhǔn)確定量的量值上限和量值下限之間。待測(cè)樣品含有的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體濃度由稀釋后測(cè)量值X對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算獲得。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的診斷劑用于在接受不同治療藥物的慢性乙型肝炎病人中，所述藥物包括:長(zhǎng)效干擾素(聚乙二醇化的干擾素，Peginterferon)、普通干擾素(Interferon)、拉米夫定(lamivudine, LMV)、阿德福韋酯(adefovir dipivoxil, ADV) >恩替卡韋(Entecavir, ETV)、替比夫定(Telbivudine, LdT)、替諾福韋(Tenofovir)或其他可用于慢性乙型肝炎治療的藥物。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，在治療前預(yù)測(cè)病人治療療效的通常準(zhǔn)則是:治療前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平高的病人治療所獲療效(應(yīng)答率)高于治療前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平低的病人；治療療效的判定標(biāo)準(zhǔn)可以是乙型肝炎病毒E抗原血清轉(zhuǎn)換(即接受治療的慢性乙肝患者由HBeAg (+)/Ant1-HBe (-)的狀態(tài)改變?yōu)镠BeAg (-)/Ant1-HBe (+))，也可以是病毒學(xué)應(yīng)答(即慢性乙肝患者血清HBV DNA載量降至1000Copies/mL以下)，還可以是其他能指示病情緩解或良好預(yù)后的臨床指標(biāo)。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，監(jiān)控慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展的通常準(zhǔn)則是:乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平的異常升高指示病人肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生和宿主抗乙型肝炎病毒特異性免疫應(yīng)答的活化。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及Ant1-HBc用于制備用來評(píng)估慢性乙型肝炎患者接受阿德福韋酯和聚乙二醇干擾素的治療應(yīng)答情況的試劑盒的用途。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及Ant1-HBc用于制備用來監(jiān)控慢性乙肝患者病情發(fā)展的試劑盒的用途。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明涉及Ant1-HBc用于制備用來預(yù)測(cè)乙肝患者疾病階段的試劑盒的用途。


圖l、Ant1-HBc ELISA定量方法的動(dòng)力學(xué)線性范圍
圖2、Ant1-HBc ELISA定量方法的實(shí)驗(yàn)內(nèi)(A)和實(shí)驗(yàn)間⑶精確性
圖3、104份標(biāo)本Ant1-HBc ELISA定量檢測(cè)結(jié)果的一致性
圖4、Ant1-HBcCLEIA定量方法的動(dòng)力學(xué)線性范圍
圖5、Ant1-HBcCLIA定量方法的動(dòng)力學(xué)線性范圍
圖6、不同時(shí)期的HBV感染者血清Ant1-HBc水平的分布情況
(A)、不同時(shí)期的HBV感染者血清Ant1-HBc水平和ALT水平；
(B)、不同時(shí)期的HBV感染者血清HBV DNA水平和HBsAg水平；
(C)、以血清Ant1-HBc水平判別受試者免疫活化狀態(tài)的ROC曲線分析；
(D)、不同ALT分層病人的平均Ant1-HBc水平；(E)血清Ant1-HBc水平與ALT水平的相關(guān)性分析。
縮寫注釋:PBI，既往感染者；IT，免疫耐受期病人；IC，免疫清除期病人；LR，低復(fù)制期病人；ENH，HBeAg陰性的肝炎；LC，肝硬化病人；HCC，原發(fā)性肝癌病人。
圖7、慢性乙型肝炎病毒攜帶者自然進(jìn)展過程中血清Ant1-HBc、ALT、HBV DNA及HBsAg水平的動(dòng)態(tài)變化
圖8、慢性乙肝病治療前血清Ant1-HBc水平預(yù)測(cè)治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率
(A)、治療前Ant1-HBc水平預(yù)測(cè)慢性乙肝病人接受阿德福韋酯治療后HBeAg血清轉(zhuǎn)換；
(B)、治療前Ant1-HBc水平預(yù)測(cè)慢性乙肝病人接受聚乙二醇干擾素治療后HBeAg血清轉(zhuǎn)換；
(C)、以血清Ant1-HBc水平高低預(yù)測(cè)病人接受阿德福韋酯治療后HBeAg血清轉(zhuǎn)換發(fā)生率；
(D)、以血清Ant1-HBc水平高低預(yù)測(cè)病人接受聚乙二醇干擾素治療后HBeAg血清轉(zhuǎn)換發(fā)生率；
(E)在基線ALT水平不同分層的病人中治療前Ant1-HBc水平預(yù)測(cè)HBeAg血清轉(zhuǎn)換率。
圖9、基線Ant1-HBc水平不同分層的病人接受阿德福韋酯和聚乙二醇干擾素治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率
圖10、阿德福韋酯治療過程中和停藥后病人血清標(biāo)志物量化水平的動(dòng)態(tài)變化具體實(shí)施方式
除非另外定義，本文件中所用的技術(shù)和科學(xué)名詞都表達(dá)的是在本發(fā)明涉及領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所理解的通常含義。
