專利名稱：來源于前列腺分泌液中的前列腺癌標(biāo)記物的制作方法
來源于前列腺分泌液中的前列腺癌標(biāo)記物技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)以及臨床診斷領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及來源于前列腺分 泌液中的前列腺癌標(biāo)記物。
背景技術(shù)：
目前診斷前列腺癌(PCa)主要的診斷標(biāo)記物是PSA，但其臨床診斷上存在特異性 和靈敏度不高的問題，導(dǎo)致臨床實(shí)踐中面臨大量不必要的活檢。這些問題一方面給病人帶 來許多副作用，另外一方面造成醫(yī)療資源和費(fèi)用的大量浪費(fèi)。
早期診斷PCa、對(duì)確診的PCa有選擇地進(jìn)行治療或單純隨訪觀察、避免過度治療是 成功診治PCa的關(guān)鍵。目前在臨床上主要依靠PSA檢測(cè)、直腸指檢、影像學(xué)檢查和組織病理 檢查等手段，但它們都存在一定的局限性，給早期PCa的確診、治療選擇和預(yù)后判斷帶來了 一定困難。例如臨床上廣泛應(yīng)用于早期診斷PCa的標(biāo)志物為PSA，但是PSA特異性和敏感性 都偏低。約15% PCa患者的血清PSA在正常范圍，前列腺炎和前列腺良性增生患者的PSA 水平也會(huì)出現(xiàn)升高，而且PSA對(duì)判定PCa是否轉(zhuǎn)移及預(yù)后的作用不確切。
目前對(duì)前列腺癌評(píng)價(jià)，分型和預(yù)后基本還是停留在用Nomograms上(常用的是用 Partin表)，主要指標(biāo)大多是臨床指標(biāo),例如活檢的Gleason評(píng)分，臨床分期，血清中PSA 水平進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。在一個(gè)大規(guī)模的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)Partin表預(yù)測(cè)淋巴結(jié)侵入，儲(chǔ)精 囊侵入，前列腺胞外，或是局限在前列腺的癌癥等的檢測(cè)的AUC分別為O. 77，O. 74，O. 62和 0.68。因此，迫切需要尋找新的PCa標(biāo)志物。
直接用血清來尋找癌癥標(biāo)志物，具有很大的困難，也會(huì)碰到許多挑戰(zhàn)，即使在擁有 先進(jìn)質(zhì)譜儀的狀況下，這種挑戰(zhàn)也仍然存在。因?yàn)檠謇镉袔追N高豐度蛋白，如白蛋白、免 疫球蛋白、補(bǔ)體因子，它們構(gòu)成血清中97%的蛋白，而生物標(biāo)記物通常是表達(dá)量相當(dāng)?shù)偷牡?白。血清中蛋白的表達(dá)豐度是很大的，比如白蛋白的濃度是7. 5X105nmol/L ;而？3么濃度在 3ng/ml,相當(dāng)于Kr1MioVL,這說明PSA和白蛋白之間相差7. 5X106倍。目前,質(zhì)譜所能檢 測(cè)到的蛋白動(dòng)態(tài)范圍只有IO2-1O4,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，即使利用蛋白抗體柱去除高豐度蛋白，成效仍 然不明顯。即使去掉99%的蛋白，它的動(dòng)態(tài)范圍仍然接近于105。因此有必要從其他來源， 尋找血清標(biāo)記物。
和血液相比，作為用于前列腺癌臨床診斷的樣品，前列腺分泌液具有以下三方面 優(yōu)勢(shì)1、理論上，前列腺液中的成分比血液中的成分更能直接、真實(shí)地反映前列腺癌的病 理特點(diǎn)。2、前列腺液的來源具有高度的前列腺特異性。因此，前列腺分泌液(Expressed Prostatic Secretions,EPS)中所有的蛋白質(zhì)(哪怕它們也存在于別的器官)都具有作為 前列腺特異蛋白的資格用于新的前列腺臨床診斷癌標(biāo)記蛋白的篩選。這無疑顯著地降低了 篩選新的前列腺癌標(biāo)記蛋白的難度。3、那些在血液中因水平極低而不易被發(fā)現(xiàn)的前列腺癌 標(biāo)記蛋白如果也在前列腺液中存在的話，則較容易被檢測(cè)出來。這一點(diǎn)對(duì)尋找早期前列腺 癌標(biāo)記蛋白無疑具有特別的意義，這是因?yàn)樵缙谇傲邢侔┖屯砥诘南啾?，其體積很小，因而 分泌物就更少。
本發(fā)明人在2008年率先對(duì)前列腺液進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究和嚴(yán)格的過濾分析，共115種蛋白質(zhì)成功地在前列腺分泌液鑒定出(Li R等，Analysis of expressed prostatic secretions reveals rich source of biomarker candidates， Proteomics Clinical Application. 2008 ；2 :543-555)。和國(guó)外不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的前列腺癌組織轉(zhuǎn)錄水平的數(shù)據(jù)相比較，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其中48種蛋白質(zhì)的mRNA水平在前列腺癌組織也是增加的。隨后前列腺分泌液的蛋白質(zhì)組得到了更深入的研究，也有更多的蛋白質(zhì)被鑒定(Drake， R. R. , et al.，Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease. J Proteomics， 2009.72 (6) p. 907-17 ；Drake, R. R.，et al.，In-depth proteomic analyses of direct expressed prostatic secretions. J Proteome Res,2010. 9(5) :p.2109-16.)。
