專(zhuān)利名稱(chēng)：親和色譜用填充劑以及離析免疫球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和色譜用填充劑以及離析免疫球蛋白的方法。尤其是，涉及對(duì)免疫球蛋白純化有用的結(jié)合有特定配體的親和色譜用填充劑以及離析免疫球蛋白的方法。
背景技術(shù)：
親和色譜是將與以分離、純化為目的的物質(zhì)特異性地結(jié)合的物質(zhì)(配體)固定于不溶性載體，并使用填充有所得配體固定化載體的柱的色譜，例如可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物體相關(guān)物質(zhì)的分離、純化(日本特開(kāi)平6-281638號(hào)公報(bào))。作為親和色譜用填充劑的載體，例如使用由瓊脂糖凝膠所代表的糖鏈的交聯(lián)粒子、以合成聚合物為主成分的粒子。然而，在生物分離的用途中，通常重復(fù)使用填充劑。但是，純化操作后在填充劑內(nèi) 還殘留有微量的夾雜物，因此通常進(jìn)行作為就地清洗(CIP)而已知的操作。CIP中使用能夠從填充劑中溶出夾雜物的試劑(CIP劑)。作為該試劑，例如可以舉出氫氧化鈉等堿性液。在使用氫氧化鈉的情況下，可以有效地除去微生物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸之類(lèi)的夾雜物。專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)I:日本特開(kāi)平6-281638號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
但是，利用堿性液從填充劑中除去夾雜物時(shí)，填充劑被暴露于堿性條件下。就使用蛋白質(zhì)作為配體的親和色譜用填充劑而言，這樣的堿性條件過(guò)于苛刻，有時(shí)產(chǎn)生由配體的不穩(wěn)定化所致的結(jié)合容量降低。本發(fā)明的目的是提供耐堿性?xún)?yōu)異的親和色譜用填充劑以及離析免疫球蛋白的方法。就本發(fā)明的一種方式涉及的親和色譜用填充劑而言，由下述通式(I)表示的蛋白質(zhì)配體被固定于載體。R-R2.....(I)(式中，R表示由含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的4 300個(gè)氨基酸殘基形成的氨基酸序列(也稱(chēng)為“組氨酸連接子”)，R2表示由含有蛋白A的Z區(qū)域(以下，簡(jiǎn)稱(chēng)為“Z區(qū)域”)或其片段(Z片段)或者它們的變異體的50 500個(gè)氨基酸殘基形成的、可與免疫球蛋白結(jié)合的氨基酸序列(在這里，R2與R結(jié)合的末端是蛋白A的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域的C末端或N末端))其中，本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，蛋白A是指金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細(xì)胞壁成分蛋白A (Protein A)。在上述親和色譜用填充劑中，由上述通式(I)表示的蛋白質(zhì)配體中的氨基可以通過(guò)與具有環(huán)氧基的上述載體進(jìn)行環(huán)氧基開(kāi)環(huán)反應(yīng)而被固定化。這種情況下，上述載體可以含有取代2，3- 二羥基丙基作為開(kāi)環(huán)環(huán)氧基。
本發(fā)明的另一方式涉及的離析免疫球蛋白的方法包括如下工序用上述親和色譜用填充劑使免疫球蛋白吸附于上述填充劑的工序，使上述免疫球蛋白溶出的工序，以及用堿性液清洗上述填充劑的工序。在本發(fā)明中，“蛋白質(zhì)”是指具有肽結(jié)構(gòu)單位的所有分子，是包括例如將天然型蛋白質(zhì)的部分片段、天然型蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行人工改變而成的變異體的概念。另外，“免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域”表示單獨(dú)具有免疫球蛋白結(jié)合活性的多肽的功能單位，“免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)”表示對(duì)免疫球蛋白具有特異的親和性且含有“免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域”的蛋白質(zhì)?！懊庖咔虻鞍捉Y(jié)合”表示與免疫球蛋白分子的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)以外的區(qū)域、特別是Fe片段進(jìn)行結(jié)合。在本發(fā)明中，與親和色譜相關(guān)而被使用的用語(yǔ)“配體”表示與親和色譜的靶物質(zhì)結(jié) 合的分子。“蛋白質(zhì)配體”表示與上述靶物質(zhì)結(jié)合的部分是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的配體。根據(jù)上述親和色譜用填充劑，由于耐堿性?xún)?yōu)異，因此對(duì)堿性條件下的清洗具有高耐性。另外，在將上述親和色譜用填充劑用于例如免疫球蛋白的純化時(shí)，即使反復(fù)使用，免疫球蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量也難以下降，因此可以使得便宜的免疫球蛋白純化成為可能。