在本發(fā)明的實(shí)施例1中，建立了 Ant1-HBc ELISA (酶聯(lián)免疫分析，微孔板法)定量檢測(cè)方法，該方法能較為精確地確定樣本血清中Ant1-HBc的含量，其單次檢測(cè)能準(zhǔn)確定量的線性動(dòng)力學(xué)范圍達(dá)1.8個(gè)數(shù)量級(jí)(0.04-2.5IU/mL)，上述特征是已經(jīng)公布的Ant1-HBc檢測(cè)方法所不具備的[4，5]。
在實(shí)施例2中，建立Ant1-HBc CLEIA (酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光免疫分析，微孔板法)定量檢測(cè)方法，該方法能較為精確地確定樣本血清中Ant1-HBc的含量，其單次檢測(cè)能準(zhǔn)確定量的線性動(dòng)力學(xué)范圍達(dá)2.7個(gè)數(shù)量級(jí)(0.04-20IU/mL)。該方法較實(shí)施例1中描述的Ant1-HBcELISA定量檢測(cè)方法顯著提高了單次檢測(cè)的線性動(dòng)力學(xué)范圍，使得Ant1-HBc高值標(biāo)本的檢測(cè)所需的稀釋次數(shù)大大減少，提高了效率。
在實(shí)施例3中，建立Ant1-HBc CLIA (直接化學(xué)發(fā)光免疫分析，微粒子法)定量檢測(cè)方法，該方法能較為精確地確定樣本血清中Ant1-HBc的含量，其單次檢測(cè)能準(zhǔn)確定量的線性動(dòng)力學(xué)范圍達(dá)3.02個(gè)數(shù)量級(jí)(0.02-20.8IU/mL)。該方法較實(shí)施例1中描述的Ant1-HBcELISA定量檢測(cè)方法顯著提高了單次檢測(cè)的線性動(dòng)力學(xué)范圍，使得Ant1-HBc高值標(biāo)本的檢測(cè)所需的稀釋次數(shù)大大減少，提高了效率。該方法較實(shí)施例2中描述的Ant1-HBc CLEIA定量檢測(cè)方法的區(qū)別在于采用單管式檢測(cè)，如配以全自動(dòng)設(shè)備，在臨床上便于實(shí)現(xiàn)隨到隨檢。
在實(shí)施例4中，將上述Ant1-HBc定量檢測(cè)方法應(yīng)用于評(píng)估不同時(shí)期的HBV感染者血清Ant1-HBc水平的分布情況。評(píng)估結(jié)果表明，在慢性乙型肝炎感染者中，血清Ant1-HBc水平高低與感染者的肝炎活動(dòng)性及宿主免疫狀況相關(guān)。Ant1-HBc水平可以用于判斷慢性乙型肝炎感染者是否處于免疫激活狀態(tài)或肝炎活動(dòng)狀態(tài)，診斷準(zhǔn)確性(AUROC)為0.918(95%Cl:0.888-0.948)，判斷臨界值為7400IU/mL。這一結(jié)果表明，本發(fā)明公布的Ant1-HBc定量檢測(cè)方法所獲檢測(cè)結(jié)果有助于臨床醫(yī)生對(duì)患者疾病階段的判斷。
在實(shí)施例5中，將上述Ant1-HBc定量檢測(cè)方法應(yīng)用于評(píng)估慢性乙型肝炎病毒感染者自然進(jìn)展過程中Ant1-HBc水平的動(dòng)態(tài)變化及其與其他指標(biāo)的聯(lián)系。評(píng)估結(jié)果表明，慢性乙型肝炎病毒感染者發(fā)生肝炎活動(dòng)時(shí)，Ant1-HBc與ALT幾乎同時(shí)升高，Ant1-HBc峰值通常較ALT峰值晚3-8周，但有時(shí)可能早于或與ALT峰值同時(shí)；在肝炎恢復(fù)期，ALT很快復(fù)常，Ant1-HBc則需晚12-20周才能回到基線水平。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，采用發(fā)明公布的方法定量測(cè)定慢性乙型肝炎病毒感染者的Ant1-HBc水平，可作為ALT測(cè)量的補(bǔ)充指標(biāo)，有助于臨床醫(yī)生判斷患者是否正處于肝炎活動(dòng)期或在最近3-4個(gè)月時(shí)間內(nèi)曾經(jīng)有肝炎活動(dòng)。
在實(shí)施例6中，將Ant1-HBc定量檢測(cè)方法應(yīng)用于評(píng)估慢性乙型肝炎患者接受阿德福韋酯和聚乙二醇干擾素的治療應(yīng)答情況。結(jié)果表明，慢性乙型肝炎患者接受治療前Ant1-HBc水平高低與治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率正相關(guān):治療前Ant1-HBc水平高(在本實(shí)施例中為> 29000IU/mL)的患者即使采用價(jià)格便宜副作用小但療效較差的阿德福韋酯治療也能達(dá)至較為理想的效果；而治療前Ant1-HBc處于中等水平(在本實(shí)施例中為9000-29000IU/mL)或低水平(在本實(shí)施例中< 9000IU/mL)的患者，采用阿德福韋酯治療療效顯著低于費(fèi)用高副作用相對(duì)較大但強(qiáng)效的長(zhǎng)效干擾素。在治療前Ant1-HBc水平高(彡29000IU/mL)的患者中，阿德福韋酯對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果顯著優(yōu)于治療前Ant1-HBc水平低(< 29000IU/mL)的患者。這一結(jié)果表明，采用發(fā)明公布的方法定量測(cè)定慢性乙型肝炎病毒感染者接受治療前的A nt1-HBc水平，能夠預(yù)測(cè)其接受阿德福韋酯、長(zhǎng)效干擾素或其他基于類似原理的藥物治療后的預(yù)期療效，有利于指導(dǎo)治療藥物和治療時(shí)機(jī)的選擇，進(jìn)而提聞治療效率。
下面采用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述和說明。所述實(shí)施例旨在以舉例方式具體闡明本發(fā)明，各實(shí)施例中所用試劑、化學(xué)品或生物活性材料濃度、所用病人隊(duì)列和其他變量值等只是舉例說明本發(fā)明的應(yīng)用，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例
1、雙抗原夾心法Ant1-HBc定量的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)方法
1.1固相化抗原及標(biāo)記抗原的制備
