專利名稱：一種疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥制劑的質(zhì)量檢測方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法。
背景技術(shù)：
疏血通是以地龍和水蛭為原料的中藥制劑，其劑型通常為注射液，用于治療急性期腦梗塞，具有抗栓、溶栓、改善血液循環(huán)的作用。授權(quán)公告號CN1192782C，公告日2005年 3月16日，發(fā)明名稱“治療心腦血管疾病的注射劑的制造方法及其產(chǎn)品”的發(fā)明專利公開了該中藥制劑及其制備方法。目前，疏血通注射液執(zhí)行的是國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-548 (Z-084) -2005 (Z)。但是，該標(biāo)準(zhǔn)中對藥品成分的檢測指標(biāo)要求相對寬泛與模糊，除中國藥典中規(guī)定的常規(guī)水針注射液所要求的檢測項(xiàng)目外，針對具體成分的檢測不夠具體，如僅對其中的總煻、總多糖、總氨基酸進(jìn)行了規(guī)定，未進(jìn)一步對單糖、多糖及氨基酸、小分子肽的具體成分進(jìn)行研究。此外，指紋圖譜中僅明確了共有峰的歸屬(來源)，而未就具體的峰成分進(jìn)行定性研究及歸類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法，其特征在于， 該方法包括含量測定及指紋圖譜鑒定，其中，含量測定包括氨基酸含量測定和糖含量測定； 指紋圖譜鑒定包括氨基酸指紋圖譜鑒定、糖指紋圖譜鑒定和小分子物質(zhì)指紋圖譜鑒定；所述疏血通制劑用如下方法制得將水蛭和地龍分別用2 4倍體積的生理鹽水浸提15 30小時(shí)，過濾，以體積百分書計(jì)，將33% 84%水蛭生理鹽水提取液與16% 67%地龍生理鹽水提取液的比例混合。本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中所述所述氨基酸含量測定包括如下步驟1)對照品溶液的制備分別精密稱取IOmg或15mg氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用0. IN鹽酸定容至5ml，制得17種氨基酸儲備液；所述氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品選自天門冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；然后分別精密吸取0. 5mL、ImL或2mL上述17種氨基酸儲備液，混合后用0. IN鹽酸定容至25mL，制得1號混合對照品溶液；2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取2mL、3mL、4mL上述1號混合對照品溶液，分別用0. IN鹽酸定容至5mL，得 2號、3號、4號混合對照品溶液；取2mL 3號混合對照品溶液，用0. IN鹽酸定容至5mL，得5 號混合對照品溶液；取2mL 4號混合對照品溶液，用0. IN鹽酸定容至5mL，得6號混合對照品溶液；取ImL 3號混合對照品溶液，用0. IN鹽酸定容至IOmL刻度，得7號混合對照品溶液；分別將上述1-7號混合對照品溶液注入液相色譜儀測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為色譜柱4.6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Eclipse-AAA 柱；流速2mL/min，流動相組成A 相 pH7. 8 的 40mmol/L Na2HP04 溶液、B 相乙腈甲醇水=40 50 40 50 10， 優(yōu)選為乙腈甲醇水=45 45 10，以A相與B相的體積比為0 100 100 0進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長338nm、262nm ；柱溫為40°C ；進(jìn)樣量1 μ L ；理論板數(shù)按丙氨酸峰計(jì)算應(yīng)不低于10000 ；3)游離氨基酸含量測定取ImL待測樣品，用0. IN鹽酸定容至5mL，制得未水解樣品；按照步驟2)的色譜條件測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中氨基酸的含量，計(jì)算得出；4)總氨基酸含量測定精密量取0. 5mL待測樣品，加入2mL含苯酚的6N鹽酸，沖氬氣10秒后，密封于110°C水解22h后，冷卻至室溫；然后加入lmL40% NaOH溶液，混勻，用0. IN鹽酸定容至 5mL，制得水解樣品；按照步驟2)的色譜條件測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中氨基酸的含量，計(jì)算得出。