圖I是表示在本發(fā)明合成例2中制備的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SP4Z)的氨基酸序列的圖。圖2是說(shuō)明插入表達(dá)載體(pETM-11)的、編碼本發(fā)明合成例2的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA片段的構(gòu)成的圖。圖3是表示本發(fā)明的測(cè)定例2中的耐堿性評(píng)價(jià)結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式就本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及的親和色譜用填充劑而言，由下述通式(I)表示的蛋白質(zhì)配體被固定于載體。R-R2.....(I)(式中，R表示由含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的4 300個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(組氨酸連接子)，R2表示由含有蛋白A的Z區(qū)域(Z區(qū)域序列號(hào)I)或其片段(Z片段)或者它們的變異體的50 500個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的、可與免疫球蛋白結(jié)合的氨基酸序列。在這里，R與R2的C末端或N末端結(jié)合)I.親和色譜用填充劑I. I.載體I. I. I.構(gòu)成載體的形狀沒(méi)有特別限定，可以采用近球狀、包括粉體的粒子狀、包括中空纖維的纖維狀、膜狀等任意的形狀，但是從表面積大且制造也容易的方面考慮，優(yōu)選粒子的形狀。該粒子可以為多孔性，也可以為非多孔性。粒子狀的載體可以用作填充床，也可以以懸浮形態(tài)使用。懸浮形態(tài)包含流動(dòng)層(expanded bed,擴(kuò)張床)以及作為純粹懸浮物而已知的懸浮形態(tài)，粒子可以自由運(yùn)動(dòng)。在整體式、填充床和流動(dòng)層的情況下，分離順序一般按照根據(jù)濃度梯度的現(xiàn)有色譜法。在純粹懸浮物的情況下，使用分批法?；蛘?，載體可以是片、毛細(xì)管或膜之類(lèi)的形態(tài)。構(gòu)成本實(shí)施方式的親和色譜用填充劑的載體具有優(yōu)選為20 80 μ m、更優(yōu)選為30 60 μ m的粒徑(體積平均粒徑)。如果粒徑為20 μ m以上，則柱壓力在高流速下難以升高。如果粒徑為80 μ m以下，則蛋白質(zhì)配體、抗體等生物體相關(guān)物質(zhì)的結(jié)合容量難以下降。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明中的“粒徑”是指利用激光衍射散射式粒度分布測(cè)定裝置而得到的載體的體積平均粒徑。構(gòu)成本實(shí)施方式的親和色譜用填充劑的載體優(yōu)選為多孔，具有50 150m2/g、更優(yōu)選為80 120m2/g的比表面積。在這里,如果比表面積為50m2/g以上,則蛋白質(zhì)配體、抗體等生物體相關(guān)物質(zhì)的結(jié)合容量難以降低。另一方面，如果比表面積為150m2/g以下，則填充劑的強(qiáng)度優(yōu)異，在高流速下，填充劑難以被破壞，柱壓力的上升得到抑制。本發(fā)明中的“比表面積”是指將具有利用水銀孔隙率計(jì)得到的細(xì)孔徑為10 5000nm的細(xì)孔的載體的表面積除以載體的干燥重量而得到的值。
在本實(shí)施方式中，構(gòu)成親和色譜用填充劑的載體具有優(yōu)選為100 400nm、更優(yōu)選為200 300nm的體積平均細(xì)孔徑。在這里，如果體積平均細(xì)孔徑為IOOnm以上，則高流速下的結(jié)合容量下降得到抑制。另一方面，如果體積平均細(xì)孔徑為400nm以下，則不管流速如何，結(jié)合容量的下降都得到抑制。本發(fā)明中的“體積平均細(xì)孔徑”是指利用水銀孔隙率計(jì)得到的細(xì)孔徑為10 5000nm的細(xì)孔的體積平均細(xì)孔徑。在滿(mǎn)足上述范圍的粒徑、比表面積、及細(xì)孔徑分布時(shí)，成為純化對(duì)象溶液的流路的載體間的間隙及載體內(nèi)的細(xì)孔徑、與純化對(duì)象分子的結(jié)合表面積的平衡得到最優(yōu)化，高流速下的結(jié)合容量被維持在高水平。作為載體的材質(zhì)，例如是具有親水性表面的聚合物，例如是在外表面(以及在存在的情況下也在內(nèi)表面)具有羥基(-0H)、羧基(-C00H)、氨基羧基(-CONH2、或N取代型)、氨基(-NH2、或N取代型)、環(huán)氧基、低聚基團(tuán)或聚乙烯氧基的聚合物。聚合物在一個(gè)實(shí)施方式中是聚(甲基)丙烯酸酯、聚(甲基)丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物之類(lèi)的合成聚合物。該合成聚合物可以通過(guò)例如J. MATER. CHEM 1991，I (3)，371-374中記載的方法等公知的方法容易地制造?；蛘?，也可使用T0Y0PEARL (東曹公司)之類(lèi)的市售品。另一實(shí)施方式中的聚合物為葡聚糖、淀粉、纖維素、普魯蘭、瓊脂糖等多糖類(lèi)。該多糖類(lèi)可以通過(guò)公知的方法容易地制造,例如參照日本專(zhuān)利第4081143號(hào)記載的方法。或者,也可以使用Sepharose (GEHealthcare Bio Sciences公司)之類(lèi)的市售品。在其它實(shí)施方式中，也可以是二氧化娃、氧化鋯等無(wú)機(jī)載體。在本實(shí)施方式的親和色譜用填充劑中，作為載體使用的多孔性粒子的一個(gè)具體例，例如可以舉出多孔性有機(jī)聚合物粒子，該多孔性有機(jī)聚合物粒子含有20 50重量％的交聯(lián)性乙烯基單體、3 80重量％的含環(huán)氧基的乙烯基單體及20 80重量％的含二醇基的乙烯基單體的共聚物(其中，將各單體的合計(jì)量設(shè)為100重量％)，粒徑為20 80μπι，比表面積為50 150m2/g,體積平均細(xì)孔徑為100 400nm。應(yīng)予說(shuō)明，用水銀孔隙率計(jì)測(cè)定構(gòu)成本實(shí)施方式的親和色譜用填充劑的載體時(shí)的細(xì)孔徑為10 5000nm的細(xì)孔的浸入體積(細(xì)孔體積)優(yōu)選為I. 3 2. 5mL/g。I. I. 2.與配體的結(jié)合