本方法中采用的固相化抗原及標(biāo)記抗原是能與樣品中的Ant1-HBc抗體特異性結(jié)合的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)，該抗原可以是包含HBcAg的全長(zhǎng)氨基酸序列(Cpl83)，也可以是只包含HBcAg的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的氨基酸序列(Cp 149)。本發(fā)明采用的HBcAg抗原均是E.Coli重組表達(dá)純化所獲得的。Cp 149重組抗原的表達(dá)純化方法參考AdamHotnick等公布的方法進(jìn)行制備[6]，Cpl83重組抗原表達(dá)純化方法參考An Li等公布的方法進(jìn)行制備[5]。在本發(fā)明中通常以Cpl49重組抗原作為固相化抗原，而以Cpl83重組抗原作為標(biāo)記抗原。
1.2反應(yīng)板的制備
(1.2.1)將 Cpl49 抗原用 ρΗ9.6 的 50mM CB 緩沖液(NaHC03/Na2C03 緩沖液，終濃度為50mM，pH值為9.6)稀釋，終濃度為3 μ g/ml。
(1.2.2)在96孔酶標(biāo)板每孔加入100 μ I的包被液，2 8°C包被16 24小時(shí)后再37°C包被2小時(shí)。
(1.2.3)用 PBST 洗滌液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1 % Tween20)洗滌 I 次。然后每孔加入200 μ I的封閉液(含有20 %小牛血清及I %酪蛋白的pH值為7.4的20mMNa2HP04/NaH2P04緩沖液溶液)，放入37°C封閉2小時(shí)；棄去封閉液。干燥后裝入鋁箔袋2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 1.3Cpl83 抗原的 HRP 標(biāo)記
采用改良過碘酸鈉法。以標(biāo)記IOmg Cpl83重組抗原為例:
(1.3.1)將濃度為2mg/L的Cpl83重組抗原(5mL)裝入透析袋，對(duì)50mM CB緩沖液在4°C透析4小時(shí)，中途每2小時(shí)更換透析緩沖液I次。
(1.3.2)準(zhǔn)確稱取HRP 40mg,溶解于2mL ddH20,溶解后加入20mg/mL的Na104溶液2ml，室溫反應(yīng)30分鐘；加入乙二醇40uL，4°C反應(yīng)30分鐘后制成HRP活化溶液(IOmg/mL,4mL)。
(1.3.3)將經(jīng)1.3.2步驟制成的HRP活化溶液，加入裝有Cpl83重組抗原的透析袋，混勻后繼續(xù)對(duì)50mM CB緩沖液在4°C避光條件下進(jìn)行透析，中途每2小時(shí)更換透析緩沖液I次，透析6-8小時(shí)。
(1.3.4)配制NaBH4溶液(5mg/mL) 0.4mL,加入完成1.3.3步驟的標(biāo)記反應(yīng)溶液，并混勻，置于4°C避光條件下反應(yīng)2小時(shí)。
(1.3.5)完成1.3.4步驟后 ，再次將標(biāo)記反應(yīng)溶液裝入新的透析袋，對(duì)PBS緩沖液在4°C透析4小時(shí)。
(1.3.6)完成1.3.5步驟后，用GE公司生產(chǎn)的S^)hacryl S-300HR層析柱進(jìn)行純化，分尚出Cpl83_HRP標(biāo)記物。
(1.3.7)將經(jīng)1.3.6步驟分離純化出的Cpl83_HRP標(biāo)記物濃縮至2mg/mL，并按照體積比1:1加入甘油，混勻后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> (1.3.8)將經(jīng)1.3.7步驟制得的Cpl83_HRP標(biāo)記物，按體積比1/4000稀釋至酶標(biāo)記物稀釋緩沖液(含有20%小牛血清、1%酪蛋白、10%蔗糖、0.05%氨基比林的pH值為7.4的20mM Na2HP04/NaH2P04緩沖液溶液)，制成酶標(biāo)記物反應(yīng)液，混勻后2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 1.4定量標(biāo)準(zhǔn)品
Ant1-HBc定量檢測(cè)的定量標(biāo)準(zhǔn)品為含不同濃度的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的系列樣品組成。濃度的單位可以是IU/mL，PEIU/mL，也可以是其他可以朔源的濃度或滴度單位。在本發(fā)明中使用通行的國(guó)際單位(IU/mL)為Ant1-HBc定量的單位，以NIBSC公布的 Ant1-HBc WHO標(biāo)準(zhǔn)品(Code:95/522, 50IU/ampoule) [7]，倍比稀釋至 40IU/mL，20IU/mL，10IU/mL,5IU/mL,2.5IU/mL,1.25IU/mL,0.625IU/mL,0.3125IU/mL,0.156IU/mL,0.078IU/mL,0.039IU/mL,0.02IU/mL,0.0lIU/mL共13種不同濃度。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品用的基質(zhì)溶液可以為Ant1-HBc陰性的健康獻(xiàn)血者血漿或血清，也可以是含20%新生牛血清的PBS溶液。
1.5Ant1-HBc 的 ELISA 定量檢測(cè)
選取I份慢性乙型肝炎患者的血清(編號(hào)Pl)按照下列步驟進(jìn)行Ant1-HBc的定量檢測(cè)。鑒于慢性乙型肝炎患者血清Ant1-HBc水平通常較高，我們將該標(biāo)本以含20%新生牛血清的PBS溶液稀釋成1: 500、1: 2500,1: 12500,1: 62500共4個(gè)稀釋度進(jìn)行定量ELISA檢測(cè)。
(1.5.1)樣品反應(yīng):取已包被的酶標(biāo)板一塊，每孔加入90 μ L樣品稀釋液，每孔再加入10 μ L標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻后,置于37°C溫箱反應(yīng)30分鐘。
(1.5.2)酶標(biāo)記物反應(yīng):完成1.5.1步驟后，將酶標(biāo)板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1% Tween20)洗滌5遍，每孔加入100 μ L如1.3.8步驟制備的酶標(biāo)記物反應(yīng)液，置于37°C溫箱反應(yīng)30分鐘。