具體地，上述色譜條件中所述梯度洗脫的洗脫程序?yàn)? 1. 9min :A =100%, B 0 % ；1. 9 ~ 18. Imin :A :100 % 43 %、B :0 % 57 % ；18. 1 18. 6min :A :43 % 0 %、 B :57% 100% ；18. 6 22. 3min :A 0%, B :100% ；22. 3 23. 2min :A 100%、B 100% 0% ；23. 2 26min :A :100%, B :0%。將總氨基酸含量與游離氨基酸含量相減，即得多肽的含量。對于疏血通注射液(規(guī)格2mL/支)，以總氨基酸含量高于7. Omg/支、多肽含量高于2. Omg/支、游離氨基酸高于5. Omg/支作為疏血通注射液合格的限量。所述糖含量測定包括如下步驟1)對照品溶液的制備精密稱取甘露糖對照品、半乳糖對照品各10mg，分別加水定容至5mL，制得甘露糖對照品溶液和半乳糖對照品溶液，備用；精密稱取50mg葡萄糖對照品，加入ImL所述半乳糖對照品溶液和2mL所述甘露糖對照品溶液，然后加水定容至5mL，得1號混合對照品溶液；2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取0. 75mL、0. 5mL、0. 2mL、0. 2mL 1號混合對照品溶液，分別精密加入 0. 25mL、0. 5mL、0. 8mL、l. 8mL水，混勻，即得2號、3號、4號、5號混合對照品溶液；取0. 5mL 5號混合對照品溶液，精密加入0. 5mL水，混勻，即得6號混合對照品溶液；取0. 2mL 5號混合對照品溶液，精密加入0. SmL水，混勻，即得7號混合對照品溶液；分別精密吸取100 μ 1上述1-7號混合對照品溶液置于離心管中，加入0. 3Ν NaOH 溶液100 μ L和0. 5mol/L 1-苯基-3-甲基~5~吡唑啉酮的甲醇溶液200 μ L，用0. 3Ν NaOH 溶液調(diào)ρΗ至7. 2 8. 5 ；于70°C水浴反應(yīng)45min，冷卻至室溫后，加入與上述0. 3N NaOH溶液使用量相當(dāng)?shù)?. 3N鹽酸，混勻；再加入12. 5%的磷酸鹽緩沖液，稀釋反應(yīng)溶液至1. OmL,混勻后加入5mL氯仿，渦旋30s，4500rpm離心5min，取上層水層，IOOOOrpm高速離心5min，
取上清液；分別將上述制得的上清液進(jìn)行HPLC檢測注入液相色譜儀測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為色譜柱4.6 X 250mm, 5 μ m Phenomenex C18 柱；流速1. 2mL/min ；流動相A 相為 20mmol/L醋酸銨、B相為乙腈，以A相與B相的體積比為60 85 15 40進(jìn)行梯度洗脫； 柱溫為25°C ；進(jìn)樣量5μ L ；檢測波長245nm ；理論塔板數(shù)以葡萄糖峰計(jì)算，不低于3000 ；3)游離糖含量測定取100μ 1待測樣品，按步驟2~)中的處理方法制得上清液，在步驟2~)的色譜條件下測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的糖含量，計(jì)算得出；4)總糖含量測定精密吸取ImL待測樣品，加入2mL 6%的三氟醋酸溶液，充氬氣后封口，110°C水解 3h ；然后減壓蒸至無三氟醋酸味，加入ImL水溶解殘?jiān)?，得多糖水解液；精密量?00 μ L多糖水解液，按步驟幻中的處理方法制得上清液，在步驟幻的色譜條件下測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的糖含量，計(jì)算得出。具體地，上述色譜條件中所述梯度洗脫的洗脫程序?yàn)? 25min =A :85 % 72. 5%, B 27. 5% ；25 30min，A :72. 5% 60%，B :27. 5% 40%。將總糖含量與游離糖含量相減，即得多元糖的含量。對于疏血通注射液(規(guī)格2mL/支)，建議采用總糖含量高于8. Omg/支、游離糖含量高于7. Omg/支、多元糖含量高于0. 5mg/支，作為疏血通注射液合格的限量。本發(fā)明中，所述氨基酸指紋圖譜用如下方法建立1)精密量取ImL疏血通制劑樣品，用0. IN鹽酸定容至5mL，制得未水解樣品；吸取IyL該未水解樣品注入液相色譜儀，制定未水解樣品的氨基酸對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與氨基酸含量測定中的相同；2)精密量取0. 5mL疏血通制劑樣品，按氨基酸含量測定中步驟4)的方法制得水解樣品；取1 μ L該水解樣品注入液相色譜儀，制定水解樣品的氨基酸對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與氨基酸含量測定中的相同；3)指紋圖譜鑒定將疏血通制劑產(chǎn)品在相同處理方法及色譜條件下測定未水解樣品的氨基酸指紋圖譜和水解樣品的氨基酸指紋圖譜，分別與上述對照指紋圖譜相比較，相似度大于0. 