作為載體與蛋白質(zhì)配體的結(jié)合方法，一般可以使用將蛋白質(zhì)固定于載體的方法來(lái)進(jìn)行。例如，使用具有羧基的載體，并使該羧基與利用N-羥基琥珀酸酰亞胺活化的蛋白質(zhì)配體的氨基進(jìn)行反應(yīng)的方法；使用具有氨基或羧基的載體，并在水溶性碳化二亞胺等脫水縮合劑的存在下使之與蛋白質(zhì)配體的羧基或氨基反應(yīng)而形成酰胺鍵的方法；使用具有羥基的載體，并用溴化氰等鹵化氰使之活化而與蛋白質(zhì)配體的氨基反應(yīng)的方法；或?qū)⑤d體的羥基進(jìn)行甲苯磺?；騎resyl化，并與蛋白質(zhì)配體的氨基反應(yīng)的方法；以及利用雙環(huán)氧化物(bisepoxide)、表氯醇等將環(huán)氧基導(dǎo)入載體中，并使之與蛋白質(zhì)配體的氨基、輕基或硫醇基反應(yīng)的方法；使用具有環(huán)氧基的載體，并使之與蛋白質(zhì)配體的氨基、羥基或硫醇基反應(yīng)的方法等。在本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)配體是由后述通式(I)表示的配體，優(yōu)選使用通過(guò)該蛋白質(zhì)配體中的氨基與載體所具有的環(huán)氧基結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)配體與載體結(jié)合的方法。優(yōu)選結(jié)合有配體的載體可以含有取代2，3-二羥基丙基作為開(kāi)環(huán)環(huán)氧基。該開(kāi)環(huán)環(huán)氧基可通過(guò)使上述載體與配體結(jié)合后，使剩余的環(huán)氧基開(kāi)環(huán)而得到。優(yōu)選在使用含有上述載體的本發(fā)明的填充劑之前，該載體的環(huán)氧基實(shí)質(zhì)上被全部開(kāi)環(huán)。 環(huán)氧基開(kāi)環(huán)而生成的開(kāi)環(huán)環(huán)氧基即醇性羥基發(fā)揮以下作用將載體表面進(jìn)行親水化、防止蛋白質(zhì)等的非特異吸附、并在水中提高載體的韌性、防止高流速下的載體的破壞。作為載體中的環(huán)氧基的開(kāi)環(huán)方法，例如可舉出在水溶劑中利用酸或堿在加熱或室溫下攪拌的方法。另外，也可用巰基乙醇、硫代甘油等具有巰基的封端劑，單乙醇胺等具有氨基的封端劑來(lái)使環(huán)氧基開(kāi)環(huán)。最優(yōu)選的開(kāi)環(huán)環(huán)氧基是利用硫代甘油使多孔載體中所含的環(huán)氧基進(jìn)行開(kāi)環(huán)而得到的開(kāi)環(huán)環(huán)氧基。硫代甘油作為原料與巰基乙醇等相比毒性低，加成有硫代甘油的環(huán)氧開(kāi)環(huán)基與利用具有氨基的封端劑的開(kāi)環(huán)基相比具有非特異吸附低，而且動(dòng)態(tài)結(jié)合量變高這樣的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)需要，可以在載體與配體之間導(dǎo)入任意長(zhǎng)度的分子(間隔區(qū))。作為間隔區(qū)的例子，可舉出聚亞甲基鏈、聚乙二醇鏈、糖類(lèi)等。I. 2.配體I. 2. I.免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)用于本發(fā)明的親和色譜用填充劑的蛋白質(zhì)配體可以是由上述通式(I)表示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。通過(guò)使該免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(以下，也稱(chēng)為“蛋白質(zhì)I”)例如與載體的環(huán)氧基反應(yīng)，從而可使之與載體結(jié)合。在上述通式(I)中，由R表示的氨基酸序列是由含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的4 300個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列。R所含的氨基酸殘基數(shù)優(yōu)選為8 100個(gè)，R所含的組氨酸連續(xù)的部位的組氨酸數(shù)優(yōu)選為4 8個(gè)。另外，在上述通式(I)中，R2是由含有蛋白A的Z區(qū)域(序列號(hào)I)或其片段或者它們的變異體的50 500個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的、能夠與免疫球蛋白結(jié)合的氨基酸序列。由R2表示的氨基酸序列所含的氨基酸殘基數(shù)優(yōu)選為120 480個(gè)。在上述通式(I)中，由R表示的氨基酸序列以及由R2表示的氨基酸序列中的至少一方可以含有區(qū)域t，上述區(qū)域t由含有選自賴(lài)氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的I種氨基酸的I 50個(gè)氨基酸構(gòu)成。在這種情況下，上述氨基酸序列中可含有多個(gè)相同或不同的區(qū)域t。另外，在上述通式(I)中，R-優(yōu)選為由下述通式(2)表示的基團(tuán)。
R1T-.....(2)(式中，R1表示由含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的4 100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列(在這里，在R1中，上述組氨酸連續(xù)的部位的末端與r結(jié)合)，r表示由7 200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的任意的氨基酸序列)在上述通式(2 )中，由R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸殘基數(shù)優(yōu)選為4 25個(gè)，R1所含的組氨酸連續(xù)的部位的組氨酸數(shù)優(yōu)選為4 8個(gè)，由r表示的氨基酸序列所含的氨基酸殘基數(shù)優(yōu)選為10 50個(gè)。另外，上述通式(2)所示的r表示的氨基酸序列中可以含有TEV剪切部位。在本發(fā)明中，“TEV剪切部位”是指能夠由TEV(煙草蝕紋病毒，Tobacco Etch Virus)蛋白酶作為特異性剪切部位進(jìn)行識(shí)別的氨基酸序列，但不要求實(shí)際上能夠由TEV蛋白酶所剪切。