專利名稱：利用骨髓細胞生物標記診斷癌癥的制作方法
利用骨髓細胞生物標記診斷癌癥概述本發(fā)明涉及骨髓細胞生物標記用于腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)的鑒別診斷、預后和監(jiān)測。本發(fā)明還涉及對腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)治療效果的監(jiān)測，以及確定腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)治療效果的預后。本發(fā)明還涉及在上述方法中使用的細胞生物標記面板，尤其是用于測量上述生物標記的多色面板。考慮到本發(fā)明的目的，文中引用的所有參考文獻通過引用的方式被完整地并入本文。
背景技術：
在歐洲，腎細胞癌(RCC)是男性中第七大最常見的惡性腫瘤，每年在男性中新增29，600病例(占全部癌癥的3.5%)。在女性中，每年有16，700例(在全部癌癥中排名第十二位或占全部癌癥的2.3%)。RCC在40歲之前很少見。超過這個年齡后，男性患病率是女性的兩倍。隨著年齡增長，發(fā)病率迅速攀升，從每年40歲以下的100，000人中少于兩例患者到每年65 - 69歲年齡段的100，000人中有38例患者。此后，每年上升到75歲以上的100，000人中有46例患者。共有25 - 30%的RCC患者在首發(fā)癥狀時出現(xiàn)明顯的轉移。大約三分之一的腎癌患者會隨著時間推移而患轉移性疾病。因此，在所有RCC患者中，有將近50 - 60%的患者最終會出現(xiàn)轉移性疾病。在轉移性疾病患者中，約75%的患者有肺轉移瘤，36%的患者有淋巴結和/或軟組織受累，20%的患者累及骨骼，18%的患者累及肝臟。與五年存活率分別為82%和100%的膀胱癌或前列腺癌相比，RCC是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中最致命的癌癥，其五年存活率為65% (根據(jù)美國1972-2001年的數(shù)據(jù))。在歐洲，腎癌診斷(1990-1994)后的平均五年存活率(截至1999年)大約是58%，RCC被幾位論文作者歸類為僅中度預后的癌癥?？偟膩碚f，RCC對近80%的患者有致命性。這個數(shù)據(jù)表明，對有效和早期的臨床隨訪和復發(fā)治療有強烈的醫(yī)療需求。美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)已經根據(jù)ITM分類確立了 RCC的分期。(腎臟，《2002年美國癌癥聯(lián)合委員會，腎細胞癌的TNM分類》)。腎細胞癌的分期系統(tǒng)是基于腫瘤在腎臟外的擴散程度。存活率在很大程度上取決于腫瘤是在哪一分期診斷出來的:對于有遠處轉移病變的患者，其5年存活率僅為12% ;而對于患有局部惡性腫瘤的患者，其5年存活率為80%。在全球，結腸直腸癌(CRC)是第三大常見癌癥。結腸直腸癌患者每年大約新增一百萬例，與大多數(shù)其他腫瘤不同，其男性和女性患者數(shù)量并無顯著區(qū)別(比例為1.2:1)。在歐洲，CRC是第二大常見癌癥，也是男性和女性第二大常見癌癥相關死因，每年新增約380，000例，疾病相關的死亡約為每年200，000例。2002年，男性和女性的原始發(fā)病率分別為 88.3/100，000 和 84.0/100，000，原始死亡率分別為 34.8/100，000 和 35.2/100，000。這些數(shù)據(jù)清楚地反映了 CRC作為個人和社會負擔一大來源的重要性。CRC是一種老年人癌癥，因為男性和女性病癥表現(xiàn)的平均年齡分別是69和75歲。