與國(guó)際上規(guī)模很大的、篩選具有臨床診斷應(yīng)用前景的、新的前列腺癌標(biāo)志物的研究相比，在過去十多年里將前列腺分泌液作為前列腺癌臨床診斷研究樣品的報(bào)道卻是寥寥無幾。因此，本領(lǐng)域很有必要研究?jī)?yōu)化獲取前列腺液的方法以及研究前列腺液中的新的蛋白標(biāo)記物。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來源于前列腺分泌液中的前列腺癌標(biāo)記物。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述來源于前列腺分泌液中的前列腺癌標(biāo)記物的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin) α鏈、纖連蛋白 I (Fibronectin I)、白蛋白(Albumin)、PSA和/或SERPINB1的用途，用于制備從前列腺液中診斷前列腺癌的試劑。
在一個(gè)優(yōu)選例種，所述的試劑還用于前列腺癌的后和/或前列腺癌治療療效的評(píng)估，較佳地以前列腺液作為樣本。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，對(duì)應(yīng)結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin) α鏈、纖連蛋白 I (Fibronectin)、白蛋白(Albumin)、PSA和/或SERPI NB I這5種蛋白質(zhì)，同時(shí)制備2種、3 種、4種或5種所述的從前列腺液中診斷前列腺癌的試劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin) α鏈還包括其糖基化修飾體。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷前列腺癌的試劑，其是特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈，其是多克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是AbCam公司產(chǎn)品(ab85846)。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于從前列腺液中診斷前列腺癌的試劑盒，其中包括
容器，以及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括
容器，以及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別纖連蛋白I ;
容器，及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別白蛋白；和/或
容器，及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別SERPINB1。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括容器，及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別PSA。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、前列腺分泌液的2D-電泳圖。將前列腺癌患者與同齡人的非癌患者的EPS樣品各20份分別等量混合后各取60ug用于每一塊2D膠的電泳。IEF范圍是3_10。膠的濃度為12%。
圖2、前列腺癌患者組與非癌對(duì)照組前列腺分泌液中Ifepatoglobin水平的檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人致力于從前列腺分泌液中尋找前列腺癌的特異性標(biāo)志物(標(biāo)記物)，經(jīng)過深入的研·究，揭示了一組新的前列腺癌標(biāo)志物結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin) α鏈、纖連蛋白I (Fibronectin I)、白蛋白(Albumin)、PSA和/或SERPINB1。前列腺液中，這些蛋白質(zhì)在前列腺癌患者中的表達(dá)顯著高于非癌患者的表達(dá)。因此，可基于這些蛋白質(zhì)來開發(fā)從前列腺液中診斷、評(píng)估、預(yù)后前列腺癌的試劑。
前列腺癌標(biāo)志物
結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)是一種已知的蛋白，人類Hepatoglobin蛋白全長(zhǎng)由 406個(gè)氨基酸組成，該蛋白的GenBank登錄號(hào)為(Hs.513711)。其中前導(dǎo)肽由18個(gè)氨基酸組成，α鏈由144個(gè)氨基酸組成。β鏈由244個(gè)氨基酸組成。α鏈與β鏈還能組合成不同比例的聚合體。此外，在α鏈上還存在各種糖基化修飾。
纖連蛋白I (Fibronectin I)是一種已知的蛋白，人類Fibronectin I蛋白全長(zhǎng)由 2265個(gè)氨基酸組成，該蛋白的GenBank登錄號(hào)為(ΑΒ. 191261.1)。
白蛋白(Albumin)是一種已知的蛋白，人類Albumin蛋白全長(zhǎng)由609個(gè)氨基酸組成，該蛋白的GenBank登錄號(hào)為NP_000468。
SERPINB1是一種已知的蛋白，人類SERPINB1蛋白全長(zhǎng)379個(gè)氨基酸組成，該蛋白的 GenBank 登錄號(hào)為 AAH09015.1。
PSA是一種已知的前列腺癌標(biāo)志物，人類PSA蛋白全長(zhǎng)由261個(gè)氨基酸組成，該蛋白的GenBank登錄號(hào)為MM : 176820。
