專利名稱：一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的重要疾病之一，全世界每年有1000多萬新病例和600多萬人死亡。近年來，在醫(yī)學(xué)家、生物學(xué)家的努力下，人類對于自身的認(rèn)識已進(jìn)入微觀層次的剖析，從而對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制也有了更多的認(rèn)識。在DNA、RNA、蛋白質(zhì)、染色體以及細(xì)胞水平上觀察到一系列和細(xì)胞癌變相關(guān)的變化，這些異常的變化，實質(zhì)上就是細(xì)胞癌變不同階段的標(biāo)志。以腫瘤相關(guān)抗原作為腫瘤標(biāo)志物，通過免疫分析技術(shù)進(jìn)行檢測， 有望實現(xiàn)對腫瘤的早期診斷。目前，腫瘤標(biāo)志物的檢測主要是通過酶免疫測定、放射免疫分析、熒光免疫分析、 化學(xué)發(fā)光免疫分析以及電化學(xué)發(fā)光免疫分析來實現(xiàn)。這些方法大部分都具有很高的精度和靈敏度，可以根據(jù)所測對象的性質(zhì)選擇某一種方法進(jìn)行測量。但是它們都不同程度存在著操作復(fù)雜、費(fèi)時費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。例如，酶免疫檢測技術(shù)需要特制的進(jìn)口試劑盒，并且生物酶的獲取困難、成本較高，實驗條件也較為苛刻等；熒光檢測會受到樣品自身熒光的干擾以及光漂白效應(yīng)等。此外，不同類型的腫瘤往往存在相同的腫瘤標(biāo)志物，而同種類型的腫瘤也存在多種腫瘤標(biāo)志物，單一指標(biāo)檢測特異性不強(qiáng)、靈敏度低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，本方法具有靈敏度高、選擇性高且快速的特點(diǎn)。本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案本發(fā)明拉曼編碼微球的用途的特點(diǎn)在于所述拉曼編碼微球在腫瘤標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明拉曼編碼微球的用途的特點(diǎn)也在于所述腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原(CEA)、 甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、鐵蛋白、細(xì)胞角蛋白、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、糖類抗原125(CA125)、 糖類抗原199 (CA199)、糖類抗原50 (CA50)、糖類抗原153 (CA153)、糖類抗原7 (CA724)、糖類抗原M2(CAM》或人絨毛膜促性腺激素(HCG)。本發(fā)明利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法的特點(diǎn)在于按以下步驟操作a、將25mg拉曼編碼微球分散到IOmL pH值為7. 4的0. OlM的磷酸緩沖液(PBS) 中，加入125yg檢測抗體，在4°C下反應(yīng)12小時得到納米探針，向所述納米探針中加入質(zhì)量濃度為的牛血清白蛋白(BSA)封閉納米探針表面空位，離心、洗滌后得到拉曼編碼標(biāo)記的納米探針，分散到PBS中保存?zhèn)溆茫?br> b、將15mg 二氧化硅包覆的磁性納米粒子分散到50mL 2mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中，室溫下攪拌30分鐘得到聚乙烯亞胺修飾的納米粒子，將所述聚乙烯亞胺修飾的納米粒子分散到質(zhì)量濃度為2. 5%的戊二醛溶液中反應(yīng)1小時，離心、用PBS洗滌，然后加入75 μ g 檢測抗體對應(yīng)的包被抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng)12小時，最后加入質(zhì)量濃度為1 %的牛血清白蛋白(BSA)封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、洗滌后得到固相抗體，分散到PBS中保存?zhèn)溆?；所述聚乙烯亞胺溶液中添加有NaCl，NaCl的濃度為0. 