除了飲食和生活方式因素(如月巴胖、缺乏身體鍛煉、吸煙、經常飲酒)外，其他危險因素是CRC的家族性發(fā)病、遺傳性CRC (家族性腺瘤性息肉病[FAP]、衰減型FAP[衰減型腺瘤性息肉??；AAPC]、遺傳性非息肉病性結腸直腸癌[HNPCC]、錯構瘤息肉綜合癥)和炎性腸疾病，例如潰瘍性結腸炎或克羅恩病。CRC主要表現(xiàn)為直腸、乙狀結腸、橫結腸/降結腸和升結腸/盲腸黏膜上的腺癌。早期結腸直腸癌可以通過一期手術治愈。但是，遠處轉移擴散到局部淋巴結和肝、肺以及其他器官(如CNS)。因為具有非特異性癥狀，CRC經常在相對晚期被診斷出來，約有25%的CRC患者會在第一次就醫(yī)時有轉移性疾病(mCRC)。在新診斷出患有局部可切除CRC的患者中，另外有30%的患者隨后會出現(xiàn)轉移復發(fā)。除了 Dukes系統(tǒng)外，通常使用AJCC制定的ITM系統(tǒng)(2002年最新版本)來對CRC進行分期。該系統(tǒng)是根據(jù)原發(fā)腫瘤浸潤深度、是否有區(qū)域淋巴結轉移以及是否有遠處轉移來劃分癌癥的。因為產生的類別數(shù)量可能會非常大，所以按照I至IV期對各種類別進行分組。最近，III期被進一步細分為IIIA到IIIC期，因為這些分期被確定為顯著的獨立預后變量。在過去的三十年里，癌癥相關死亡率持續(xù)下降。與此同時，男性和女性的總體5年存活率提高到63%。該存活率的提高在很大程度上可能歸功于手術治療的改善、局部高危疾病的輔助治療和晚期轉移性疾病的綜合治療。髓源性抑制細胞(MDSC)是描述具有免疫抑制特性骨髓細胞其幾個細胞亞群的術語。經過討論，這些免疫抑制特性被認為與癌癥免疫編輯生物學有關。髓源性抑制細胞(MDSC)在實驗模型和患者中促成腫瘤誘導的免疫紊亂。在荷瘤小鼠中，MDSC是表型異質細胞，其表面標記不同，這可能取決于不同腫瘤在不同成熟階段產生的可溶性因子，以及在癌癥患者中非常有效地抑制T細胞功能。眾所周知，生長中的腫瘤刺激骨髓細胞生成，并通過產生生長因子和細胞因子來影響細胞分化。Lechner 等，(在:Lechner MG, Liebertz DJ, Epstein AL,正常人外周血單核細胞的細胞因子誘導髓源性抑制細胞的特性研究?！睹庖邔W雜志》，2010年8月15日；185(4): 2273-84。電子版2010年7月19日)中描述癌癥患者的MDSC增加與病情更嚴重和預后差有關。借助于RT-PCR，對MDSC-誘導人實體瘤細胞系15種免疫因子(TGFP、IL_13、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF, M-CSF, IDO、fms-相關酪氨酸激酶 3 配體、c-kit 配體、誘導型NO合酶、精氨酸酶-UTNF-a、環(huán)氧合酶2、血管內皮生長因子[VEGF])的表達進行評估。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，然后通過測量⑶3/⑶28刺激后細胞因子混合物抑制增殖、IFN-Y產生、新鮮人自體T細胞的能力，來檢測它們在體外利用健康供者PBMC產生抑制性CD33 (+)細胞的能力。論文作者認為某些細胞因子是抑制癌癥患者體內MDSC誘導的潛在治療靶點。Allan (在2008年11月的《自然:免疫學綜述》第8卷828期中)描述髓源性抑制細胞(MDSC)是異質性免疫細胞群體，它在荷瘤寄主中累積并對炎癥產生反應。盡管已經確定MDSC抑制T-細胞反應能夠防止腫瘤排斥，但是引起MDSC累積和抑制功能的機制并不清
/E.0盡管在RCC和CRC診斷和治療方面取得了上述最新進展，但是為了進一步提高存活率和更好地調整患者的治療，仍然需要能夠用來提高診斷、尤其是鑒別診斷、預后、療效監(jiān)測、了解腎細胞癌(RCC)和/或結腸直腸癌(CRC)最佳療程的生物標記。此外，標記也應該考慮到上述對腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)的治療效果的預后。因此，本發(fā)明的目的是提供各自的生物標記以及診斷、預后和預測方法。