上述各種蛋白質(zhì)的片段、衍生物或修飾形式也包括在本發(fā)明中，只要這些蛋白的片段、衍生物或修飾形式上包括該蛋白特有的決定簇(或表位)，也能夠用于制備特異性的抗體，所獲得的抗體對(duì)于識(shí)別相應(yīng)的蛋白具有特異性，不會(huì)識(shí)別其它不相關(guān)蛋白。
本發(fā)明人通過分析前列腺癌患者的前列腺分泌液的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1與前列腺癌密切相關(guān)。在前列腺癌患者的的前列腺分泌液中，結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白和SERPINB1發(fā)生顯著的表達(dá)增加。
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以以結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或 SERPINB1作為檢測(cè)(確定、鑒定或診斷)哺乳動(dòng)物前列腺癌的標(biāo)志物(標(biāo)記物)。通過分析這些蛋白中一種或多種蛋白的表達(dá)情況(包括基因水平上或蛋白水平上)，從而得知受試者的前列腺癌的情況，為疾病的診斷或預(yù)后提供依據(jù)，或可早期評(píng)估受試者罹患前列腺癌的可能性。
可采用各種技術(shù)來檢測(cè)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或 SERPINB1的表達(dá)情況，這些技術(shù)均包含在本發(fā)明中。檢測(cè)可以針對(duì)蛋白，也可針對(duì)相應(yīng)的 cDNA，或針對(duì)mRNA。可用已有的技術(shù)如(但不限于)=Western印跡、SDS-PAGE、原位雜交、 酶聯(lián)免疫反應(yīng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、Southern印跡、蛋白序列分析、質(zhì)譜分析或DNA序列分析等。
較佳地，本發(fā)明以前列腺液作為待測(cè)樣本(樣品)。
試劑和試劑盒
本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA 和/或SERPINB1的表達(dá)情況的試劑。所述的試劑例如是特異性識(shí)別(或結(jié)合)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA或SERPINB1的抗體。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，利用所述蛋白的特異性抗體來檢測(cè)所述蛋白的表達(dá)情況以及表達(dá)量，從而可作出判斷。較佳地，還設(shè)置正常的對(duì)照組，以確定所述蛋白在正常動(dòng)物體中的表達(dá)情況。較佳地，所述的特異性抗體上攜帶可識(shí)別信號(hào)，從而可方便、直觀地獲得檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA或SERPINB1、或其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物(如家兔，小鼠，大鼠等)以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng) ，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達(dá)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA或SERPINB1、或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler 等人，Nature256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur. .1.1mmunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人， Eur. .1.1mmunol. 6 :292,1976 ； Hammer I ing 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。
本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白和/或 SERPINB1的表達(dá)情況，從而分析前列腺癌狀況的試劑盒，該試劑盒包括容器，以及分別位于容器中的特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白或SERPINB1的抗體。每一種抗體位于一個(gè)容器中。
此外，所述的試劑盒中還可包括用于雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液等。
此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等，從而便于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用該試劑盒。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
本發(fā)明獲得了一批新的前列腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)，可用于開發(fā)新的前列腺癌(PCa)臨 床診斷試劑以及診斷方法。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中前列腺癌臨床實(shí)踐中面臨的由于診斷標(biāo)記物PSA的特 異性和靈敏度造成的大量不必要的活檢，這些問題一方面給病人帶來許多副作用，另外一 方面造成醫(yī)療資源和費(fèi)用的大量浪費(fèi)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1、前列腺液的收集與處理