5M ；c、將50 μ L含有腫瘤標(biāo)志物的血清加入到步驟b得到的固相抗體中，在37°C條件下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后加入步驟a得到的拉曼編碼標(biāo)記的納米探針，在37°C下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后得到免疫復(fù)合物，分散到PBS中備用；d、將步驟c得到的免疫復(fù)合物吸入毛細(xì)管中，利用外加磁場富集后進(jìn)行SERS光譜的檢測。本發(fā)明利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法的特點(diǎn)也在于所述的磁性納米粒子為Fe^3O4或γ -Fe2O3等具有超順磁性的納米粒子。本發(fā)明使用的拉曼編碼微球是按照以下方法制備得到的a、將0. 2g內(nèi)核納米粒子加入到50mL 2mg/mL的聚電解質(zhì)溶液中，室溫下攪拌30 分鐘，離心、洗滌后得到聚電解質(zhì)修飾的納米粒子，將所述聚電解質(zhì)修飾的納米粒子分散到 50mL金屬納米粒子溶膠中，室溫下攪拌30分鐘得到單層金屬納米粒子包覆的核殼納米粒子，將所述單層金屬納米粒子包覆的核殼納米粒子重復(fù)依次加入聚電解質(zhì)溶液和金屬納米粒子溶膠中，得到多層金屬納米粒子包覆的核殼納米微球；所述聚電解質(zhì)溶液中添加NaCl，NaCl的濃度為0. 5M。b、將ImL 5mM的拉曼活性物質(zhì)加入到步驟a得到的多層金屬納米粒子包覆的核殼納米微球中，室溫下攪拌6-12小時，離心、洗滌后得到拉曼活性物質(zhì)標(biāo)記的核殼納米微球；C、將步驟b得到的拉曼活性物質(zhì)標(biāo)記的核殼納米微球加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2. 5%的戊二醛溶液中，反應(yīng)1小時后用超純水洗滌，得到封裝的拉曼活性物質(zhì)標(biāo)記的核殼納米微球，分散于超純水中，備用。所述內(nèi)核納米粒子為二氧化硅納米粒子、聚合物納米粒子或磁性納米粒子，粒徑為 100-800nm。所述金屬納米粒子為金納米粒子、銀納米粒子或銅納米粒子等具有顯著等離子體共振性質(zhì)的金屬納米粒子，粒徑為5-15nm。所述拉曼活性物質(zhì)為含有芳環(huán)、雜環(huán)、氨基、羧酸基、磷原子或硫原子等具有拉曼活性的物質(zhì)。所述聚電解質(zhì)為聚乙烯亞胺、聚烯丙基氯化銨、聚二甲基二烯丙基氯化銨、明膠或殼聚糖等含有大量氨基官能團(tuán)的水溶性聚合物。本發(fā)明檢測腫瘤標(biāo)志物方法中用拉曼活性分子進(jìn)行標(biāo)記，依據(jù)不同拉曼活性分子的特征譜峰進(jìn)行拉曼編碼，通過抗體偶聯(lián)技術(shù)制備拉曼編碼的免疫納米探針；選用磁性納米粒子作為固相抗體，設(shè)計基于磁性固相粒子選擇性分離效應(yīng)的多組分“固相抗體-待測抗原-標(biāo)記免疫探針”三明治免疫檢測結(jié)構(gòu)；通過拉曼編碼微球表面超強(qiáng)SERS效應(yīng)和編碼分子的拉曼信號輸出實現(xiàn)對多腫瘤標(biāo)志物的同步檢測。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果
1、本發(fā)明使用的拉曼編碼微球具有超強(qiáng)SERS效應(yīng)，可用于對多組分超痕量目標(biāo)分析物進(jìn)行定量化分析。2、本發(fā)明選用磁性納米粒子作為固相抗體，可實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的快速分離和富集。3、本發(fā)明使得SERS技術(shù)應(yīng)用范圍拓寬，可選擇大量不同表面增強(qiáng)拉曼特征振動的分子作為標(biāo)記物同時檢測多種待測物，為真正使SERS這種高靈敏度的檢測技術(shù)普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷與研究中奠定基礎(chǔ)。
四

圖1為利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法示意圖。圖2為實施例1檢測腫瘤標(biāo)志物CEA的SERS光譜圖。SERS光譜檢測的激發(fā)光源波長是532nm。圖2中1079,1142,1390,1434,1578011-1的振動峰是對巰基苯胺的典型特征振動，并且信號的強(qiáng)度隨著CEA的濃度增加而增大，所以從檢測到的對巰基苯胺的SERS信號，可判斷待測樣品中含有腫瘤標(biāo)志物CEA。右上角的附圖為拉曼強(qiáng)度比值(IeEA/IblaJ與腫瘤標(biāo)志物CEA濃度的線性關(guān)系，可以看出在0. lpg/mL l.Ong/mL濃度范圍呈線性關(guān)系， R = O. 994 (R表示線性相關(guān)系數(shù))。