(1.5.3)顯色反應(yīng):完成1.5.2步驟后，將酶標(biāo)板用PBST洗液(20mMPB7.4，150mMNaCl，0.1% Tween20)洗滌5遍，每孔加入TMB顯色劑(由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供)各50 μ L，置于37°C溫箱反應(yīng)15分鐘。
(1.5.4)終止反應(yīng)及讀值測(cè)量:完成1.5.3步驟后，在反應(yīng)完的酶標(biāo)板中每孔加入終止液(由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供)50 μ L，并于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的OD45^值。
(1.5.5)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:完成1.5.4步驟后，對(duì)13個(gè)定量標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量值及其對(duì)應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制出如圖1的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，Ant1-HBcELISA方法能準(zhǔn)確定量的上限值為2.5IU/mL，下限值為0.04IU/mL,其線性動(dòng)力學(xué)范圍為1.8個(gè)數(shù)量級(jí)。由0D45Q/63Q測(cè)量值計(jì)算Ant1-HBc濃度的公式為:Conc.mti_HB。(IU/mL)=1.2104X OD4507630-0.011。
(1.5.6)待測(cè)樣品Ant1-HBc濃度的獲得:P1血清的系列稀釋樣本經(jīng)1.5.1-1.5.5的步驟測(cè)量后，其1: 500稀釋的0D45Q/63Q測(cè)量值為3.899、I: 2500稀釋的0D45(I/63(I測(cè)量值為 3.801、1: 12500 稀釋的 0D45Q/63Q 測(cè)量值為 2.988、1: 62500 稀釋的 0D45(I/63(I 測(cè)量值為0.301 ;將上述測(cè)量值代入步驟1.5.5中獲得的Ant1-HBc濃度計(jì)算公式，其中1: 500測(cè)得的濃度值為4.71IU/mL，l: 2500測(cè)得的濃度值為4.59IU/mL，I: 12500測(cè)得的濃度值為3.61IU/mL，l: 62500測(cè)得的濃度值為0.35IU/mL。I: 62500稀釋度測(cè)得的濃度值落在本ELISA方法能準(zhǔn)確定量的線性動(dòng)力學(xué)范圍(0.04-2.5IU/mL)內(nèi)，因此該樣本的原始Ant1-HBc 濃度為 0.35X62500 = 22083IU/mL。
(1.5.7)檢測(cè)方法的試驗(yàn)內(nèi)(Intra-assay)精確性評(píng)價(jià):取已知濃度的6份標(biāo)本，其 Ant1-HBc 定量值分別為 5IU/mL，2.5IU/mL, 1.25IU/mL，0.625IU/mL，0.3125IU/mL,0.156幾/!^，在同次實(shí)驗(yàn)中，每份樣本按照1.5.1-1.5.4的步驟重復(fù)檢測(cè)16孔，檢測(cè)完后分別計(jì)算各樣品OD45cia53ci測(cè)量值的試驗(yàn)內(nèi)變異系數(shù)，如圖2A所示，6份樣本的試驗(yàn)內(nèi)變異系數(shù)在 2.8% -10.1%之間。
(1.5.8)檢測(cè)方法的試驗(yàn)間(Inter-assay)精確性評(píng)價(jià):取已知濃度的6份標(biāo)本，其 Ant1-HBc 定量值分別為 5IU/mL，2.5IU/mL, 1.25IU/mL，0.625IU/mL，0.3125IU/mL,0.156IU/mL。對(duì)上述6份樣品按照1.5.1-1.5.4的步驟進(jìn)行16次獨(dú)立的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，完成全部檢測(cè)后分別計(jì)算各份樣品OD45cia53ci測(cè)量值的試驗(yàn)間變異系數(shù)，如圖2B所示，6份樣本的試驗(yàn)間變異系數(shù)在4.4% -10.5%之間。
(1.5.9) Ant1-HBc定量檢測(cè)的重現(xiàn)性評(píng)估:隨機(jī)選擇104份慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本(Ant1-HBc 水平在 2.231og10IU/mL 至 5.371og1(lIU/mL 之間)，按照 1.5.1-1.5.6 的步驟進(jìn)行Ant1-HBc的定量測(cè)定，獨(dú)立重復(fù)測(cè)量2次，并對(duì)兩次測(cè)量結(jié)果進(jìn)行回歸分析，如圖3所示，兩次測(cè)量結(jié)果高度一致，R2 = 0.988。
2、雙抗原夾心法Ant1-HBc定量的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)(CLEIA)方法
2.1固相化抗原及標(biāo)記抗原的制備
按照本發(fā)明中實(shí)施例1第1.1節(jié)所述的方法進(jìn)行。
2.2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板的制備
按照本發(fā)明中實(shí)施例1第1.2節(jié)所述的方法進(jìn)行，但采用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板作為抗原固相化載體。
2.3Cpl83 抗原的 HRP 標(biāo)記
按照本發(fā)明中實(shí)施例1第1.3節(jié)所述的方法和步驟進(jìn)行。
2.4定量標(biāo)準(zhǔn)品
同本發(fā)明實(shí)施例1第1.4節(jié)所述。
2.5Ant1-HBc 的 CLEIA 定量檢測(cè)
選取I份慢性乙型肝炎患者的血清(編號(hào)Pl)按照下列步驟進(jìn)行Ant1-HBc的定量檢測(cè)。鑒于慢性乙型肝炎患者血清Ant1-HBc水平通常較高，我們將該標(biāo)本以含20%新生牛血清的PBS溶液稀釋成1: 500、I: 2500、I: 12500共3個(gè)稀釋度進(jìn)行定量CLEIA檢測(cè)。