另 夕卜，在r表示的氨基酸序列中可含有TEV區(qū)域的變異體(與是否能夠用該TEV蛋白酶剪切無(wú)關(guān)地，與TEV剪切部位的氨基序列具有70%以上、優(yōu)選為90%以上的同源性)。構(gòu)成蛋白質(zhì)I的氨基酸殘基的總個(gè)數(shù)為54 800,使之與載體結(jié)合時(shí)，優(yōu)選為80 600。I. 2. I. I.免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域在上述通式(I)中，R2表示包含免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列。該氨基酸序列包含選自蛋白A的Z區(qū)域(Z區(qū)域)、其片段(Z片段)、以及它們的變異體中的至少I(mǎi)個(gè)氨基酸序列。關(guān)于Z區(qū)域,被記載于Nilsson B.等,Protein engineering, 1987年，第I卷,2號(hào)，107-113頁(yè))。Z區(qū)域由用序列號(hào)I表示的氨基酸序列構(gòu)成。Z片段是指具有Z區(qū)域的氨基酸序列的一部分的片段，例如優(yōu)選為具有Z區(qū)域的氨基酸序列的90%以上的片段，更優(yōu)選為具有95%以上的片段。另外，Z區(qū)域的變異體是指例如與Z區(qū)域的氨基酸序列具有90%以上的同源性的變異體，優(yōu)選為具有95%以上的同源性的變異體。優(yōu)選Z區(qū)域的變異體為與Z區(qū)域相比耐堿性得到改良的變異體。在這種情況下，Z區(qū)域的變異體與Z區(qū)域相比耐堿性是否得到改良可用后述實(shí)施例記載的方法進(jìn)行確認(rèn)。作為Z區(qū)域的變異體，例如可舉出具有專(zhuān)利第4391830號(hào)中記載的序列的蛋白質(zhì)。例如，在專(zhuān)利第4391830號(hào)的權(quán)利要求I中舉出了一種蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)含有由序列號(hào)I規(guī)定的2個(gè)以上的重復(fù)單元(Z區(qū)域)，且23位的氨基酸殘基為蘇氨酸。另外，在本發(fā)明中，上述R2可將Z區(qū)域或其片段(Z片段)、或者它們的變異體單獨(dú)含有或進(jìn)行組合而含有2個(gè)以上(優(yōu)選為4 10個(gè))。優(yōu)選上述R2由選自Z區(qū)域、Z片段、以及它們的變異體中的至少I(mǎi)個(gè)、或它們中的2個(gè)以上或者4 10個(gè)的組合構(gòu)成。I. 2. I. 2.蛋白質(zhì)I的制造作為用于制造蛋白質(zhì)I的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如可利用在Frederick M.Ausbel等的Current Protocols In Molecular Biology、Sambrook等編集的Molecular Cloning (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 3riedition, 2001)等中記載的公知的基因重組技術(shù)。即，將含有編碼目標(biāo)改性蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)I)的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等宿主細(xì)胞，將該宿主細(xì)胞用恰當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從而可由培養(yǎng)后的宿主細(xì)胞大量且經(jīng)濟(jì)地獲得蛋白質(zhì)I。作為優(yōu)選的表達(dá)載體，可以使用可在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制的已知載體中的任一種，例如可舉出美國(guó)專(zhuān)利第5，151，350號(hào)說(shuō)明書(shū)中記載的質(zhì)粒、由Sambrook等編集的Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等中記載的質(zhì)粒。另外，為了通過(guò)向宿主中導(dǎo)入核酸而使宿主轉(zhuǎn)化，可以利用在該技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何方法，例如可利用由Sambrook等編集的Molecular Cloning (Cold Spring HarborLaboratory Press, 3rd edition, 2001)等中記載的公知的方法。培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌并將所表達(dá)的蛋白質(zhì)回收的方法已由本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在本發(fā)明的實(shí)施例中也有例示。S卩，本發(fā)明的另一實(shí)施方式的核酸將免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)或其等功能變異體進(jìn)行編碼。在本發(fā)明中，免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的“等功能變異體(functional variant)”是指如下免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)利用部分氨基酸的添加、削除、取代、氨基酸殘基的化學(xué)修飾等得到改性，與改性前的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸序列保持70%以上、優(yōu)選為90%以上的同源性，并且在免疫球蛋白結(jié)合活性上，可以作為與改性前的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)同等的蛋白質(zhì)進(jìn)行操作。