圖3為實施例2同時檢測腫瘤標(biāo)志物AFP、PSA和CA125的SERS光譜圖。SERS光譜檢測的激發(fā)光源波長是532nm。曲線a代表3-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的拉曼編碼粒子對AFP 檢測的拉曼光譜圖，其中992cm—1峰是3-甲氧基苯硫酚的特征譜峰。曲線b代表2-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的拉曼編碼粒子對PSA檢測的拉曼光譜圖，其中1039CHT1峰是2-甲氧基苯硫酚的特征譜峰。曲線c代表2-萘硫酚標(biāo)記的拉曼編碼粒子對CA125檢測的拉曼光譜圖，其中 1380cm"1峰是2-萘硫酚的特征譜峰。曲線d代表這3種拉曼編碼粒子對AFP、PSA和CA125 同時檢測的拉曼光譜圖，992、1039和1380CHT1峰的信號均能被檢測到。這一結(jié)果表明基于拉曼編碼微球的免疫檢測方法可以應(yīng)用于多腫瘤標(biāo)志物的免疫分析。
五具體實施例方式實施例1 本實施例以腫瘤標(biāo)志物CEA為例，闡述利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物CEA的方法。(一 )拉曼編碼微球的制備a、取95mL超純水，依次加入ImL 30mM檸檬酸鈉溶液和2mL 5mM硝酸銀溶液，然后迅速注入ImL 50mM硼氫化鈉溶液，室溫下攪拌30秒后，加入ImL 5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮， 溶液逐漸變?yōu)樯铧S色，即得直徑為5-15nm的銀納米粒子溶膠。b、將3. 6mL正硅酸四乙酯和88. ImL乙醇混合加入到250mL圓底燒瓶，攪拌條件下迅速加入11. 9mL氨水，在室溫條件下使其完全反應(yīng)，即得直徑約為200nm的二氧化硅納米粒子。c、取25mL步驟b制備的二氧化硅納米粒子，離心并分散于50mL 2mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中，聚乙烯亞胺溶液中添加有NaCl，NaCl的濃度為0. 5M，室溫下攪拌30分鐘，然后離心洗滌，重新分散到步驟a制備的銀溶膠中，室溫下攪拌30分鐘得到單層銀納米粒子包覆的二氧化硅納米微球，將得到的單層銀納米粒子包覆的二氧化硅納米微球重復(fù)依次加入聚乙烯亞胺溶液和銀納米粒子溶膠中，交替沉積聚乙烯亞胺和銀溶膠，即得到不同組裝層數(shù)的核殼二氧化硅納米微球。d、將ImL 5mM的對巰基苯胺加入到5mg核殼二氧化硅納米微球中，室溫下攪拌6 小時，然后離心、洗滌，即制得對巰基苯胺標(biāo)記的核殼納米微球。e、將對巰基苯胺標(biāo)記的核殼納米微球浸泡在質(zhì)量濃度2. 5%的戊二醛溶液中反應(yīng) 1小時，用PH值為7. 4的0. OlM的磷酸緩沖液(PBS)充分淋洗，去除未反應(yīng)的戊二醛，即得封裝的對巰基苯胺標(biāo)記的核殼納米微球，即拉曼編碼微球。( 二 )拉曼編碼標(biāo)記的納米探針的制備向上述制備的25mg拉曼編碼微球中加入125 μ g CEA抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng)12 小時，最后用質(zhì)量濃度為BSA封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、洗滌后得到拉曼編碼標(biāo)記的納米探針，將得到的拉曼編碼標(biāo)記的納米探針分散在PBS中保存待用。(三)磁性固相抗體的制備a、稱取1. 35g FeCl3 · 6H20，依次加入40mL乙二醇、0. 5g聚乙二醇和3. 6g無水醋酸鈉，室溫下攪拌12小時得到均勻的溶液，然后將其轉(zhuǎn)移到50mL反應(yīng)釜中，在200°C條件下反應(yīng)M小時即得直徑約為300nm的!^e3O4納米粒子。b、取0. Ig Fe3O4納米粒子，置于50mL 0. IM HCl中超聲10分鐘，然后分散于IOOmL 乙醇/水(乙醇和水的體積比=4 1)溶液中，再依次加入ImL氨水和30 μ L正硅酸四乙酯，室溫下攪拌6小時，離心后得到二氧化硅包覆的!^e3O4納米粒子，將15mg 二氧化硅包覆的I^e3O4納米粒子分散于50mL 2mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中，聚乙烯亞胺溶液中含0. 5M的 NaCl，室溫下攪拌30分鐘，離心、洗滌后浸泡在質(zhì)量濃度2. 