90的為合格產(chǎn)品。本發(fā)明中，所述糖指紋圖譜用如下方法建立1)取100μ 1疏血通制劑樣品，按照糖含量測定中步驟幻的處理方法制得上清液， 注入液相色譜儀，制定未水解樣品的糖對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與糖含量測定中的相同；2)精密吸取ImL疏血通制劑樣品，按照糖含量測定中步驟4)的處理方法制得上清液，注入液相色譜儀，制定水解樣品的糖對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與糖含量測定中的相同；3)指紋圖譜鑒定
將疏血通制劑產(chǎn)品在相同處理方法及色譜條件下測定未水解樣品的糖指紋圖譜和水解樣品的糖指紋圖譜，分別與上述對照指紋圖譜相比較，相似度大于0. 90的為合格產(chǎn)
P
ΡΠ O本發(fā)明中，所述小分子指紋圖譜用如下方法建立1)精密量取ImL疏血通制劑樣品，過0.45 μ m的微孔濾膜后，注入液相色譜儀，制定小分子對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為色譜柱3. 5 μ m， 4. 6X 250mm Waters XBridge Amide柱；流速1. OmL/min ；流動相A相為 0. 3% 的冰醋酸乙腈溶液、B相為0. 3%的冰醋酸水溶液，以A相與B相的體積比40 95 5 60進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長2Mnm ；進(jìn)樣量5μ L ；柱溫30°C ；理論塔板數(shù)以次黃嘌呤峰計(jì)算，不低于 2000 ；2)指紋圖譜鑒定將疏血通制劑產(chǎn)品在相同處理方法及色譜條件下測定小分子指紋圖譜，與上述對照指紋圖譜相比較，相似度大于0. 90的為合格產(chǎn)品。具體地，上述色譜條件中所述梯度洗脫的洗脫程序?yàn)? 10min，A :95%，B
10 18min，A :95% 90%，B 10% ；18 26min，A :90%，B ；26 30min，A: 90% 85%，B :10% 15% ；30 56min，A :85% 40%，B :15% 60%。通過小分子指紋圖譜，對主要共有峰進(jìn)行了分析和指認(rèn)，共指認(rèn)了 10個(gè)共有峰， 分別為胸腺嘧啶(thymine)，尿嘧啶(uracil)，胸腺嘧啶核苷(thymidine)，2，-脫氧尿苷 Q，-deoxyuridine)，次黃嘌呤(hypoxanthine)，黃嘌呤(xanthine)，肌苷(inosine)，鳥嘌呤(guanine)，鳥嘌呤核苷(guanosine)，胞嘧啶核苷(cytidine)。本發(fā)明的疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法，建立了通過HPLC測定疏血通注射液中氨基酸含量的方法，該方法簡便、準(zhǔn)確，且能夠同時(shí)用于疏血通注射液中氨基酸含量的測定及氨基酸指紋圖譜分析，適合作為疏血通中游離氨基酸和多肽氨基酸質(zhì)量控制的方法；建立了柱前PMP衍生化HPLC分析方法測定疏血通注射液中游離糖和多糖含量的方法，該方法簡便、準(zhǔn)確，且能夠同時(shí)用于疏血通注射液中游離糖和多糖含量的測定，及糖類指紋圖譜分析，可作為疏血通注射液中糖類物質(zhì)的日常質(zhì)量控制的方法；建立了疏血通注射液中內(nèi)源性小分子的HPLC指紋圖譜分析方法，能夠滿足疏血通注射液中內(nèi)源性小分子的指紋圖譜分析的要求，可采用小分子HPLC指紋圖譜來控制注射液的質(zhì)量。另外，通過本發(fā)明方法對疏血通制劑的制備工藝進(jìn)行質(zhì)量檢測，能夠明確水蛭和地龍藥材提取液、超濾前后、疏血通制劑中氨基酸、糖、內(nèi)源性小分子這三大類物質(zhì)有很好的相關(guān)性，超濾步驟是工藝中影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵步驟，需要嚴(yán)格控制。本發(fā)明的疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法在結(jié)合國家對中藥注射液相關(guān)要求的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有研究，進(jìn)一步明確了注射液所含水溶性小分子成分的物質(zhì)基礎(chǔ)上，對指紋圖譜中共有峰的性質(zhì)進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究闡述，對未知成分的峰(即目前指紋圖中的未知成分，包括糖\腺苷\嘌呤等)的歸屬有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。