專利名稱：一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物篩選技術領域，具體涉及一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法。
背景技術：
端粒是染色體末端的DNA重復序列。上世紀九十年代，有研究者提出，人體中端粒的平均長度隨年齡增大而變短，而體細胞端粒長度大大短于生殖細胞。細胞培養(yǎng)實驗中也觀察到端粒的長度隨分裂次數(shù)增多而縮短，而且端粒長度和細胞分化程度呈反比。每次細胞復制時都會發(fā)生端粒的縮短，都伴隨著端粒的縮短。端粒縮短到一定程度時，細胞染色體的穩(wěn)定性就會降低，，細胞逐漸死亡。細胞復制的次數(shù)是有限的，正常人體細胞中為一般50 次左右，端粒也被稱作“生命時鐘”。端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成核糖蛋白復合體，其中RNA是一段模板序列，指導合成端粒DNA的重復序列片段。端粒酶可以催化DNA鏈的端粒不斷延長，從而抵消因染色體復制、細胞分裂導致的脫氧核糖核酸縮短，使得染色體脫氧核糖核酸完好無損，細胞能夠順利地分裂繁殖。四膜蟲的端粒酶發(fā)生突變時，其端粒縮短、細胞死亡， 酵母端粒酶基因突變會導致端粒變短、細胞衰老。而人體細胞中端粒酶的激活和端粒延長的過程主要是在胚系細胞中完成的，當胚胎發(fā)育完成以后，端粒酶活性就受到抑制。每次細胞復制時都會發(fā)生端粒的縮短，都伴隨著端粒的縮短。據(jù)報道，90%以上的腫瘤細胞中其端粒酶活性異常，癌癥細胞可以無限制的分裂下去，形成腫瘤。端粒酶成為一個癌癥治療的潛在靶點，而端粒酶抑制劑也成為一種癌癥治療的潛在藥物。1994年，kim等人提出了通過 TRAPassay(Telomere Repeat AmplificationProtocol)的方法檢測端粒酶活性。該方法往細胞提取物加入DNA引物，通過將端粒延伸后進行PCR擴增，根據(jù)PCR產(chǎn)物來評估端粒酶活性，達到很高的靈敏性，可以檢測出50倍體細胞稀釋體系中的10個癌癥細胞。1996年，德國boehrioger公司推出了 TRAP-ELISA試劑盒，其原理是利用Kim法處理細胞或組織并擴增端粒酶產(chǎn)物，引物TS含生物素，擴增產(chǎn)物與包被親和素的微孔板結(jié)合，并與地高辛標記的探針結(jié)合，用酶標儀檢測抗地高辛抗體標記的酶信號。最近，Arme De Cian等人研究發(fā)現(xiàn)，有部分端粒酶抑制劑會對PCR的過程產(chǎn)生影響。端粒結(jié)構中富含G序列，容易形成G4 區(qū)域，而部分酶抑制劑通過與G4區(qū)域的結(jié)合從而抑制端粒延伸過程。但是該特殊結(jié)構也會抑制傳統(tǒng)方法的PCR過程。尋找一種新的端粒酶抑制劑檢測手段，對于腫瘤治療有著重要
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種無標記，實時檢測的利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法。該方法避免了傳統(tǒng)端粒酶活性檢測中常用的聚合酶鏈式擴增反應及電泳等手段，可以降低因抑制聚合酶鏈式擴增反應而帶來的假陽性問題，同時也能有效的節(jié)約人力，有望實現(xiàn)高度自動化的篩選體系。
為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、對表面修飾有自組裝層的QCM芯片表面進行羧基功能化；步驟二、將碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺按照1 1的摩爾比溶解于去離子水中，得到溶質(zhì)濃度為0. IM的活化液，將步驟一中經(jīng)羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0. 5h 2h，然后用去離子水沖洗，再用氮氣吹干；步驟三、將步驟二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育 Ih 池，用去離子水沖洗后用氮氣吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的濃度為1 μ M 2 μ M ；步驟四、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F1，然后通過六通閥向反應器中加入對照液，待對照液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使對照液駐留在反應器中，反應0.證 池后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，計算頻率Fl和頻率F2的差值AF ；所述工作液為iTris · HC1.KC1和MgCl2的混合水溶液，工作液中iTris · HCl的濃度為30mM 70mM, KCl 的濃度為 30mM 70mM，MgCl2 的濃度為 0. 5mM 1. 5mM ；步驟五、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl'，然后通過六通閥向反應器中加入含待測試劑的待測液，待待測液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使待測液駐留在反應器中，反應0. 5h 池后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2'，計算頻率Fl'和頻率F2'的差值AF'，計算AF'與步驟四中AF的比值，當AF' /AF彡50%時，判定待測試劑為端粒酶抑制劑；所述工作液為Tris · HC1、KCl和MgCl2的混合水溶液，工作液中Tris · HCl的濃度為30mM 70mM，KCl的濃度為30mM 70mM，MgCl2的濃度為0. 5mM 1. 5mM。上述步驟一中所述表面修飾有自組裝層的QCM芯片的制備方法為將金基底的 QCM芯片浸泡到總濃度為ImM IOmM的溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的比例為1 10 100，室溫下孵育15小時，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到表面修飾有自組裝層的QCM芯片。上述步驟一中所述QCM芯片表面羧基功能化的方法為配置去離子水與甲醇體積比為1 1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2,2'-聯(lián)吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸_2_羥基乙酯混合，并加入0. 004mmol的氯化銅，得到淡藍色的溶液，對淡藍色溶液除氧IOmin 30min，隨后向每升除氧后的淡藍色溶液中加入0. 004mmol抗壞血酸，保持氮氣氛圍，得到紅色溶液，將QCM芯片置于紅色溶液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應4h 16h，將QCM芯片從反應液中取出，用甲醇和去離子水交替沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干，最后將QCM芯片置于含IOmg · ml/1琥珀酐及15mg ^L-H- 二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反應12小時，得到表面羧基功能化的 QCM芯片。