5%的戊二醛溶液中反應(yīng)1小時， 用PBS充分淋洗，去除未反應(yīng)的戊二醛，然后加入75 μ g CEA包被抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng) 12小時，最后用質(zhì)量濃度為1 %的BSA封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、洗滌后得到固相抗體， 將所得固相抗體分散在PBS中保存待用。(四)拉曼編碼微球?qū)δ[瘤標(biāo)志物CEA的SERS免疫檢測a、將50 μ L含有腫瘤標(biāo)志物CEA的血清加入到步驟(三)制備的固相抗體中，在 37°C下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后加入步驟(二)得到的拉曼編碼標(biāo)記的納米探針，在 37°C下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后得到免疫復(fù)合物，將免疫復(fù)合物分散到PBS中備用。b、將步驟a得到的免疫復(fù)合物吸入毛細(xì)管中，磁性富集后進(jìn)行SERS光譜的檢測。 檢測結(jié)果見圖2。實施例2 —種拉曼編碼微球?qū)δ[瘤標(biāo)志物AFP、PSA和CA125的同時檢測(一 )拉曼編碼微球的制備本實施例中拉曼編碼微球的制備方法同實施例1，不同的是分別用3-甲氧基苯硫酚、2-甲氧基苯硫酚和2-萘硫酚取代對巰基苯胺作為拉曼活性物質(zhì)，分別得到封裝的3-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的核殼納米微球、封裝的2-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的核殼納米微球和封裝的 2-萘硫酚標(biāo)記的核殼納米微球。( 二)拉曼編碼標(biāo)記的納米探針的制備向上述制備的25mg封裝的3_甲氧基苯硫酚標(biāo)記的核殼納米微球中加入125 μ g AFP抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng)12小時，最后用質(zhì)量濃度為1 % BSA封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、洗滌后得到3-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的納米探針，將得到的3-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的納米探針分散在PBS中保存待用。向上述制備的25mg封裝的2_甲氧基苯硫酚標(biāo)記的核殼納米微球中加入125 μ g PSA抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng)12小時，最后用質(zhì)量濃度為BSA封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、洗滌后得到2-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的納米探針，將得到的2-甲氧基苯硫酚標(biāo)記的納米探針分散在PBS中保存待用。向上述制備的25mg封裝的2_萘硫酚標(biāo)記的核殼納米微球中加入125 μ g CA125 抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng)12小時，最后用質(zhì)量濃度為1 % BSA封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、 洗滌后得到2-萘硫酚標(biāo)記的納米探針，將得到的2-萘硫酚標(biāo)記的納米探針分散在PBS中保存待用。將上述三種納米探針混合后得到納米探針的混合溶液，備用。(三)磁性固相抗體的制備本實施例中固相抗體的制備方法同實施例1，不同的是分別以AFP包被抗體、PSA 包被抗體和CA125包被抗體替換CEA包被抗體，分別得到AFP固相抗體、PSA固相抗體和 CA125固相抗體，將上述三種不同的固相抗體混合后得到混合固相抗體。(四)拉曼編碼微球?qū)δ[瘤標(biāo)志物CEA的SERS免疫檢測a、將含有腫瘤標(biāo)志物AFP、PSA和CA125的血清加入到混合固相抗體中，在37°C條件下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后加入納米探針的混合溶液，在37°C條件下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后得到混合免疫復(fù)合物，將所得混合免疫復(fù)合物分散到PBS中備用。b、將步b得到的混合免疫復(fù)合物吸入毛細(xì)管中，磁性富集后進(jìn)行SERS光譜的檢測。檢測結(jié)果見圖3。本發(fā)明實施例中使用的0. OlM磷酸緩沖液(pH 7. 4)的配制方法如下將1. 22g K2HPO4,0. 136g KH2PO4 和 0. 85g NaCl 溶解在 IOOmL 超純水中，然后再用超純水稀釋至IOOOmL即可。