1.1向1. 5ml Eppendorf管加入5_10ul、300倍工作溶度的、3種蛋白質(zhì)水解酶抑制 劑混合物(工作溶度如下Leupepetin 5ug/ml, Antipain 5ug/ml 與 Chymo statin IOug/ ml) ο
分裝后，將管存放-20 V冰箱待用，或直接用于下面步驟。
1. 2利用常規(guī)的臨床技術(shù)采集前列腺液滴入1.1的管中(約50ul)。
1. 3簡(jiǎn)單混勻(避免Votexing)。以下步驟都在低溫進(jìn)行。
1. 4 離心。3000rpm/分，5-10 分鐘。
1. 5將上清液收集,轉(zhuǎn)入另一個(gè)預(yù)冷的Eppendorf管,這部分就是前列腺分泌液 (EPS)。轉(zhuǎn)移液體時(shí)，不能擾動(dòng)沉淀部分。
1. 7以上所有樣品存放_(tái)80°C冰箱。
1. 8標(biāo)記好樣品。保留每一個(gè)病人(或樣品提供人)的基本病情資料(PSA水平, 腫瘤分級(jí))。
實(shí)施例2、樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法
2.1EPS樣品處理
2.1.1常規(guī)方法定量測(cè)定每一份樣品的蛋白質(zhì)濃度。
2.1. 2將前列腺癌患者與同齡人的非癌患者的EPS樣品各20份分別等量混合 (20ug蛋白/份)，即分別為實(shí)驗(yàn)組樣品(30份前列腺癌患者的樣品混合液)與對(duì)照組樣品 (30份非癌患者的樣品混合液)。
2.1. 2向樣品中加入三氯醋酸，終濃度為50% (重量/體積)，用于沉淀蛋白質(zhì)， 并達(dá)到適度凈化蛋白質(zhì)的目的。將樣品在5000rpm/min速度離心5分鐘，除去上清液。從 冰箱中取-20°C冷凍保存的常規(guī)樣品水化緩沖液，置室溫溶解。向每組樣品加入總體積為 250ul的樣品水化緩沖液，充分混勻。
2. 2雙向電泳
2. 2.1從冰箱中取冷凍保存的IPG預(yù)制膠條，室溫中放置5分鐘。然后沿著聚焦盤 的邊緣至左而右線性連續(xù)性地加入樣品溶液。上樣量為80ug/條。
2. 2. 2用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層，膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上，使得膠條的正極對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極，確保膠條兩端與正負(fù)電極緊密接觸。按常規(guī)操作進(jìn)行主動(dòng)水化。
2. 2. 3第一向等電聚焦(IEF)
IPG膠條水化后，進(jìn)行等電聚焦(電泳條件500v 2hrs)。等電聚焦結(jié)束后，迅速將IPG膠條分別置于5ml平衡緩沖液A和5ml平衡緩沖液B中各平衡20min。
2. 2. 4為了進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳，配制12%垂直SDS凝膠將垂直SDS凝膠溶液注入玻璃板夾層中，上部留Icm的空間，并將水飽和正丁醇封住最上面，聚合2小時(shí)。 此間，將經(jīng)過平衡的IPG膠條浸入電泳緩沖液中30秒鐘。然后將IPG膠條放置于SDS膠面上，使二者充分接觸，并避免操作時(shí)產(chǎn)生氣泡。用熱的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，進(jìn)行電泳，至溴酚藍(lán)離膠下沿O. 5cm)。將跑好的膠進(jìn)行常規(guī)銀染。
前列腺癌患者的EPS樣品、非前列腺癌患者的EPS樣品的電泳結(jié)果如圖1所示。
2. 3軟件分析
銀染顯色的凝膠通過GS-710光密度掃描儀獲取圖像，Imagemaster (GEhealthcare 公司)進(jìn)行分析統(tǒng)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的2-D圖譜，得到合乎統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)。
本發(fā)明人共發(fā)現(xiàn)至少15個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異點(diǎn)。
2. 4蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定
2. 4.1將所需研究的蛋白點(diǎn)從膠上割下，用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解后，萃取、并凍干酶切產(chǎn)物肽段。
2. 4. 2酶切產(chǎn)物肽段用納升級(jí)液相色譜(LC MDLC整機(jī)系統(tǒng)，GE公司)分離。經(jīng)過 C18預(yù)柱脫鹽后,通過C18分析柱(75umX15cm)分離。分離條件0.1% (體積/體積)甲酸，流速300nL/min,90分鐘梯度洗脫。每一個(gè)需要進(jìn)一步確認(rèn)的蛋白質(zhì)，其胰蛋白酶切后的肽段為母離子經(jīng)過MS/MS(LTQ ORBI TRAP ,Thermo公司)后，檢測(cè)其碎片離子的質(zhì)荷比，同時(shí)記錄信號(hào)。
2. 4.3質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)在相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下進(jìn)過SEQUEST、X ! tandem、 Trans-Proteomic-Pipeline軟件處理，檢索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。