上述步驟三中所述氨基功能化的端粒酶引物為5'端氨基功能化的端粒酶引物， 所述端粒酶引物的序列(SEQ ID NO. 1)為5' -TTT TTT TTTTAA TCC GTC GAG CAG AGT T-3'。上述步驟四中所述對照液由10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液， 10 μ L水和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成。上述步驟五中所述待測液由10 μ L濃度為Ing · mL—1的待測試劑，10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成。本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測工具，石英晶體微天平(Quartzcrystal microbalance, QCM)是一種利用單結(jié)晶石英的壓電電效應的稱重裝置，當施加一個外部電場時，會產(chǎn)生機械振動，當晶片厚度為電極機械振蕩波半波長的奇數(shù)倍時，發(fā)生共振。為簡化QCM定量分析模型，本發(fā)明提出了 QCM的固化水模型，在高頻振動下，固定于QCM表面的生物分子能夠帶動周圍的溶液一起振動，當QCM表面組裝的分子密度超過臨界狀況時，認為QCM表面形成一層固化層，QCM頻率的變化取決于固化層的厚度和密度。本發(fā)明對固化水模型進行了驗證，發(fā)現(xiàn)0. ISnm的厚度變化能造成IHz響應。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明避免了傳統(tǒng)端粒酶活性檢測中常用的聚合酶鏈式擴增反應及電泳等手段，可以降低因抑制聚合酶鏈式擴增反應而帶來的假陽性問題，同時也能有效的節(jié)約人力， 有望實現(xiàn)高度自動化的篩選體系。2、本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測工具，區(qū)別于傳統(tǒng)的QCM應用模式，提出QCM 的固化水模型，從“固化水層”模型出發(fā)，充分利用了 “固化水層”變化所導致的0. ISnm造成IHz響應的原理，具有無標記，實時檢測等優(yōu)勢。3、本發(fā)明根據(jù)待測試劑對端粒酶活性的抑制作用，降低端粒酶對固定于QCM芯片表面端粒酶引物的延伸效率，通過監(jiān)測到的待測液頻率變化與對照液頻率變化的比值可直接篩選出端粒酶抑制劑。4、本發(fā)明采用的羧基化的高分子膜具有很好的抗非特異性吸附的作用，從而使整個體系可以直接使用細胞提取物作為檢測對象。下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。


圖1為本發(fā)明實施例1的QCM檢測圖。圖2為本發(fā)明實施例2的QCM檢測圖。圖3為本發(fā)明實施例3的QCM檢測圖。
具體實施例方式實施例1步驟一、將金基底的QCM芯片浸泡到總濃度為ImM的溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的比例為 1 10，室溫下孵育15小時，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到表面修飾有自組裝層的QCM芯片；配置去離子水與甲醇體積比為1 1的混合溶液，向每升
6混合溶液中加入16mmol 2,2'-聯(lián)吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羥基乙酯混合，并加入0. 004mmol的氯化銅，得到淡藍色的溶液，對淡藍色溶液除氧30min，隨后向每升除氧后的淡藍色溶液中加入0. 004mmol抗壞血酸，保持氮氣氛圍，得到紅色溶液，將表面修飾有自組裝層的QCM芯片置于紅色溶液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應16h，將QCM芯片從反應液中取出，用甲醇和去離子水交替沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干，最后將QCM芯片置于含IOmg .mr1琥珀酐及15mg irH- 二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反應12小時，得到表面羧基功能化的QCM芯片；步驟二、將碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺按照1 1的摩爾比溶解于去離子水中，得到溶質(zhì)濃度為0. IM的活化液，將步驟一中經(jīng)羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0. 5h，然后用去離子水沖洗，再用氮氣吹干；步驟三、采用序列(SEQID NO. 1)為 5' -TTT TTT TTT TAA TCC GTCGAG CAG AGT T-3'的端粒酶引物，采用常規(guī)方法對端粒酶引物的5'端進行氨基功能化，將步驟二中吹干后的QCM芯片表面用所述氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育池，用去離子水沖洗后用氮氣吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的濃度為ΙμΜ;步驟四、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液(Tris ·Ηα、κα和MgCl2的混合水溶液，工作液中jTris · HCl的濃度為50mM，KCl的濃度為50mM，MgCl2的濃度為ImM)，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F1，然后通過六通閥向反應器中加入對照液(10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液，IOyL水和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成)，待對照液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使對照液駐留在反應器中，反應池后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，計算頻率Fl和頻率F2的差值Δ F ；步驟五、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液(Tris ·Ηα、κα和MgCl2的混合水溶液，工作液中jTris 'HCl的濃度為50mM，KCl的濃度為50mM，MgCl2的濃度為ImM)，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ‘，然后通過六通閥向反應器中加入待測液(10 μ L濃度為Ing -πιΓ1的待測試劑A (表沒食子兒茶素沒食子酸酯-Epigallocatechin Gallate) ,IOyL含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成)，待待測液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使待測液駐留在反應器中，反應池后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2'，計算頻率Fl'和頻率F2'的差值AF'，計算AF'與步驟四中AF的比值，得到AF' /AF為50%，判定待測試劑A (表沒食子兒茶素沒食子酸酯-Epigallocatechin Gallate)是端粒酶抑制劑。本實施例根據(jù)待測試劑對端粒酶活性的抑制作用，降低端粒酶對固定于QCM芯片表面端粒酶引物的延伸效率，通過監(jiān)測到的待測液頻率變化與對照液頻率變化的比值可直接篩選出端粒酶抑制劑，避免了傳統(tǒng)端粒酶活性檢測中常用的聚合酶鏈式擴增反應及電泳等手段，可以降低因抑制聚合酶鏈式擴增反應而帶來的假陽性問題，同時也能有效的節(jié)約人力，有望實現(xiàn)高度自動化的篩選體系。
實施例2步驟一、將金基底的QCM芯片浸泡到總濃度為IOmM的溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的比例為 1 100，室溫下孵育15小時，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到表面修飾有自組裝層的QCM芯片；配置去離子水與甲醇體積比為1 1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2,2'-聯(lián)吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羥基乙酯混合，并加入0. 004mmol的氯化銅，得到淡藍色的溶液，對淡藍色溶液除氧20min，隨后向每升除氧后的淡藍色溶液中加入0. 004mmol抗壞血酸，保持氮氣氛圍，得到紅色溶液，將表面修飾有自組裝層的QCM芯片置于紅色溶液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應10h，將QCM芯片從反應液中取出，用甲醇和去離子水交替沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干，最后將QCM芯片置于含IOmg .mr1琥珀酐及15mg irH- 二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反應12小時，得到表面羧基功能化的QCM芯片；步驟二、將碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺按照1 1的摩爾比溶解于去離子水中，得到溶質(zhì)濃度為0. IM的活化液，將步驟一中經(jīng)羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育2h，然后用去離子水沖洗，再用氮氣吹干；步驟三、采用序列(SEQID NO. 1)為 5' -TTT TTT TTT TAA TCC GTCGAG CAG AGT T-3'的端粒酶引物，采用常規(guī)方法對端粒酶引物的5'端進行氨基功能化，將步驟二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育lh，用去離子水沖洗后用氮氣吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的濃度為2μΜ;步驟四、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液(Tris ·Ηα、Κα和MgCl2的混合水溶液，工作液中iTris 'HCl的濃度為30mM，KCl的濃度為30mM，MgCl2的濃度為0. 5mM)，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F1，然后通過六通閥向反應器中加入對照液(由10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液，10 μ L水和2 μ L濃度為100 μ M 的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成)，待對照液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使對照液駐留在反應器中，反應0. 5h后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，計算頻率Fl和頻率F2的差值Δ F ；步驟五、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液(Tris ·Ηα、κα和MgCl2的混合水溶液，工作液中jTris · HCl的濃度為30mM，KCl的濃度為30mM，MgCl2的濃度為0. 5mM)， 待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl ‘，然后通過六通閥向反應器中加入待測液(由IOyL濃度為lng·!!^1的待測試劑B (meso-四甲基吡啶基))卟啉-TMPyP4)，10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成)，待待測液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使待測液駐留在反應器中，反應0.證后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2'，計算頻率Fl'和頻率F2'的差值AF'，計算AF'與步驟四中AF的比值，得到AF' /AF為80%，判定待測試劑BOiieso-四甲基吡啶基))卟啉_TMPyP4) 不是端粒酶抑制劑。