更有助于提高對產(chǎn)品制備工藝過程中的來源及過程控制，提升了產(chǎn)品本身的質(zhì)量，從而提高臨床用藥的安全系數(shù)，也為進(jìn)一步研究其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中1號混合對照品溶液(a)、未水解疏血通注射液游離氨基酸(b)及水解疏血通注射液總氨基酸(c)的HPLC圖譜。圖2為實(shí)施例2中1號混合對照品溶液(a)、未水解疏血通注射液游離糖(b)及水解疏血通注射液樣品總糖(c)的HPLC譜圖如圖2所示圖3為本發(fā)明的未水解疏血通注射液氨基酸對照指紋圖譜。圖4為本發(fā)明的水解疏血通注射液氨基酸對照指紋圖譜。圖5為本發(fā)明的未水解疏血通注射液糖對照指紋圖譜。圖6為本發(fā)明的水解疏血通注射液糖對照指紋圖譜。圖7為本發(fā)明的疏血通注射液小分子對照指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的疏血通注射液均購自牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，該疏血通注射液的配比及制備方法參見授權(quán)公告號CN1192782C的實(shí)施例1，共10批次，規(guī)格2mL/支；各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、D-甘露糖(Man)對照品、D-無水葡萄糖(Glc)對照品、半乳糖(Gal)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；。實(shí)施例1疏血通注射液樣品中氨基酸含量測定1)對照品溶液的制備分別精密稱取天門冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各15mg，分別用0. IN鹽酸定容至5ml，制得17種氨基酸儲備液；按表1中的體積分別精密吸取上述制得的氨基酸儲備液，混合后用0. IN鹽酸定容至25mL，制得1號混合對照品溶液；表11號混合對照品溶液的配置
權(quán)利要求
1.一種疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，該方法包括含量測定及指紋圖譜鑒定，其中，含量測定包括氨基酸含量測定和糖含量測定；指紋圖譜鑒定包括氨基酸指紋圖譜鑒定、糖指紋圖譜鑒定和小分子物質(zhì)指紋圖譜鑒定；所述疏血通制劑用如下方法制得將水蛭和地龍分別用2 4倍體積的生理鹽水浸提 15 30小時(shí)，過濾，以體積百分?jǐn)?shù)計(jì)，將33% 84%水蛭生理鹽水提取液與16% 67%地龍生理鹽水提取液的比例混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述氨基酸含量測定包括如下步驟1)對照品溶液的制備分別精密稱取IOmg或15mg氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用0. IN鹽酸定容至5ml，制得17種氨基酸儲備液；所述氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品選自天門冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、 蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；然后分別精密吸取0. 5mL、ImL或2mL上述17種氨基酸儲備液，混合后用0. IN鹽酸定容至25mL，制得1號混合對照品溶液；2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取2mL、3mL、4mL上述1號混合對照品溶液，分別用0. IN鹽酸定容至5mL，得2號、 3號、4號混合對照品溶液；取2mL 3號混合對照品溶液，用0. IN鹽酸定容至5mL，得5號混合對照品溶液；取2mL4號混合對照品溶液，用0. IN鹽酸定容至5mL，得6號混合對照品溶液；取ImL 3號混合對照品溶液，用0. IN鹽酸定容至IOmL刻度，得7號混合對照品溶液；分別將上述1-7號混合對照品溶液注入液相色譜儀測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)， 濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為色譜柱4. 6 X 150mm, 3. 5 μ m Zorbax Eclipse-AAA 柱；流速:2mL/min，流動相組成=A 相pH7. 