(2.5.1)樣品反應(yīng):取已包被的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板一塊，每孔加入90 μ L樣品稀釋液，每孔再加入 ο μ L標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻后，置于37°C溫箱反應(yīng)30分鐘。
(2.5.2)酶標(biāo)記物反應(yīng):完成2.5.1步驟后，將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板用PBST洗液(20mMPB7.4,150mM NaCl，0.1% Tween20)洗滌5遍，每孔加入100 μ L如1.3.8步驟制備的酶標(biāo)記物反應(yīng)液，置于37°C溫箱反應(yīng)30分鐘。
(2.5.3)發(fā)光反應(yīng)和測(cè)量:完成2.5.2步驟后，將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1% Tween20)洗滌 5 遍，每孔加入 Pierce 公司生產(chǎn)的 PICOChemiluminescent Substrate 100 μ L,立即采用Orin II化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀讀取各反應(yīng)孔發(fā)光值(RLU)。
(2.5.4)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:完成2.5.3步驟后，對(duì)13個(gè)定量標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量值及其對(duì)應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制出如圖4的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，Ant1-HBcCLEIA方法能準(zhǔn)確定量的上限值為20IU/mL，下限值為0.04IU/mL,其線性動(dòng)力學(xué)范圍為2.7個(gè)數(shù)量級(jí)。由RLU測(cè)量值計(jì)算Ant1-HBc濃度的公式為:Conc.ant1-HBc (IU/mL)=(LoglO(ELU) X0.9337-5.3006)
(2.5.4)待測(cè)樣品Ant1-HBc濃度的獲得:P1血清的系列稀釋樣本經(jīng)2.5.1-2.5.4的步驟測(cè)量后，其1: 500稀釋的RLU測(cè)量值為12115100、1: 2500稀釋的RLU測(cè)量值為5067890、I: 12500稀釋的RLU測(cè)量值為889610 ;將上述測(cè)量值代入步驟2.5.4中獲得的Ant1-HBc濃度計(jì)算公式，其中1: 500測(cè)得的濃度值為20.56IU/mL，l: 2500測(cè)得的濃度值為 9.114IU/mL，I: 12500 測(cè)得的濃度值為 1.795IU/mL，其中 I: 2500 和 I: 12500 兩個(gè)稀釋度的測(cè)量值落在本CLEIA方法能準(zhǔn)確定量的線性動(dòng)力學(xué)范圍(0.04-20IU/mL)。據(jù)此如以1: 2500的測(cè)量值計(jì)算，該樣本的原始Ant1-HBc濃度為9.114X2500 = 22784IU/mL ；而如以1: 12500的測(cè)量值計(jì)算，該樣本的原始Ant1-HBc濃度為1.795X12500 = 22442IU/mL。兩個(gè)測(cè)量值的平均濃度為22613IU/mL，該濃度值與采用ELISA方法測(cè)得的該標(biāo)本的濃度值22083IU/mL的誤差為2.4%，屬于正常偏差范圍內(nèi)。
3、雙抗原夾心法Ant1-HBc定量的管式微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)(CLIA)方法
3.1固相化抗原及標(biāo)記抗原的制備
按照本發(fā)明中實(shí)施例1第1.1節(jié)所述的方法進(jìn)行。
3.2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板的制備
(3.2.1)取Img磁珠，用ImL活化緩沖體系(50mM MES 5.0)洗滌2遍，棄上清。加入Img EDC和Img NHS試劑(均用50mM MES 5.0配置成10mg/mL)，混勻后，室溫振蕩活化20分鐘；
(3.2.2)將活化好的磁珠用ImL活化緩沖體系(50mM MES 5.0)洗滌2遍，棄上清。加入Cpl49抗原25 μ g，混勻后，室溫振蕩反應(yīng)3h ；。
(3.2.3)用 PBST 洗滌液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1% Tween20)洗滌 3 次。然后每孔加入 2500 μ I 的保存液(20mM PB7.4,0.1% BSAUOOmM Gly,0.05% Tff-20,0.1%Proc I in)，2-8 °C 保存?zhèn)溆谩?br> 3.3Cpl83抗原的吖啶酯標(biāo)記
(3.3.1)取50 μ g蛋白Cpl83，加入到300 μ I標(biāo)記緩沖體系(50mM磷酸鹽緩沖液，PH8.0)中，加入8 μ L吖啶酯(5mM NHS-SAE)，避光室溫反應(yīng)30min。
(3.3.2)在步驟(3.3.1)中反應(yīng)好的標(biāo)記物中加入100 μ L終止緩沖液(含IOOmM甘氨酸的磷酸鹽緩沖液，ΡΗ8.0)，避光室溫反應(yīng)30min。
(3.3.3)將經(jīng)過步驟(3.3.2)的標(biāo)記物裝入透析袋，用透析緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，PH 7.4) 在4°C避光條件下進(jìn)行透析，中途每2小時(shí)更換透析緩沖液I次，透析6-8小時(shí)。