即，作為上述核酸，包含編碼本說(shuō)明書(shū)中的蛋白質(zhì)I的核酸。另外，如上所述，蛋白質(zhì)I可以是含有I個(gè)以上(優(yōu)選為2 12個(gè)，更優(yōu)選為4 10個(gè))免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域的蛋白質(zhì)。編碼這樣的蛋白質(zhì)的恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)?？梢杂帽景l(fā)明 的實(shí)施例中所示的各種方法制作，可以容易地制造包含I個(gè)以上免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域的蛋白質(zhì)。例如，具有在后述實(shí)施例中所示的序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(SP4Z)或由在序列號(hào)2中缺失、取代或添加有I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而成的氨基酸序列構(gòu)成且具有免疫球蛋白結(jié)合活性的蛋白質(zhì)適合作為本發(fā)明中使用的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。I. 2. I. 3.作用效果根據(jù)本實(shí)施方式的填充劑，對(duì)堿性條件下的清洗(例如使用了 O. 01 O. 2M的氫氧化鈉等堿性液的清洗)具有高耐性。作為其理由，雖然未必清楚，但考慮如下理由通過(guò)將組氨酸連續(xù)的部位添加到Z區(qū)域，載體與Z區(qū)域的結(jié)合位置與沒(méi)有組氨酸連續(xù)部位的情況不同；以及在固定化后的Z區(qū)域發(fā)生某種結(jié)構(gòu)變化而使耐堿性變高等。I. 3.離析免疫球蛋白的方法對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的離析免疫球蛋白的方法進(jìn)行說(shuō)明。本實(shí)施方式的離析免疫球蛋白的方法包括用上述本發(fā)明的親和色譜用填充劑使免疫球蛋白吸附至該填充劑的工序(第一工序)，使該免疫球蛋白溶出的工序(第二工序)，以及用堿性液清洗該填充劑的工序(第三工序)。 在第一工序中，使含有免疫球蛋白的溶液在免疫球蛋白吸附于該填充劑的蛋白質(zhì)配體的條件下在填充有上述親和色譜用填充劑的柱等中流動(dòng)。在這里，上述含有免疫球蛋白的溶液只要是含有免疫球蛋白的任意溶液即可，例如可舉出血清等來(lái)自生物體的試樣、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的上清等。作為上述免疫球蛋白吸附的條件，例如可舉出免疫球蛋白濃度O. I 10g/L、溶液的pH5 9、柱中的滯留時(shí)間O. 5 50分鐘、溫度O 40°C。在該第一工序中，溶液中的免疫球蛋白以外的物質(zhì)中的大部分不被吸附而通過(guò)柱。通常，為了除去一部分弱保持的物質(zhì)，將填充劑用含有NaCl等鹽的中性緩沖液、例如磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉溶液、枸櫞酸/磷酸氫二鈉溶液、鹽酸/三(羥甲基)氨基甲烷溶液、HEPES/氫氧化鈉溶液等進(jìn)行清洗。在第二工序中，使pH2 5的適當(dāng)緩沖液、例如枸櫞酸/枸櫞酸鈉溶液、乙酸/乙酸鈉溶液、鹽酸/甘氨酸溶液等流動(dòng)而使免疫球蛋白溶出。在第三工序中，用堿性液清洗(CIP清洗)填充劑。作為在本實(shí)施方式的離析免疫球蛋白的方法中使用的堿性液，例如可舉出氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、三乙胺、四丁基氫氧化銨等。實(shí)施例2.實(shí)施例以下，舉出實(shí)施例，進(jìn)一步具體說(shuō)明本實(shí)施方式的親和色譜用填充劑。另外，以下記載是概括性地表示本發(fā)明的方式，在沒(méi)有特別原因的情況下，本發(fā)明不由該記載所限定。2. I.合成例I (多孔粒子的合成)將甲基丙烯酸縮水甘油酯(Mitsubishi Rayon公司制)8. 2g、三輕甲基丙燒三甲基 丙烯酸酯(Sartomer公司制)65. 9g和單甲基丙烯酸甘油酯(日油公司制)90. 6g溶解于2-辛酮(東洋合成工業(yè)公司制)245. Sg和苯乙酮(和光純藥工業(yè)公司制)62g中，添加2,2’ -偶氮二異丁腈(和光純藥工業(yè)公司制)2g,制備有機(jī)單體溶液。接著,在4240g的純水中添加聚乙烯醇(可樂(lè)麗公司制PVA_217)8. 5g、十二燒基硫酸鈉(花王公司制EMAL 10G)0. 43g和硫酸鈉(和光純藥工業(yè)公司制)21. 3g，攪拌一晚，制備水溶液。接著，將得到的水溶液投入7L可拆式燒瓶?jī)?nèi)，安裝溫度計(jì)、攪拌槳以及冷卻管，安置于溫水浴，在氮?dú)夥障?，?00rpm開(kāi)始攪拌。繼而，利用溫水浴加熱可拆式燒瓶，在水溶液的溫度達(dá)到85°C時(shí)，利用滴液漏斗將上述有機(jī)單體溶液添加至該水溶液，進(jìn)行5小時(shí)的攪拌。接著將反應(yīng)液冷卻后，將該反應(yīng)液移至5L的聚丙烯制瓶中，靜置到粒子漂浮，將多余的水從下方吸取而廢棄。進(jìn)而，在該反應(yīng)液中加入丙酮，使粒子沉降。接著，將反應(yīng)液靜置3分鐘，利用傾析除去丙酮。將該操作重復(fù)2次后加入水，使粒子沉降。進(jìn)而，靜置3分鐘，進(jìn)行傾析。將該操作重復(fù)2次，清洗粒子。進(jìn)而，用丙酮再次置換粒子的分散液，風(fēng)干一晚后，用真空干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得到多孔粒子(以下記為PB) 90g。PB的平均粒徑為43 μ m，比表面積為83m2/g。2. 2.合成例2 (蛋白質(zhì)配體的制作)2. 2. I.免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的制作2. 2. I. I.