本實施例根據(jù)待測試劑對端粒酶活性的抑制作用，降低端粒酶對固定于QCM芯片表面端粒酶引物的延伸效率，通過監(jiān)測到的待測液頻率變化與對照液頻率變化的比值可直接篩選出端粒酶抑制劑，避免了傳統(tǒng)端粒酶活性檢測中常用的聚合酶鏈式擴增反應及電泳等手段，可以降低因抑制聚合酶鏈式擴增反應而帶來的假陽性問題，同時也能有效的節(jié)約人力，有望實現(xiàn)高度自動化的篩選體系。實施例3步驟一、將金基底的QCM芯片浸泡到總濃度為5mM的溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的比例為 1 50，室溫下孵育15小時，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到表面修飾有自組裝層的QCM芯片；配置去離子水與甲醇體積比為1 1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2,2'-聯(lián)吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羥基乙酯混合，并加入0. 004mmol的氯化銅，得到淡藍色的溶液，對淡藍色溶液除氧lOmin，隨后向每升除氧后的淡藍色溶液中加入0. 004mmol抗壞血酸，保持氮氣氛圍，得到紅色溶液，將表面修飾有自組裝層的QCM芯片置于紅色溶液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應4h，將QCM芯片從反應液中取出，用甲醇和去離子水交替沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干，最后將QCM芯片置于含IOmg .mr1琥珀酐及15mg irH- 二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反應12小時，得到表面羧基功能化的QCM芯片；步驟二、將碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺按照1 1的摩爾比溶解于去離子水中，得到溶質(zhì)濃度為0. IM的活化液，將步驟一中經(jīng)羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育lh，然后用去離子水沖洗，再用氮氣吹干；步驟三、采用序列(SEQID NO. 1)為 5' -TTT TTT TTT TAA TCC GTCGAG CAG AGT T-3'的端粒酶引物，采用常規(guī)方法對端粒酶引物的5'端進行氨基功能化，將步驟二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1. 5h，用去離子水沖洗后用氮氣吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的濃度為1.5μΜ;步驟四、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液(Tris ·Ηα、Κα和MgCl2的混合水溶液，工作液中iTris 'HCl的濃度為70mM，KCl的濃度為70mM，MgCl2的濃度為1. 5mM)，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F1，然后通過六通閥向反應器中加入對照液(由10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液，10 μ L水和2 μ L濃度為100 μ M 的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成)，待對照液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使對照液駐留在反應器中，反應Ih后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，計算頻率Fl和頻率F2的差值Δ F ；步驟五、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液(Tris ·Ηα、κα和MgCl2的混合水溶液，工作液中jTris 'HCl的濃度為70mM，KCl的濃度為70mM，MgCl2的濃度為1. 5mM)，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl'，然后通過六通閥向反應器中加入待測液(由10 μ L濃度為Ing · mr1的待測試劑C(焦磷酸二乙酯)，10 μ L含端粒酶的HeLa 細胞提取物，80 μ L工作液和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成)，待待測液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使待測液駐留在反應器中，反應Ih后，打開蠕動泵， 通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2'，計算頻率Fl'和頻率 F2'的差值AF'，計算AF'與步驟四中AF的比值，得到AF' / Δ F為33 %，判定待測試劑C (焦磷酸二乙酯)是端粒酶抑制劑。本實施例根據(jù)待測試劑對端粒酶活性的抑制作用，降低端粒酶對固定于QCM芯片表面端粒酶引物的延伸效率，通過監(jiān)測到的待測液頻率變化與對照液頻率變化的比值可直接篩選出端粒酶抑制劑，避免了傳統(tǒng)端粒酶活性檢測中常用的聚合酶鏈式擴增反應及電泳等手段，可以降低因抑制聚合酶鏈式擴增反應而帶來的假陽性問題，同時也能有效的節(jié)約人力，有望實現(xiàn)高度自動化的篩選體系。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)發(fā)明技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構變化，均仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟步驟一、對表面修飾有自組裝層的QCM芯片表面進行羧基功能化； 步驟二、將碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺按照1 1的摩爾比溶解于去離子水中，得到溶質(zhì)濃度為0. IM的活化液，將步驟一中經(jīng)羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0. 