專利名稱：一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，具體涉及基于一種改進(jìn)的微乳液增穩(wěn)增敏的考馬斯亮藍(lán)測定微量蛋白質(zhì)的光度法，屬于生物分析與食品安全領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是生物最重要的基本組成成分之一，它與營養(yǎng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶、激素、病毒、 免疫、新陳代謝、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、遺傳息息相關(guān)，因此蛋白質(zhì)的定量檢測在生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、 化學(xué)研究和食品安全等領(lǐng)域占有十分重要的地位。近年來，蛋白質(zhì)分析方法研究的日益深入引起了科學(xué)工作者的興趣和廣泛關(guān)注。 蛋白質(zhì)常用的定量測定方法包括凱式定氮法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)、雙縮脲法、 i^olin-酚法(Lowry法)、紫外吸收法等。凱氏定氮法具有通用性強(qiáng)，測定費(fèi)用低，儀器簡單且比較準(zhǔn)確等優(yōu)點，但同時也具有靈敏度較低等缺點。在凱氏定氮法中，由于是通過測定氮元素來換算蛋白質(zhì)的含量，該方法無法區(qū)分所測定的氮元素是否來自蛋白質(zhì)，以致造成一些蛋白質(zhì)含量過高的假象。雙縮脲法的優(yōu)點是較快速，干擾物質(zhì)少，主要的缺點是靈敏度差，因此雙縮脲法常用于需要快速、但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。Lowry法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費(fèi)時較長，且Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深， 因此須精確控制反應(yīng)時間。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收；缺點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專一性差，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾?？捡R斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，這一方法具有靈敏度高、干擾物質(zhì)少、測定快速、簡便等優(yōu)點，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、配位劑的影響，適合大量樣品的測定，是一種常用的方法，但是體系的吸光度在IOmin后逐漸下降，因穩(wěn)定性差而造成測定誤差。CN1401988公布了一種測定蛋白質(zhì)的方法，是基于染料結(jié)合原理在近紅外波長區(qū)測定微量蛋白質(zhì)。該法采用花菁染料，在酸性緩沖溶液中使其與蛋白質(zhì)相互作用，于900nm 以上的近紅外波長區(qū)測定體系的吸光度變化，本法靈敏度高。本發(fā)明在原有考馬斯亮藍(lán)法的基礎(chǔ)上，加入微量的微乳液，進(jìn)一步提高了該體系測定蛋白質(zhì)的靈敏度，并顯著增強(qiáng)了體系的穩(wěn)定性，從而易于蛋白質(zhì)含量的快速準(zhǔn)確測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較差的缺點， 提供了一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，具體涉及基于一種改進(jìn)的微乳液增穩(wěn)增敏的考馬斯亮藍(lán)測定微量蛋白質(zhì)的光度法，其特征包括以下步驟(1)在考馬斯亮藍(lán)法基礎(chǔ)上加入一種增穩(wěn)增敏劑，所述增穩(wěn)增敏劑為自配的微乳液；(2)優(yōu)化測定步驟，從而提高測定體系的穩(wěn)定性和靈敏度。
本發(fā)明所述的考馬斯亮藍(lán)選用考馬斯亮藍(lán)G-250，其分子式為=C47H48N3Of2Na ；本發(fā)明所述的微乳液選自下列之一 0P-10微乳液、Triton X-100微乳液、 Tween-20微乳液、Tween-80微乳液。本發(fā)明所述的微乳液所含成分的質(zhì)量比為X 正丁醇正庚烷水=(1 10) (1 5) (0. 2 2) (83 97. 8)，χ 代表 0Ρ-10 微乳液、Triton X-100 微乳液、 Triton X-IO微乳液、Tween-20微乳液或Tween-80微乳液，優(yōu)化的增穩(wěn)增敏劑是0P-10微乳液。本發(fā)明所述的優(yōu)化測定步驟包括以下方面(1)依次加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(10. 