免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建用下述步驟(i) (iv)構(gòu)建免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SP4Z)表達(dá)載體。圖2是說(shuō)明SP4Z載體(SP4Z-pETMll)的構(gòu)建方法的圖。( i )步驟 I將編碼單體Z區(qū)域的DNA作為起始物質(zhì)，構(gòu)建具有NcoI剪切部位和EcoRI剪切部位的單體Z區(qū)域載體(A-pETMll)。2. 2. I. 2. SPlZ-pETMll載體(有終止密碼子的單體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建將SPZK DNA (序列號(hào)3)作為模板，使用引物153 (序列號(hào)5)作為正向引物，并且使用引物156 (序列號(hào)8)作為反向引物，實(shí)施PCR。引物153和引物156中各自包含NcoI剪切部位和SacI的限制性?xún)?nèi)切酶剪切部位。PCR的條件如下所述。階段I :94°C I分鐘I個(gè)循環(huán)，階段2 :94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 2. 5分鐘(25個(gè)循環(huán))，階段3 72°C 10分鐘I個(gè)循環(huán)，然后保持在4°C。
PCR 生成物用 PCR 純化試劑盒(illustra GFX-96PCR Purification Kit ；GEHealthcare Bio Sciences公司制)純化,用1%瓊脂糖TAE凝膠進(jìn)行100V、45分鐘的電泳。將得到的條帶用凝膠提取試劑盒(illustra GFX PCR DNA Band Purification Kit ；GEHealthcare Bio Sciences公司制)純化。接著，進(jìn)行利用NcoI限制性?xún)?nèi)切酶和SacI限制性?xún)?nèi)切酶剪切的 pETMlI 載體(European Molecular Biology Laboratory)與 PCR 生成物的連接。利用限制性?xún)?nèi)切酶的消化反應(yīng)是用New England Biolabs制NcoI限制性?xún)?nèi)切酶和SacI限制性?xún)?nèi)切酶，在37°C進(jìn)行I小時(shí)，用電泳純化后，用凝膠提取試劑盒純化。連接反應(yīng)是利用T4DNA連接酶(Invitrogen制)在室溫下進(jìn)行一整夜的。將用連接得到的載體用DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Biomedal Life Science公司制)轉(zhuǎn)化，將得到的轉(zhuǎn)化體用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)一整夜，從一部分培養(yǎng)基中提取質(zhì)粒，用DNA序列分析儀(3730 DNA Sequencer ；Applied Biosystems制)確認(rèn)了插入的DNA片段的序列是正確的。2. 2. I. 3. A-pETMll載體(無(wú)終止密碼子的單體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建 代替引物153、156，使用引物153作為正向引物，并且使用引物154 (序列號(hào)6)作為反向引物，與實(shí)驗(yàn)2. 2. 1.2.同樣地構(gòu)建A-pETMll載體。應(yīng)予說(shuō)明，DNA片段的插入是利用pETMll的NcoI剪切部位和EcoRI剪切部位的。(ii)步驟 2接著，在A-pETMll載體中再附加一個(gè)Z區(qū)域而構(gòu)建具有EcoRI剪切部位和SacI剪切部位的2聚體Z區(qū)域載體(AB-pETMll)。2. 2. I. 4. SP2Z-pETMll載體(有終止密碼子的2聚體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建將SPZK DNA (序列號(hào)3)作為模板，使用引物155 (序列號(hào)7)作為正向引物，并且使用引物156作為反向引物，用PCR制備具有EcoRI剪切部位和SacI剪切部位的單體Z區(qū)域的DNA，并插入到A-pETMll的EcoRI剪切部位和SacI剪切部位。實(shí)驗(yàn)是在與實(shí)驗(yàn)2.2. 1.2.相同的條件下進(jìn)行的。2. 2. I. 5. AB-pETMll載體(無(wú)終止密碼子的2聚體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建將SPZK DNA(序列號(hào)3)作為模板，使用引物155作為正向引物，并且使用引物157(序列號(hào)9)作為反向引物，用PCR制備具有EcoRI剪切部位和SacI剪切部位的無(wú)終止密碼子的單體Z區(qū)域的DNA，并插入到A-pETMll的EcoRI剪切部位和SacI剪切部位來(lái)構(gòu)建AB-pETMll載體。實(shí)驗(yàn)是在與實(shí)驗(yàn)2. 2. I. 2.相同的條件下進(jìn)行的。(iii)步驟 3接著，在AB-pETMll載體中進(jìn)一步再附加一個(gè)Z區(qū)域，構(gòu)建具有SacI剪切部位和HindIII剪切部位的3聚體Z區(qū)域載體(ABC-pETMll)。2. 2. I. 6. SP3Z-pETMll載體(有終止密碼子的3聚體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建將SPZK DNA (序列號(hào)3)作為模板，使用引物158 (序列號(hào)10)作為正向引物，并且使用引物161 (序列號(hào)13)作為反向引物，用PCR制備具有SacI剪切部位和XhoI剪切部位的單體Z區(qū)域的DNA，并插入到AB-pETMll的EcoRI剪切部位和SacI剪切部位。實(shí)驗(yàn)是在與實(shí)驗(yàn)2. 2. I. 2.相同的條件下進(jìn)行的。2. 