本發(fā)明的詳細說明在本發(fā)明的第一個方面，上述目的是通過提供診斷和/或預后癌癥的方法來實現(xiàn)的，包括根據(jù)至少一個髓源性抑制細胞(MDSC)表型標記，確定樣品中MDSC群體至少一個MDSC表型的水平。該樣品中含有來源于患者的外周血單核細胞(PBMC)，其中上述標記是從一組 CD15、IL4Ra、CD14、CDllb, HLA-DR, CD33、Lin、FSC、SSC 標記和可選的 CD45、CD18、⑶80、⑶83、⑶86、HLA-1標記以及存活/死亡識別子中選出的，其中與非癌癥患者樣品進行比較，上述MDSC表型水平升高表明癌癥和/或上述癌癥治療的預后指標。上述所有標記都是已知處于先進行列。關于存活/死亡識別子，活細胞有完整的細胞膜，染料如碘化丙啶(PI)不能滲透，只能透入細胞膜受損傷的細胞。噻唑橙*(T0)是一種滲透染料，不同程度地進入所有細胞，包括活細胞和死細胞。對于革蘭氏陰性菌，用EDTA去除脂多糖層可以大大促進TO吸收。因此，這兩種染料組合為辨別活細胞和死細胞提供了一種快速可靠的方法。如果細菌計數(shù)很重要，那么BD液體計數(shù)微球(加利福尼亞州圣何塞的BD生物科學公司)，一種流式細胞儀微珠標準，可以用來準確定量樣品中活菌、死菌和細菌總數(shù)。在文中對其他存活/死亡識別子進行了介紹或已知它們處于先進行列，例如在下面文獻中進行描述，Perfetto 等(Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Lamoreaux L, NguyenR, Ambrozak D, Koup RA, Roederer M.胺活性染料:一種在多色流式細胞儀中辨別活細胞和死細胞的有效工具?！睹庖邔W方法雜志》，2006年6月30日:313(1-2): 199-208。電子版2006年5月19日。)Peranzoni等，在“髓源性抑制細胞異質性和亞群定義”，《免疫學新見》，第22卷，第2期，電子版2010年2月，第238-244頁中提到的⑶15+/⑶IIB+/⑶14-群體在腎細胞癌患者中觀察到。提到健康供者缺少不同群體(⑶14+⑶llb+HLA-Drlo/neg)。此外，疫苗計劃監(jiān)測顯示不同群體(⑶IIb+⑶33+⑶15+)。顯示了不同群體(Lin-HLA-DR-⑶33+⑶IIb+)在患者中顯著增加，以及I到IV期的趨勢。S.Kusmartsev等，在“膀胱癌患者⑶Ilb (+)CD33(low)CD15 (高)免疫抑制骨髓細胞群體的擴增”，《美國癌癥研究協(xié)會會議錄》年度會議，第51卷，2010年4月，第1291-1292頁中，披露了與健康供者相比，癌癥存在不同群體(⑶Ilb+⑶15hi⑶331o)的升高。除此之外，僅顯示了在體外有助于免疫抑制。在W02010/055340A1中，據(jù)報道與健康供者相比，癌癥患者的⑶11+⑶15+群體增加。在Ko等，“舒尼替尼介導逆轉腎細胞癌患者中髓源性抑制細胞的累積”，《臨床癌癥研究》，第15卷，第6期，2009年3月，第2148 - 2157頁中，與健康對照供者相比，顯示兩個MDSC群體(⑶14-⑶15+和⑶33+HLA-DR-)增加。所有這些論文可能僅對MDSC群體有一般性診斷價值，而沒有預后或預測價值。劉建迎等，在“晚期非小細胞肺癌患者CDllb(+)/CD14(_)/CD15(+)/CD33(+)髓源性抑制細胞和CD8 (+) T淋巴細胞表達的1-精氨酸酶和誘生型一氧化氮合酶群體改變”，《癌研究與臨床腫瘤學雜志》，第136卷，第I期，2010年I月，第35-45頁中披露NSCLC患者的⑶Ilb+/⑶14-MDSC水平與健康對照受試者相比升高。