2. 4. 4在前列腺癌患者前列腺分泌液中，表達(dá)水平顯著增加的一些蛋白質(zhì)得到了鑒定。它們分別是纖連蛋白I (Fibronectin I)、結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin) ( α鏈)、白蛋白(Albumin)、SERPINB1 與 PSA。
實(shí)施例3、前列腺癌患者組與非癌對(duì)照組前列腺分泌液中Ifepatoglobin水平的檢測(cè)
隨機(jī)將前列腺癌患者組與非癌對(duì)照組前列腺分泌液各三份，每份10微克蛋白質(zhì)用于Western Blotting技術(shù)分析。Hepatoglobin的兔多抗(一抗)為AbCam公司產(chǎn)品 (ab85846)，使用時(shí)稀釋倍數(shù)為3000-5000倍。此外，前列腺分泌液的Western Blotting技術(shù)分析涉及的其它細(xì)節(jié)都為常規(guī)技術(shù)。圖2顯示前列腺分泌液的Western Blotting技術(shù)分析結(jié)果。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人類Hepatoglobin蛋白全長(zhǎng)由406個(gè)氨基酸組成。其中前導(dǎo)肽由 18個(gè)氨基酸組成，α鏈由144個(gè)氨基酸組成。β鏈由244個(gè)氨基酸組成。α鏈與β鏈還能組合成不同比例的聚合體。此外，在α鏈上還存在各種糖基化修飾。
本發(fā)明人所用的人Hepatoglobin的兔多抗,既能識(shí)別α鏈也能識(shí)別β鏈。圖2中分子量約26KD的條帶在所有6個(gè)樣品中的含量比較接近，可作為每個(gè)樣品電泳上樣量相同的一個(gè)證據(jù)。根據(jù)分子量分析，該條帶是Hepatoglobin的β鏈。在分子量位于16KD到26KD之間，觀測(cè)到三個(gè)條帶存在于前列腺癌患者的EPS中，而它們?cè)诜前┗颊逧PS中的含量有的明顯低于前列腺癌患者，有的幾乎就測(cè)不出來。根據(jù)它們的分子量分析，它們代表Hepatoglobin的α鏈及其不同的糖基化修飾體。綜合上述，前列腺癌患者EPS中！fepatoglobin-α鏈的水平明顯高于其非癌患者EPS的存在。這一結(jié)論與本發(fā)明人上述的質(zhì)譜分析結(jié)果是一致的。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。·
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的用途，用于制備從前列腺液中診斷前列腺癌的試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的試劑還用于前列腺癌的后和/或前列腺癌治療療效的評(píng)估。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)應(yīng)結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB I這5種蛋白質(zhì)，同時(shí)制備2種、3種、4種或5種所述的從前列腺液中診斷前列腺癌的試劑。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的結(jié)合珠蛋白α鏈還包括其糖基化修飾體。
6.一種用于診斷前列腺癌的試劑，其是特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈、纖連蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑，其特征在于，所述的抗體特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈，其是多克隆抗體。
8.一種用于從前列腺液中診斷前列腺癌的試劑盒，其中包括 容器，以及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別結(jié)合珠蛋白α鏈。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括 容器，以及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別纖連蛋白I ; 容器，及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別白蛋白；和/或 容器，及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別SERPINB1。
10.如權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括 容器，及位于容器中的抗體，該抗體特異性識(shí)別PSA。
全文摘要
本發(fā)明涉及來源于前列腺分泌液中的前列腺癌標(biāo)記物。揭示了一組新的前列腺癌標(biāo)志物結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)α鏈、纖連蛋白1(Fibronectin 1)、白蛋白(Albumin)和/或SERPINB1。前列腺液中，這些蛋白質(zhì)在前列腺癌患者中的表達(dá)顯著高于非癌患者的表達(dá)。因此，可基于這些蛋白質(zhì)來開發(fā)診斷、評(píng)估、預(yù)后前列腺癌的試劑或試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102998448SQ20111026813
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者李潤(rùn)生, 林標(biāo)揚(yáng), 王健, 劉媛媛 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 浙江大學(xué)