0 μ g -mL^^ OP-IO微乳液，然后依次加入濃度遞增的蛋白質(zhì)溶液，水定容搖勻，靜置一段時間；(2)采用分光光度計在580 eiOnm處對試劑空白測定吸光度A，繪制工作曲線。本發(fā)明所述的優(yōu)化的考馬斯亮藍(lán)G-250染色液的用量為0. 10 4. OOmL，優(yōu)化的 0P-10微乳液的用量為1.00 10. 00yL，優(yōu)化的染色液、增穩(wěn)增敏劑與蛋白質(zhì)混合后的穩(wěn)定時間為10 240min。本發(fā)明對經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行了改進(jìn)，在考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中加入微乳液改變了其本身的疏水作用，反應(yīng)體系變?yōu)榫G色，吸收峰位于634nm處，其吸收強(qiáng)度有所增強(qiáng)；加入蛋白質(zhì)后，吸收峰從634nm藍(lán)移至595nm，反應(yīng)體系呈現(xiàn)藍(lán)色，吸光度的變化與蛋白質(zhì)的濃度呈正比，從而達(dá)到定量測定蛋白質(zhì)的目的。在考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中加入適量微乳液，然后再與蛋白質(zhì)混合，以提高測定體系的穩(wěn)定性和靈敏度。以0P-10微乳液為例說明增穩(wěn)增敏劑的加入對體系的影響，數(shù)據(jù)見表1和表2。表1體系的穩(wěn)定性試驗
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，其特征包括以下步驟(1)在考馬斯亮藍(lán)法基礎(chǔ)上加入一種增穩(wěn)增敏劑，所述增穩(wěn)增敏劑為自配的微乳液；(2)優(yōu)化測定步驟，從而提高測定體系的穩(wěn)定性和靈敏度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，其特征是所述的考馬斯亮藍(lán)選用考馬斯亮藍(lán)G-250，其分子式為C47H48N3O7S2Ni
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，其特征是所述的微乳液選自下列之一 0P-10微乳液、Triton X-100微乳液、Tween-20微乳液、Tween-80 微乳液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，其特征是微乳液所含成分的質(zhì)量比為χ 正丁醇正庚烷水=(1 10) (1 5) (0.2 2) (83 97. 8)，χ 代表 0P-10、Triton X-100、Triton X-10、Tween-20 或 Tween-80，優(yōu)化的增穩(wěn)增敏劑是0P-10微乳液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，其特征是優(yōu)化的步驟為依次加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(10. Oyg ^mr1KOP-IO微乳液，然后依次加入濃度遞增的蛋白質(zhì)溶液，水定容搖勻，靜置一段時間，采用分光光度計在580 eiOnm處對試劑空白測定吸光度A，繪制工作曲線。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法，其特征為在蛋白質(zhì)工作曲線線性范圍內(nèi)，優(yōu)化的考馬斯亮藍(lán)G-250染色液的用量為0. 10 4. OOmL，優(yōu)化的0P-10微乳液的用量為1.00 10. 00yL，優(yōu)化的染色液、增穩(wěn)增敏劑與蛋白質(zhì)混合后的穩(wěn)定時間為10 240min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的光度法。為了克服經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差的缺點，本發(fā)明提供了一種基于微乳液增穩(wěn)增敏的考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)方法，采用自配的微乳液，有效地增強(qiáng)體系的穩(wěn)定性和提高反應(yīng)體系的靈敏度。本發(fā)明所述的測定方法，是一種簡便、快速的定量測定蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號G01N21/31GK102507466SQ20111031990
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者吳丹, 龐雪輝, 朱寶存, 朱沛華, 李慧芝, 李燕, 李賀, 杜斌, 毛珂霞, 羅川南, 范大偉, 蔡燕燕, 趙燕芳, 韓顏顏, 馬洪敏, 魏東, 魏琴 申請人:濟(jì)南大學(xué)