8的40mmol/L Na2HPO4溶液、B相乙腈甲醇水=40 50 40 50 10，以A 相與B相的體積比為0 100 100 0進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長338nm、262nm ；柱溫為 400C ；進(jìn)樣量1 μ L ；理論板數(shù)按丙氨酸峰計(jì)算應(yīng)不低于10000 ；3)游離氨基酸含量測定取ImL待測樣品，用0. IN鹽酸定容至5mL，制得未水解樣品；按照步驟2)的色譜條件測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中氨基酸的含量，計(jì)算得出；4)總氨基酸含量測定精密量取0. 5mL待測樣品，加入2mL含1 %苯酚的6N鹽酸，沖氬氣10秒后，密封于 110°C水解22h后，冷卻至室溫；然后加入ImL 40% NaOH溶液，混勻，用0. IN鹽酸定容至 5mL，制得水解樣品；按照步驟2)的色譜條件測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中氨基酸的含量，計(jì)算得出。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，色譜條件中所述梯度洗脫的洗脫程序?yàn)? 1. 9min :A 100 %、B :0 % ； 1. 9 18. Imin :A 100% -43%, B 0% -57% ； 18. 1 18. 6min :A :43% 0%、B :57% 100%;18· 6 22. 3min :Α :0%、Β :100%;22· 3 23. 2min :A :0% 100%、B :100% 0% ；23. 2 26min :A :100%, B :0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述糖含量測定包括如下步驟1)對照品溶液的制備精密稱取甘露糖對照品、半乳糖對照品各10mg，分別加水定容至5mL，制得甘露糖對照品溶液和半乳糖對照品溶液，備用；精密稱取50mg葡萄糖對照品，加入ImL所述半乳糖對照品溶液和2mL所述甘露糖對照品溶液，然后加水定容至5mL，得1號混合對照品溶液；2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取0. 75mL、0. 5mL、0. 2mL、0. 2mL 1號混合對照品溶液，分別精密加入0. 25mL、 0. 5mL、0. 8mL、1. 8mL水，混勻，即得2號、3號、4號、5號混合對照品溶液；取0. 5mL 5號混合對照品溶液，精密加入0. 5mL水，混勻，即得6號混合對照品溶液；取0. 2mL 5號混合對照品溶液，精密加入0. SmL水，混勻，即得7號混合對照品溶液；精密吸取100 μ 1上述1-7號混合對照品溶液，分別加入0. 3NNaOH溶液100 μ L和 0. 5mol/L 1-苯基-3-甲基_5_吡唑啉酮的甲醇溶液200 μ L，用0. 3NNaOH溶液調(diào)ρΗ至 7. 2 8. 5 ；于70°C水浴反應(yīng)45min，冷卻至室溫后，加入與上述0. 3NNaOH溶液使用量相當(dāng)?shù)?. 3N鹽酸，混勻；再加入12. 5 %的磷酸鹽緩沖液稀釋反應(yīng)溶液至1. OmL,混勻后加入5mL 氯仿，渦旋30s，4500rpm離心5min，取上層水層，IOOOOrpm高速離心5min，取上清液；分別將上述制得的上清液進(jìn)行HPLC檢測注入液相色譜儀測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為色譜柱4. 6 X 250mm, 5 μ m Phenomenex C18 柱；流速1. 2mL/min ；流動相A 相為 20mmol/L醋酸銨、B相為乙腈，以A相與B相的體積比為60 85 15 40進(jìn)行梯度洗脫； 柱溫為25°C ；進(jìn)樣量5μ L ；檢測波長245nm ；理論塔板數(shù)以葡萄糖峰計(jì)算，不低于3000 ；3)游離糖含量測定取ΙΟΟμΙ待測樣品，按步驟幻中的處理方法制得上清液，在步驟幻的色譜條件下測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的糖含量，計(jì)算得出；4)總糖含量測定精密吸取ImL待測樣品，加入2mL 6%的三氟醋酸溶液，充氬氣后封口，110°C水解池； 然后減壓蒸至無三氟醋酸味，加入ImL水溶解殘?jiān)?，得多糖水解液；精密量?00 μ L多糖水解液，按步驟幻中的處理方法制得上清液，在步驟幻的色譜條件下測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的糖含量，計(jì)算得出。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，色譜條件中所述梯度洗脫的洗脫程序?yàn)? 25min :A :85% 72. 5%,B :15% 27. 