如果患者從之前的化療中受益，那么NSCLC患者的CDllb+/CD14-MDSC水平降低(PR+SD對比I3D:圖5A)。但是，該項分析是在臨床進展之后進行的，因此不能推斷出其預后價值。此外，該細胞群的CD15+和CD33的表達沒有用于分析。M Diaz-Monteix)等，在“增加循環(huán)的髓源性抑制細胞與臨床癌癥分期、轉移瘤負荷和阿霉素-環(huán)磷酰胺化療相關聯(lián)”，《腫瘤免疫與免疫治療》，第58卷，第I期，2009年I月，第49-59頁中，顯示新診斷(各種)癌癥患者的MDSC水平與健康供者相比升高(圖2A)。高MDSC水平和較高的腫瘤分期有關(圖2B-C)。在IV期患者中，有較高腫瘤負荷的患者具有較高的MDSC水平(圖3)。圖5表明MDSC水平受不同化療類型的影響。但是，從這些數(shù)據(jù)不能推斷出治療反應的預測價值。S Mandruzzato等，在“癌癥患者的IL4Ra (+)髓源性抑制細胞擴增”，《免疫學雜志》，第182卷，第10期，2009年5月，第6562-6568頁中顯示與健康供者相比，以下細胞群體CD14+(圖5A)，CD15+(圖5B)，IL4Ra+/CD14+(圖2A)在患者的PBMC中增加。結腸癌和黑色素瘤組織中的⑶14+細胞顯示與腫瘤有關(圖5C-D)。這些數(shù)據(jù)通常只對MDSC群體有診斷價值，沒有預后或預測價值。最后，S Kusmartsev等，在“轉移性腎細胞癌患者骨髓細胞介導的免疫抑制的逆轉”，《臨床癌癥研究》，第14卷，第24期，2008年12月，第8270 - 8278頁中顯示與健康供者相比，RCC患者的PBMC中的Lin-HLA-DR-細胞群體增加(

圖1B)。文章還顯示一個Lin-HLA-DR樣品中有⑶33表達。這些數(shù)據(jù)通常只對MDSC群體有診斷價值，沒有預后或預測價值。—般來說，本發(fā)明不限于特定的癌癥或癌癥分期。然而，根據(jù)本發(fā)明首選的是方法，其中上述癌癥是一種可以用免疫療法治療的癌癥，最好是從腎細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胃癌(GC)、黑色素瘤和腺癌中選擇。在本發(fā)明背景下分析的樣品可以是任意含有來自受試者(如患者、非癌癥患者或健康個體)的MDSC的生物樣品。上述樣品最好是血液樣品，如全血、凍存全血、外周血或其中的一部分，最好是去除血沉黃層的外周血單核細胞(PBMC)。同樣地，從任意這些樣品中可以獲得RNA。而且，骨髓細胞也可以從腫瘤組織或骨髓中分離出來。本發(fā)明是基于一個驚人的發(fā)現(xiàn)，那就是治療前的MDSC水平是癌癥治療患者免疫和/或其他臨床反應的一個相關生物標記，諸如用抗癌疫苗，如IMA901-202 (如在2007年6月2日至5日芝加哥舉行的美國臨床腫瘤學會(ASCO)年度會議上介紹的)或文中所述的其他IMA-疫苗治療的免疫療法患者。本發(fā)明還公開了在癌癥患者尤其是RCC患者中，健康供者與RCC患者之間不同亞組之間治療前MDSC水平不同(所有患者，+Cy, -Cy,治療之前細胞因子、TK1、索拉非尼、舒尼替尼)。因此，本發(fā)明涉及癌癥(尤其是RCC和CRC)的診斷、預后和預測標記，以及測量上述生物標記的多色面板。骨髓細胞來源于骨髓干細胞，其包括紅細胞、血小板、中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞以及肥大細胞。在本發(fā)明背景下，在PBMC分析之后，對人類MDSC的六個表型(MDSC1-6)進行識別和定義，如表I所示。表1:主要出版物報道的在PBMC中發(fā)現(xiàn)的人類MDSC表型
權利要求