權(quán)利要求
1.一種拉曼編碼微球的用途，其特征在于所述拉曼編碼微球在腫瘤標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的拉曼編碼微球的用途，其特征在于所述腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特異性抗原、鐵蛋白、細(xì)胞角蛋白、鱗狀細(xì)胞癌抗原、酸性磷酸酶、 堿性磷酸酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、糖類抗原125、糖類抗原199、糖類抗原50、糖類抗原 153、糖類抗原724、糖類抗原242或人絨毛膜促性腺激素。
3.利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，其特征在于按以下步驟操作a、將25mg拉曼編碼微球分散到IOmLpH值為7. 4的0. OlM的磷酸緩沖液中，加入 125 μ g檢測抗體，在4°C下反應(yīng)12小時得到納米探針，向所述納米探針中加入質(zhì)量濃度為的牛血清白蛋白封閉納米探針表面空位，離心、洗滌后得到拉曼編碼標(biāo)記的納米探針；b、將15mg二氧化硅包覆的磁性納米粒子分散到50mL 2mg/mL的聚乙烯亞胺溶液中，室溫下攪拌30分鐘得到聚乙烯亞胺修飾的納米粒子，將所述聚乙烯亞胺修飾的納米粒子分散到質(zhì)量濃度為2. 5%的戊二醛溶液中反應(yīng)1小時，離心、用PBS洗滌，然后加入75 μ g檢測抗體對應(yīng)的包被抗體，在4°C環(huán)境下反應(yīng)12小時，最后加入質(zhì)量濃度為1 %的牛血清白蛋白封閉未反應(yīng)的醛基空位，離心、洗滌后得到固相抗體；所述聚乙烯亞胺溶液中添加有NaCl，NaCl的濃度為0. 5M ；C、將50μ L含有腫瘤標(biāo)志物的血清加入到步驟b得到的固相抗體中，在37°C條件下反應(yīng)1小時，磁性分離、洗滌后加入步驟a得到的拉曼編碼標(biāo)記的納米探針，在37°C下反應(yīng)1 小時，磁性分離、洗滌后得到免疫復(fù)合物；d、將步驟c得到的免疫復(fù)合物吸入毛細(xì)管中，利用外加磁場富集后進(jìn)行SERS光譜的檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，其特征在于所述的磁性納米粒子為狗304或γ -Fe2O3納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種拉曼編碼微球的用途及利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，其中拉曼編碼微球的用途是在腫瘤標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用；利用拉曼編碼微球檢測腫瘤標(biāo)志物的方法是將拉曼編碼微球分散到磷酸緩沖液中并加入檢測抗體反應(yīng)得到納米探針，再以牛血清白蛋白封閉納米探針表面空位得到拉曼編碼標(biāo)記的納米探針；將含有腫瘤標(biāo)志物的血清加入固相抗體中，反應(yīng)后加入拉曼編碼標(biāo)記的納米探針，得到免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物經(jīng)過外加磁場富集后進(jìn)行SERS光譜的檢測。本發(fā)明使用的拉曼編碼微球具有超強(qiáng)SERS效應(yīng)，可用于對多組分超痕量目標(biāo)分析物進(jìn)行定量化分析，并可選擇大量不同表面增強(qiáng)拉曼特征振動的分子作為標(biāo)記物同時檢測多種待測物。
文檔編號G01N33/574GK102323412SQ20111022679
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者關(guān)貴儉, 劉仁勇, 劉變化, 張忠平, 蔣長龍 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院