(3.3.4)將步驟(3.3.3)所得標(biāo)記物移入保存管，加入2% BSA和50%甘油，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> (3.3.5)將經(jīng)3.3.4步驟制得的Cpl83_SAE標(biāo)記物，按體積比1/500稀釋至吖啶酯標(biāo)記物稀釋緩沖液(含有20%小牛血清、I %酪蛋白、10%蔗糖、0.05%氨基比林的pH值為7.4的20mM Na2HP04/NaH2P04緩沖液溶液)，制成發(fā)光記物反應(yīng)液，混勻后2_8°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.4定量標(biāo)準(zhǔn)品
取已知濃度的Ant1-HBc高濃度樣本Pl (Ant1-HBc = 22083IU/mL)，以含20 %新生牛血清的PBS溶液進(jìn)行系列稀釋，分別稀釋至4000IU/mL，1333IU/mL 333IU/mL, 83.3IU/mL，20.8IU/mL，5.21 IU/mL, 1.30IU/mL，0.33IU/mL，0.08IU/mL，0.02IU/mL，0.005IU/mL 作為CLIA方法的定量標(biāo)準(zhǔn)品。
3.5Ant1-HBc 的 CLEIA 定量檢測(cè)
選取I份慢性乙型肝炎患者的血清(編號(hào)P2)按照下列步驟進(jìn)行Ant1-HBc的定量檢測(cè)。鑒于慢性乙型肝炎患者血清Ant1-HBc水平通常較高，我們將該標(biāo)本以含20%新生牛血清的PBS溶液稀釋成1: 500、I: 2500共2個(gè)稀釋度進(jìn)行定量CLIA檢測(cè)。P2標(biāo)本經(jīng)實(shí)施例1所述的Ant1-HBc ELISA定量方法檢測(cè)，確定其Ant1-HBc濃度為8069IU/mL。
(3.5.1)樣品反應(yīng):取50 μ L磁珠試劑加入反應(yīng)管,每孔再加入10 μ L標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻后，置于37°C溫箱反應(yīng)15分鐘。
(3.5.2)發(fā)光標(biāo)記物反應(yīng):完成3.5.1步驟后，將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)管用PBST洗液(20mM PB7.4,150mM NaCl，0.1% Tween20)洗滌 5 遍，每孔加入 50 μ L 如 3.3.5 步驟制備的發(fā)光標(biāo)記物反應(yīng)液，置于37°C溫箱反應(yīng)10分鐘。
(3.5.3)發(fā)光反應(yīng)和測(cè)量:完成3.5.2步驟后，將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1% Tween20)洗滌 5 遍，用 Sirius-L 單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀通過原位進(jìn)樣注入激發(fā)液，同時(shí)進(jìn)行光強(qiáng)檢測(cè)。
(3.5.4)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:完成3.5.3步驟后，對(duì)11個(gè)定量標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量值及其對(duì)應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制出如圖5的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖5可知，Ant1-HBc管式微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)(CLIA)方法能準(zhǔn)確定量的上限值為20.8IU/mL，下限值為0.02IU/mL,其線性動(dòng)力學(xué)范圍為3.02個(gè)數(shù)量級(jí)。由RLU測(cè)量值計(jì)算Ant1-HBc濃度的公式為:Conc.ant1-HBc (IU/mL) = 10(Logl0(ELU)XL 1409^861i 0
(3.5.5)待測(cè)樣品Ant1-HBc濃度的獲得:P2血清的系列稀釋樣本經(jīng)3.5.1-3.5.4的步驟測(cè)量后，其1: 500稀釋的RLU測(cè)量值為1571400、I: 2500稀釋的RLU測(cè)量值為380560 ;將上述測(cè)量值代入步驟3.5.4中獲得的Ant1-HBc濃度計(jì)算公式，其中1: 500測(cè)得的濃度值為16.16IU/mL, I: 2500測(cè)得的濃度值為3.204IU/mL,均落在本CLIA方法能準(zhǔn)確定量的線性動(dòng)力學(xué)范圍(0.02-20.8IU/mL)。據(jù)此如以1: 500的測(cè)量值計(jì)算，該樣本的原始Ant1-HBc濃度為16.16X500 = 8078IU/mL ;而如以1: 2500的測(cè)量值計(jì)算，該樣本的原始Ant1-HBc濃度為3.204X2500 = 8010IU/mL。兩個(gè)測(cè)量值的平均濃度為8044IU/mL，該濃度值與采用ELISA方法測(cè)得的該標(biāo)本的濃度值8069IU/mL的誤差為3.1%，屬于正常偏差范圍內(nèi)。
4、不同時(shí)期的HBV感染者血清Ant1-HBc水平的分布情況
4.1橫斷面病人血清標(biāo)本的選擇
本發(fā)明中，為研究不同時(shí)期的HBV感染者血清Ant1-HBc水平的分布情況，共收集350例既往HBV感染恢復(fù)的健康人血清標(biāo)本和488例慢性乙肝攜帶的病人血清標(biāo)本，所有血清標(biāo)本均分離血清后，儲(chǔ)存于-80°C。488例病人中，109例為原發(fā)性肝癌病人，63例為肝硬化病人，其余316例為單純的慢性乙肝病人，所有的病人均排除了同時(shí)伴有丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染的可能性，也無同時(shí)伴有自身免疫性或代謝性肝臟疾病的臨床醫(yī)學(xué)證據(jù)。