2. I. 7. ABC-pETMll載體(無(wú)終止密碼子的3聚體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建將SPZK DNA(序列號(hào)3)作為模板，使用引物158作為正向引物，并且使用引物159(序列號(hào)11)作為反向引物，用PCR制備具有SacI剪切部位和HindIII剪切部位的無(wú)終止密碼子的單體Z區(qū)域的DNA，并插入到AB-pETMll的SacI剪切部位和HindIII剪切部位來(lái)構(gòu)建ABC-pETMll載體。實(shí)驗(yàn)是在與實(shí)驗(yàn)2. 2. I. 2.相同的條件下進(jìn)行的。(iv)步驟 4最后，在ABC-pETMl I載體中附加第4個(gè)Z區(qū)域，構(gòu)建具有Hindi 11剪切部位和XhoI剪切部位的SP4Z-pETMll載體。2. 2. I. 8. SP4Z-PETM11載體(有終止密碼子的4聚體Z區(qū)域載體)的構(gòu)建將SPZK DNA (序列號(hào)3)作為模板，使用引物160 (序列號(hào)12)和引物161，用PCR制備具有HindIII剪切部位和XhoI剪切部位的單體Z區(qū)域的DNA，并插入到ABC-pETMl I的HindIII剪切部位和XhoI剪切部位來(lái)構(gòu)建SP4Z-pETMll載體。實(shí)驗(yàn)是在與實(shí)驗(yàn)2. 2. I. 2.相同的條件下進(jìn)行的。
2. 2. I. 9. SP4Z的表達(dá)及純化將得到的SP4Z-pETMll載體導(dǎo)入到E. coli (BL21株)細(xì)胞(STRATAGENE制)中，在18°C下添加ImM的IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖批喃糖苷；Sigma_Aldrich制),孵育15小時(shí)，使其表達(dá)重組型免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)I)。誘導(dǎo)之前，將上述細(xì)胞于37°C孵育到吸光度(( 600)達(dá)到約0.6。蛋白質(zhì)表達(dá)后，回收細(xì)胞，在pH8. O的Tris緩沖液中進(jìn)行破碎。得到的重組型免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SP4Z)由Ni親和色譜(Ni-NTA (三乙酸胺)粒子，QIAGEN公司制)進(jìn)行純化。純化的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)由陰離子交換色譜(Q-Sepharose FF,GE Healthcare Bio Sciences 公司制)進(jìn)一步純化。由 SDS 凝膠電泳確認(rèn)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的純度為96質(zhì)量％。另外，得到的重組型免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(SP4Z)由飛行時(shí)間型質(zhì)譜(MALDI-T0F/MS)分析確認(rèn)分子量。將上述制備的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)SP4Z的氨基酸序列示于圖I。應(yīng)予說(shuō)明，在圖I中，R和R2對(duì)應(yīng)于上述通式(I)中的R和R2，R1和r對(duì)應(yīng)于上述通式(2)中的R1和r。r中的下劃線部分表示TEV剪切部位。另外，圖I中的Z片段具有除去了由序列號(hào)I表示的Z區(qū)域的C末端的氨基酸殘基APK的氨基酸序列。2. 2. 2. SP4ZwoHis 的制作在50mM Tris鹽酸、O. 5mM EDTA (乙二胺四乙酸)和ImM DTT (二硫代蘇糖醇)的緩沖液(ρΗ8· O) 15mL 中加 SP4Z 150mg、MobiTEV 蛋白酶(MoBiTec 公司)900U，在 30°C下攪拌12小時(shí)，剪切SP4Z的TEV剪切部位。使由TEV蛋白酶剪切的SP4Z通過(guò)Ni-NTA柱(容量4mL),回收SP4Z的組氨酸連接子被剪切的粗制SP4Zw0His。得到的粗制SP4Zw0His由陰離子交換色譜(Q-Sepharose FF, GE Healthcare Bio Sciences 公司制)在 ρΗ7· 5 的 HEPES 緩沖液中進(jìn)一步純化。將該蛋白質(zhì)IwoHis通過(guò)離心濃縮器(Vivaspin20, Sartorius公司制)濃縮后，在IOmM HEPES緩沖液(pH7. 5)中透析12小時(shí)，制備了 SP4ZwoHis (序列號(hào)4)。2.3.合成例3 (免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)向粒子的固定化)2.3.1.固定化例 I制備I. ImL的PB、20mg的SP4Z分散于IOmL的O. IM磷酸緩沖液(pH6. 8)而得至Ij的混合液后，加入2. Ig的硫酸鈉，在25°C下進(jìn)行24小時(shí)的顛倒混和，使SP4Z與PB (甲基丙烯酸縮水甘油酯·三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯·甘油單甲基丙烯酸酯共聚多孔粒子)進(jìn)行結(jié)合。將生成的粒子過(guò)濾后，與5M硫代甘油IOmL混合，在30°C下反應(yīng)4小時(shí)，將剩余的環(huán)氧基封端，用PBS/0. 05%Tween20清洗后，用PBS清洗，得到I. ImL的SP4Z結(jié)合多孔粒子(SP4Z-PB)。2.3.2.固定化例 2在固定化例I中代替SP4Z而使用SP4Zw0His，除此以外，與固定化例I同樣進(jìn)行，得到了 I. Iml 的 SP4ZwoHis 結(jié)合多孔粒子(SP4ZwoHis_PB)。2.3.3.固定化例 3在固定化例I 中代替 PB 而使用 Epoxy-activated Sepharose6B (GE HealthcareBio Sciences公司制),除此以外,與固定化例I同樣進(jìn)行，得到I. Iml的SP4Z結(jié)合瓊脂糖粒子(蛋白質(zhì)1-AG)。 2.3.4.