1.診斷和/或預測癌癥的方法，包括 根據(jù)至少一種MDSC表型標記，確定患者生物樣品中MDSC群體的至少一種髓源性抑制細胞(MDSC)表型的水平， 其中上述標記是從含有 CD15、IL4Ra、CD14、CDllb、HLA-DR、CD33、Lin、FSC、SSC 和可選的⑶45、⑶18、⑶80、⑶83、⑶86、HLA-1、存活/死亡識別子的一組中選出的。
其中，與非癌癥患者樣品相比，上述MDSC表型水平升高，表明是癌癥和/或上述癌癥治療的預后指標。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中上述癌癥是從腎細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胃癌(GC)、黑色素瘤和腺癌中選出的。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法中，上述MDSC表型是從基于標記IL4Ra+和⑶14+的MDSC1，基于標記IL4Ra+和CD15+的MDSC2，基于標記IL4Ra+的MDSCl或MDSC2、基于標記Lin-,HLA-DR-和 CD33+及可選的 CD18+和 HLAI+ 的 MDSC3，基于標記 CD14+、HLA_DR(-/lo)、FSChi 和 SSCim 的 MDSC4，基于標記 CDl lb+、CD14-、CD 15+ 及可選的 FSCh1、SSCim, CD80-、CD83-、CD86-和 HLA-DR-的 MDSC5 以及基于 CD15+; FSClo 和 SSChi 的 MDSC6 中選出的。
4.根據(jù)權利要求1至3任意一個的方法，其中上述方法包括含有單一多色染色步驟的流式細胞術。
5.根據(jù)權利要求1至4中任意一個的方法，進一步包括治療的預后，其中與上述樣品中治療前MDSC水平相比升高的上述MDSC表型水平和較短的總存活期、腫瘤生長或無進展存活期有關。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其中上述MDSC表型是從MDSC2、MDSC3、MDSC4、MDSC5和MDSC6中選出的。
7.根據(jù)權利要求1至6的任意一個的方法，其中上述MDSC表型是選自RCC或CRC患者的MDSCl和/或MDSC2 ；II1-1V期RCC患者的MDSC3 ；IV期黑色素瘤患者的MDSC4 ;最好是轉移性RCC患者的MDSC5 ；以及轉移性腺癌患者的MDSC5。
8.根據(jù)權利要求1至7的任意一個方法，其中上述生物樣品是從含有外周血單核細胞(PBMC)諸如全血、外周血或其中部分、血沉棕黃層、腫瘤組織和骨髓的樣品中選出的。
9.檢測患者癌癥治療效果的方法，包括根據(jù)權利要求1至8中任意一個的方法，確定取自正在接受癌癥治療患者的生物樣品中至少一種髓源性抑制細胞(MDSC)表型的水平，其中與非癌癥患者樣品相比，確定的上述MDSC表型水平降低，表明有效治療上述患者的上述癌癥。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中上述患者正在治療或已經用從細胞因子、索拉菲尼、舒尼替尼、環(huán)磷酰胺和酪氨酸激酶抑制劑(TKI)中選出的抗癌藥進行了預先治療。
11.根據(jù)權利要求10的方法，還包括患者癌癥治療效果的預后，其中上述患者正在治療或已經用環(huán)磷酰胺預先治療過，與未治療或預先治療的患者樣品相比，MDSC5表型水平下降，表明有效治療上述患者的上述癌癥。
12.根據(jù)權利要求9至11任意一個的方法，還包括對上述患者的上述癌癥治療效果的監(jiān)測，包括至少重復一次上述決定步驟。
13.根據(jù)權利要求 9-12任意一個的方法，其中上述癌癥治療是從化療和/或最好包括抗癌疫苗使用的免疫療法以及可選的GM-CSF中選出的。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其中上述抗癌疫苗是從含有致免疫肽混合物的抗癌疫苗中選出的，致免疫肽含有從SEQ編號I至10，SEQ編號11至19及1、5、8和9，SEQ編號20至29和SEQ編號30至37中選出的序列。