依據(jù)歐洲肝臟病協(xié)會(huì)2009年慢性乙肝臨床管理指南，將316例單純的慢性乙肝病人劃分為不同感染階段。其中52例病人處于免疫耐受期(immune tolerance phase, IT),其特征是年齡小于35歲，HBeAg陽(yáng)性，血清HBV DNA載量大于5 X 107copies/mL，ALT水平在過去12個(gè)月的時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)均小于正常值上限(ULN，在本發(fā)明中指40U/L) ;104例病人處于免疫清除期(immune clearance phase, IC),其特征是HBeAg陽(yáng)性,血清HBV DNA載量大于I X 104copies/mL, ALT水平大于2倍ULN ；75例病人處于低復(fù)制期(low-replicativephase, LR)，其特征是HBeAg陰性，血清HBV DNA載量小于I X 104copies/mL, ALT水平在過去12個(gè)月的時(shí)間內(nèi)的檢測(cè)均小于ULN ；85例病人處于HBeAg陰性的肝炎期，其特征是HBeAg陰性，血清HBV DNA載量大于2X 104copies/mL，ALT水平大于2倍ULN。
4.2臨床檢驗(yàn)方法
病人血清ALT水平和其他肝功能生化指標(biāo)在標(biāo)本采集后24小時(shí)后測(cè)定；血清HBVDNA載量和HBV基因型檢測(cè)采用文獻(xiàn)報(bào)告的方法進(jìn)行；HBsAg定量采用北京萬泰生物藥業(yè)公司的HBsAg化學(xué)發(fā)光定量試劑盒；HBeAg, Ant1-HBe的測(cè)定采用美國(guó)雅培公司的Architect化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)。
4.3病人血清標(biāo)本的Ant1-HBc定量
采用如本發(fā)明實(shí)施例1、或?qū)嵤├?、或?qū)嵤├?中所述的方法進(jìn)行。
4.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
分組連續(xù)變量的比較米用unpaired t-test或Kruskal-WallisANOVA,分類變量的組間比較采用Mantel-Haenszel x 2test或Fisher確切概率，Pearson test用于相關(guān)分析。診斷精確性分析采用受試者工作曲線(Receiver operating characteristic,ROC)并計(jì)算診斷效能(ROC曲線下面積，AUR0C)。P值小于0.05被視為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
4.4病人隊(duì)列的基本特征
4.1節(jié)中描述的HBV既往感染者及慢性HBV攜帶者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床病毒學(xué)及血液生物化學(xué)背景數(shù)據(jù)如表I所示。
權(quán)利要求
1.定量檢測(cè)乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平的試劑在制備用于監(jiān)控慢性乙型肝炎患者的病情發(fā)展和/或在慢性乙型肝炎患者接受抗乙型肝炎病毒治療前有效預(yù)測(cè)其治療效果的診斷劑中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的定量檢測(cè)通過如下方法中的一種或者幾種方法來實(shí)現(xiàn):酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法、時(shí)間分辨熒光檢測(cè)法、免疫比濁法、免疫層析法、免疫滲濾法。
3.權(quán)利要求1所述的用途，其中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平的單次檢測(cè)的線性動(dòng)力學(xué)范圍在1.5個(gè)數(shù)量級(jí)以上，亦即單次檢測(cè)準(zhǔn)確定量的上限值高于準(zhǔn)確定量的下限值32倍以上。
4.權(quán)利要求1所述的用途，其中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的定量檢測(cè)包括以下步驟: a)提供可與乙型肝炎病毒核心蛋白抗體特異性結(jié)合的乙型肝炎病毒蛋白，該蛋白可以是包含乙型肝炎病毒核心蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列(從第I位氨基酸到第183位氨基酸)，也可以是只包含乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的氨基酸序列(如從第I位氨基酸到第149位氨基酸)，該蛋白被固相化于固相化載體上，作為固相抗原，用于捕獲血清樣品中存在的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體； b)提供可與被捕獲到固相抗原上的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體特異性結(jié)合的抗原標(biāo)記物，該蛋白可以是包含乙型肝炎病毒核心蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列(從第I位氨基酸到第183位氨基酸)，也可以是只包含乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)的氨基酸序列(如從第I位氨基酸到第149位氨基酸)，所標(biāo)記的信號(hào)產(chǎn)生物可以是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或吖啶酯； c)提供用于繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度的定量標(biāo)準(zhǔn)品，通常為3-6份含不同濃度的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體的樣品組成。