5%；25 30min，A :72. 5% 60%， B 27. 5% 40%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述氨基酸指紋圖譜用如下方法建立1)精密量取ImL疏血通制劑樣品，用0.IN鹽酸定容至5mL，制得未水解樣品；取1 μ L 該未水解樣品注入液相色譜儀，制定未水解樣品的氨基酸對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與權(quán)利要求2相同；2)精密量取0.5mL疏血通制劑樣品，按權(quán)利要求2步驟4)的方法制得水解樣品；取 ι μ L該水解樣品注入液相色譜儀，制定水解樣品的氨基酸對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與權(quán)利要求2相同； 3)指紋圖譜鑒定將疏血通制劑產(chǎn)品在相同處理方法及色譜條件下測定未水解樣品的氨基酸指紋圖譜和水解樣品的氨基酸指紋圖譜，分別與上述對照指紋圖譜相比較，相似度大于0. 90的為合格產(chǎn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述糖指紋圖譜用如下方法建立1)取ΙΟΟμ1疏血通制劑樣品，按照權(quán)利要求4步驟幻的處理方法制得上清液，注入液相色譜儀，制定未水解樣品的糖對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與權(quán)利要求4相同；2)精密吸取ImL疏血通制劑樣品，按照權(quán)利要求4步驟4)的處理方法制得上清液，注入液相色譜儀，制定水解樣品的糖對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與權(quán)利要求4相同；3)指紋圖譜鑒定將疏血通制劑產(chǎn)品在相同處理方法及色譜條件下測定未水解樣品的糖指紋圖譜和水解樣品的糖指紋圖譜，分別與上述對照指紋圖譜相比較，相似度大于0. 90的為合格產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述小分子指紋圖譜用如下方法建立1)精密量取ImL疏血通制劑樣品，過0.45 μ m的微孔濾膜后，注入液相色譜儀，制定小分子對照指紋圖譜；其中，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為色譜柱3. 5 μ m，4. 6X250mm Waters XBridge Amide柱；流速1. OmL/min ；流動相A相為0. 3%的冰醋酸乙腈溶液、B相為0. 3%的冰醋酸水溶液，以A相與B相的體積比40 95 5 60進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長2Mnm ；進(jìn)樣量5μ L ；柱溫30°C ；理論塔板數(shù)以次黃嘌呤峰計(jì)算，不低于2000 ；2)指紋圖譜鑒定將疏血通制劑產(chǎn)品在相同處理方法及色譜條件下測定小分子指紋圖譜，與上述對照指紋圖譜相比較，相似度大于0. 90的為合格產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫的洗脫程序?yàn)?0 lOmin，A 95%, B 5% ；10 18min，A :95% 90%，B 10% ；18 26min，A 90%, B 10% ；26 30min，A :90% 85%，B 15% ；30 56min，A :85% 40%， B 60%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疏血通制劑的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，該方法包括含量測定及指紋圖譜鑒定，其中，含量測定包括氨基酸含量測定和糖含量測定；指紋圖譜鑒定包括氨基酸指紋圖譜鑒定、糖指紋圖譜鑒定和小分子物質(zhì)指紋圖譜鑒定；所述疏血通制劑用如下方法制得將水蛭和地龍分別用2～4倍生理鹽水浸提15～30小時(shí)，過濾，以33％～84％水蛭生理鹽水提取液與16％～67％地龍生理鹽水提取液的比例混合。本發(fā)明方法更有助于提高對產(chǎn)品制備工藝過程中的來源及過程控制，提升了產(chǎn)品本身的質(zhì)量，從而提高臨床用藥的安全系數(shù)，也為進(jìn)一步研究其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
文檔編號G01N30/06GK102507792SQ20111036605
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者李振國 申請人:牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司