固定化例 4在固定化例I 中代替 PB 而使用 Epoxy-activated Sepharose6B (GE HealthcareBio Sciences公司制)，代替SP4Z而使用SP4ZwoHis，除此以外，與固定化例I同樣進(jìn)行，得到 I. Iml 的 SP4ZwoHis 結(jié)合瓊脂糖粒子(SP4ZwoHis_AG)。2.4.試驗(yàn)例2. 4. I.測(cè)定例I (免疫球蛋白G (IgG)動(dòng)態(tài)結(jié)合容量的測(cè)定)將SP4Z-PB、SP4ZwoHi s_PB、SP4Z-AG、SP4ZwoHi s_AG 分別填充于內(nèi)徑 0. 5cm 的柱中直至床高5cm。將各柱用20mM磷酸緩沖液(pH7. 4)平衡化后，使含有人多克隆IgG (5mg/mL)的20mM磷酸緩沖液(pH7. 4)以線性流速60cm/小時(shí)流動(dòng)，在用吸光度檢測(cè)器的情況下溶出液中的人多克隆IgG突破(Breakthrough) 10%時(shí)的人多克隆IgG吸附量，用填充劑體積除上述人多克隆IgG吸附量，求出填充劑的每單位體積的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量。將結(jié)果示于表
Io[表I]
填充劑IgG動(dòng)態(tài)結(jié)合容量(mg/mL)~
SP4Z-PB37
SP4ZwoHis-PB33
SP4Z-AG24
SP4ZwoHis-AG182. 4. 2.測(cè)定例2 (耐堿性的測(cè)定)將測(cè)定例I中使用的填充有各填充劑的柱設(shè)置于低壓色譜系統(tǒng)(AKTAprimeplus ；GE Healthcare Bio Sciences公司),使O. IM氫氧化鈉IOml在柱內(nèi)流動(dòng)。將柱從裝置取下，密閉后，在室溫中放置一定時(shí)間后，與測(cè)定例I同樣地測(cè)定線性流速60cm/小時(shí)下的人多克隆IgG的結(jié)合容量。求出將用O. IM氫氧化鈉處理之前的人多克隆IgG結(jié)合量設(shè)為100%時(shí)的結(jié)合容量維持率。將其結(jié)果示于圖3。
根據(jù)圖3，結(jié)合了具有組氨酸連接子的免疫球蛋白蛋白質(zhì)(SP4Z)的填充劑(SP4Z-PB、SP4Z-AG)與結(jié)合了不具有組氨酸連接子的免疫球蛋白蛋白質(zhì)的填充劑(SP4ZWoHis-PB、SP4ZWoHis-AG)相比，堿接觸時(shí)間變長(zhǎng)，但結(jié)合容量的維持率下降小。因此，確認(rèn)由上述通式(I)表示的蛋白質(zhì)配體被固定化的填充劑的耐堿性?xún)?yōu)異。本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，可以進(jìn)行進(jìn)一步的各種變型。另外，本發(fā)明包括與實(shí)施方式中說(shuō)明的構(gòu)成實(shí)質(zhì)上相同的構(gòu)成(例如功能、方法和結(jié)果相同的構(gòu)成、或者目的和結(jié) 果相同的構(gòu)成)。另外，本發(fā)明包括將實(shí)施方式中說(shuō)明的構(gòu)成的非本質(zhì)的部分置換而得的構(gòu)成。另外，本發(fā)明包括與實(shí)施方式中說(shuō)明的構(gòu)成發(fā)揮相同作用效果的構(gòu)成或能夠?qū)崿F(xiàn)相同目的的構(gòu)成。另外，本發(fā)明包括在實(shí)施方式中說(shuō)明的構(gòu)成中附加了公知技術(shù)的構(gòu)成。
權(quán)利要求
1.一種親和色譜用填充劑，是由下述通式(I)表示的蛋白質(zhì)配體被固定于載體的親和色譜用填充劑， R-R2.....(I) 式中，R表示由含有4 20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的4 300個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示由含有蛋白A的Z區(qū)域或其片段或者它們的變異體的50 500個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的、可與免疫球蛋白結(jié)合的氨基酸序列；這里，R與R2的C末端或N末端結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的親和色譜用填充劑，其中，所述通式(I)表示的蛋白質(zhì)配體中的氨基被固定于具有環(huán)氧基的所述載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的親和色譜用填充劑，其中，所述載體含有取代2，3-二羥基丙基作為開(kāi)環(huán)環(huán)氧基。
4.一種離析免疫球蛋白的方法，包括如下工序 使免疫球蛋白吸附于權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的親和色譜用填充劑的工序， 使該免疫球蛋白溶出的工序，以及 用堿性液清洗該填充劑的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供耐堿性?xún)?yōu)異的親和色譜用填充劑以及離析免疫球蛋白的方法。本發(fā)明的親和色譜用填充劑是由下述通式(1)表示的蛋白質(zhì)固定于載體的填充劑。R-R2·····(1)(式中，R表示由含有4～20個(gè)組氨酸連續(xù)的部位的4～300個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列，R2表示由含有蛋白A的Z區(qū)域或其片段或者它們的變異體的50～500個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的、可與免疫球蛋白結(jié)合的氨基酸序列。這里，R與R2的C末端或N末端結(jié)合)。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102834415SQ20118001456
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者田守功二, 福田哲夫, 宮路正昭, 王勇, 安陪毅由, 岡野友亮, 籾山昌輝, 河合孝廣 申請(qǐng)人:Jsr株式會(huì)社