濃度的單位可以是IU/mL，PEIU/mL，也可以是其他可以朔源的濃度或滴度單位； d)樣品(待測(cè)樣品或定量標(biāo)準(zhǔn)品)與固相抗原相互接觸，使得樣品中的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體， 如果存在的話，被捕獲，形成固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體復(fù)合物； e)使抗原標(biāo)記物與步驟c)的產(chǎn)物，即固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體復(fù)合物相互接觸，從而形成固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體-抗原標(biāo)記物復(fù)合物； f)使底物或能激發(fā)信號(hào)產(chǎn)生的溶液也步驟e)形成的固相抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗體-抗原標(biāo)記物復(fù)合物相互接觸，從而生產(chǎn)可測(cè)量的信號(hào)，并以相應(yīng)的測(cè)定儀器測(cè)定所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度； g)將測(cè)量得到的定量標(biāo)準(zhǔn)品(通常為3-6份)的信號(hào)，與其對(duì)應(yīng)的濃度值進(jìn)行線性回歸擬合，獲得由測(cè)量信號(hào)計(jì)算樣品濃度的數(shù)學(xué)公式； h)將待測(cè)樣品測(cè)量得到的信號(hào)，引入步驟g)中得到的公式，從而計(jì)算出待測(cè)樣品含有的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體濃度； i)如果步驟h)中計(jì)算出的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體濃度高于檢測(cè)方法能準(zhǔn)確定量的量值上限，則需對(duì)待側(cè)樣品進(jìn)行稀釋，重復(fù)步驟a)到h)，直至測(cè)定的濃度值落在相應(yīng)檢測(cè)方法能準(zhǔn)確定量的量值上限和量值下限之間。待測(cè)樣品含有的乙型肝炎病毒核心蛋白抗體濃度由稀釋后測(cè)量值X對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算獲得。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的用途，所述診斷劑用于在接受不同治療藥物的慢性乙型肝炎病人中，所述藥物包括:長(zhǎng)效干擾素(聚乙二醇化的干擾素，Peginterferon)、普通干擾素(Interferon)、拉米夫定(lamivudine,LMV)、阿德福韋酯(adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韋(Entecavir, ETV)、替比夫定(Telbivudine, LdT)、替諾福韋(Tenofovir)或其他可用于慢性乙型肝炎治療的藥物。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的用途，其中在治療前預(yù)測(cè)病人治療療效的通常準(zhǔn)則是:治療前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平高的病人治療所獲療效(應(yīng)答率)高于治療前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平低的病人；治療療效的判定標(biāo)準(zhǔn)可以是乙型肝炎病毒E抗原血清轉(zhuǎn)換(即接受治療的慢性乙肝患者由HBeAg(+)/Ant1-HBe (-)的狀態(tài)改變?yōu)镠BeAg (-)/Ant1-HBe (+))，也可以是病毒學(xué)應(yīng)答(即慢性乙肝患者血清HBV DNA載量降至lOOOCopies/mL以下)，還可以是其他能指示病情緩解或良好預(yù)后的臨床指標(biāo)。
7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的用途，其中監(jiān)控慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展的通常準(zhǔn)則是:乙型肝炎病毒核心蛋白抗體水平的異常升高指示病人肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生和宿主抗乙型肝炎病毒特異性免疫應(yīng)答的活化。
8.Ant1-HBc用于制備用來評(píng)估慢性乙型肝炎患者接受阿德福韋酯和聚乙二醇干擾素的治療應(yīng)答情況的試劑盒的用途。
9.Ant1-HBc用于制備用來監(jiān)控慢性乙肝患者病情發(fā)展的試劑盒的用途。
10.Ant1-HBc用于制備 用來預(yù)測(cè)乙肝患者疾病階段的試劑盒的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及Anti-HBc定量檢測(cè)方法及其在監(jiān)控慢性乙肝患者病情發(fā)展和預(yù)測(cè)治療療效中的用途，其涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)檢測(cè)及乙型病毒性肝炎臨床診斷領(lǐng)域，更具體地涉及通過定量檢測(cè)乙型肝炎病毒核心蛋白抗體(Antibodies against hepatitisB core protein，Anti-HBc)，監(jiān)控慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展，并有效預(yù)測(cè)慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B)患者接受抗乙型肝炎病毒治療(特別是基于干擾素的治療和基于核苷/核苷酸類似物抗HBV藥物的治療)的療效，從而指導(dǎo)病人進(jìn)行合理藥物選擇的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103217533SQ201210019389
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月21日
發(fā)明者袁權(quán), 宋瀏偉, 周文彬, 翁祖星, 徐飛海, 葛勝祥, 張軍, 夏寧邵 申請(qǐng)人:廈門大學(xué), 廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司