15.診斷試劑盒，在一個或分別的容器內，含有用于執(zhí)行權利要求1至14任意一個的方法的材料，至少含有⑶15、IL4Ra、⑶14、⑶lib、HLA-DR、⑶33、Lin和⑶45，以及可選的⑶18、⑶80、⑶83、⑶86和HLA-1的一種特異性抗體，可選擇性地與說明書一起用于執(zhí)行上述方法。
16.根據(jù)權利要求15的診斷試劑盒，其中抗體用從Q605、V450、AF700、APC-H7、Cy7和FITC中選出的血細胞計數(shù)標記進行標注。
17.根據(jù)權利要求15或16的診斷試劑盒至少包括從CD45Q605、CD15V450、CD124PE、CDllb AF700、CD14APC-H7、CD33PE-Cy7、CD3FITC、CD19FITC、CD56FITC 和 CD14FITC 中選出的一種抗體。
18.在癌癥患者中誘導免疫反應的方法，包括 a)給上述癌癥患者使用抗癌疫苗， b)在生物樣品中執(zhí)行權利要求1至8任意一個的方法，生物樣品取自上述正在接受癌癥治療的患者，其中與患者樣品相比，確定的上述MDSC表型水平下降，表明癌癥患者的免疫反應誘導。
c)可選的是，根據(jù)步驟b)獲得的結果重復步驟a)。
19.治療有需要的癌癥患者的癌癥治療的改進方法，其中包括給上述癌癥患者進行適當?shù)目拱┲委?，與患者樣品在上述治療之前相比，通過使用權利要求1至8任意一個的方法確定的生物樣品中至少一個上述MDSC的表型水平下降，生物樣品取自正在接受癌癥治療的患者。
20.治療有需要的癌癥患者的癌癥治療的改進方法,包括 a)給上述癌癥患者使用抗癌疫苗， b)在生物樣品中執(zhí)行權利要求1至8任意一個的方法，生物樣品取自上述正在接受癌癥治療的患者，其中與患者治療前的樣品相比，確定的上述MDSC表型水平下降，表明治療上述癌癥患者的上述癌癥。
c)可選，根據(jù)步驟b)獲得的結果重復步驟a)。
21.權利要求18至20任意一個的方法還包括對上述癌癥患者免疫反應和/或治療的監(jiān)測，包括至少重復一次步驟b)和可選的步驟C)。
22.根據(jù)權利要求18至21中任意一個的方法，其中上述患者得到進一步治療或已經用從抗癌藥、細胞因子、索拉菲尼、舒尼替尼、環(huán)磷酰胺和酪氨酸激酶抑制劑(TKI)化療中選出的抗癌藥進行過預先治療。
23.根據(jù)權利要求18至22中任意一個的方法，其中上述癌癥是從腎細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、胃癌(GC)、黑色素瘤和腺癌中選出的。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨髓細胞生物標記用于腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)的鑒別診斷、預后和監(jiān)測。本發(fā)明還涉及對腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)治療效果的監(jiān)測以及確定腎細胞癌(RCC)或結腸直腸癌(CRC)治療效果的預后。本發(fā)明還涉及在上述方法中使用的細胞生物標記面板，尤其是用于測量上述生物標記的多色面板。
文檔編號G01N33/574GK103180739SQ201180045200
公開日2013年6月26日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權日2010年9月21日
發(fā)明者哈普利特·辛格, 斯特芬·沃爾特, 蕾吉娜·門德日克, 文森佐·勃朗特, 蘇珊娜·曼德魯扎托 申請人:伊瑪提克斯生物技術有限公司