5h 2h，然后用去離子水沖洗，再用氮氣吹干；步驟三、將步驟二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育Ih 池，用去離子水沖洗后用氮氣吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的濃度為1 μ M 2 μ M ；步驟四、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F1，然后通過六通閥向反應器中加入對照液，待對照液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使對照液駐留在反應器中，反應0. 5h 池后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM 芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2，計算頻率Fl和頻率F2的差值AF ；所述工作液為iTris · HCl、KCl和MgCl2的混合水溶液，工作液中iTris · HCl的濃度為30mM 70mM， KCl的濃度為30mM 70mM，MgCl2的濃度為0. 5mM 1. 5mM ；步驟五、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液，待基線穩(wěn)定后，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率Fl'，然后通過六通閥向反應器中加入含待測試劑的待測液，待待測液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使待測液駐留在反應器中，反應0. 5h 池后，打開蠕動泵， 通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監(jiān)測到的頻率F2'，計算頻率Fl'和頻率F2'的差值AF'，計算AF'與步驟四中AF的比值，當AF' / Δ F彡50%時，判定待測試劑為端粒酶抑制劑；所述工作液為Tris · HC1、KCl和MgCl2的混合水溶液，工作液中 Tris · HCl的濃度為30mM 70mM，KCl的濃度為30mM 70mM，MgCl2的濃度為0. 5mM 1. 5mM。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟一中所述表面修飾有自組裝層的QCM芯片的制備方法為將金基底的QCM芯片浸泡到總濃度為ImM IOmM的溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的比例為1 10 100，室溫下孵育15小時，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到表面修飾有自組裝層的QCM-H-· I I心片。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟一中所述QCM芯片表面羧基功能化的方法為配置去離子水與甲醇體積比為 1 1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol 2,2'-聯(lián)吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸_2_羥基乙酯混合，并加入0. 004mmol的氯化銅，得到淡藍色的溶液，對淡藍色溶液除氧IOmin 30min，隨后向每升除氧后的淡藍色溶液中加入 0. 004mmol抗壞血酸，保持氮氣氛圍，得到紅色溶液，將QCM芯片置于紅色溶液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應4h 16h，將QCM芯片從反應液中取出，用甲醇和去離子水交替沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干，最后將QCM芯片置于含IOmg · mL—1琥珀酐及15mg · mL—H- 二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反應12小時，得到表面羧基功能化的 QCM芯片。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟三中所述氨基功能化的端粒酶引物為5'端氨基功能化的端粒酶引物，所述端粒酶引物的序列為5' -TTT TTT TTT TAATCC GTC GAG CAG AGT T-3'。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟四中所述對照液由10 μ L含端粒酶的HeLa細胞提取物，80 μ L工作液，10 μ L水和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟五中所述待測液由10 μ L濃度為Ing · mL-1的待測試劑，10 μ L含端粒酶的HeLa 細胞提取物，80 μ L工作液和2 μ L濃度為100 μ M的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，該方法為一、芯片表面羧基功能化；二、芯片表面活化；三、芯片表面固定端粒酶引物；四、將固定有引物的芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，向反應器中通入工作液，讀取監(jiān)測到的頻率F1，然后通入對照液，讀取監(jiān)測到的頻率F2，計算F1和F2的差值ΔF；五、將固定有引物的芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，向反應器中通入工作液，讀取監(jiān)測到的頻率F1′，然后通入待測液，讀取監(jiān)測到的頻率F2′，計算頻率F1′和頻率F2′的差值ΔF′，當ΔF′/ΔF≤50％時，判定待測液中含有端粒酶抑制劑。本發(fā)明采用石英晶體微天平為檢測工具，具有無標記，實時檢測等優(yōu)勢。
文檔編號G01N5/02GK102393342SQ20111032688
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權日2011年10月25日
發(fā)明者朱志強, 汪杰, 馬宏偉 申請人:中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所