專利名稱：體外模擬評(píng)定液體飼料復(fù)合酶質(zhì)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外模擬評(píng)定液體飼料復(fù)合酶質(zhì)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
飼用酶制劑作為一類高效、無毒副作用、環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑，能夠直接提高飼料產(chǎn)品質(zhì)量及轉(zhuǎn)化利用率，降低飼料成本，已被業(yè)界公認(rèn)具有良好的實(shí)用效果，為飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了很大的促進(jìn)作用，有著十分廣闊的前景。但是，酶制劑的化學(xué)本質(zhì)是一類蛋白質(zhì)，其特定的空間結(jié)構(gòu)在飼料加工過程中 (如制粒、膨化等)，不可避免地會(huì)受高溫、高壓等因素的強(qiáng)烈作用而遭到破壞，導(dǎo)致酶變性失活，從而對(duì)酶制劑的最終使用效果產(chǎn)生了很大的影響。為了避免飼料加工過程中高溫、壓力等因素對(duì)酶制劑的破壞作用，通常采用一定的劑型辦法對(duì)其進(jìn)行保護(hù)(如采用包衣、包被、微丸等劑型處理等)。但這些劑型處理的飼用酶制劑還是存在著一些不足，例如，制粒溫度超過85 °C，酶制劑仍然會(huì)有一定的損失等。因此，在制粒后通過噴涂液體酶制劑，可以完全避免制粒時(shí)高溫、高壓、剪切力等因素對(duì)酶制劑的破壞作用。液體后噴涂是顆粒飼料使用酶制劑的終極解決方案。目前，已被國內(nèi)外的飼料生產(chǎn)企業(yè)廣泛接受。因?yàn)槭褂靡后w飼料復(fù)合酶完全避免了飼料制粒、膨化過程中對(duì)酶制劑的破壞作用，減少加工的損失，根本上保證了飼料的品質(zhì)。同時(shí)可使酶制劑等熱敏性微量組分免受熱加工的損害，減少這些組分的超額添加量，從而降低飼料生產(chǎn)成本。衡量液體飼料復(fù)合酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量水平和作用效果的依據(jù)主要是酶的種類、含量、活性、穩(wěn)定性和動(dòng)物飼養(yǎng)效果。而目前中國廣大酶制劑使用廠家，在篩選液體飼料復(fù)合酶制劑時(shí)，主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)單一酶種酶活的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)方法主要有國家農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn) (NY/T 2006-2009，主要是纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶)或企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或輕工業(yè)部方法，哪怕同一酶種同一酶活，不同企業(yè)標(biāo)示的結(jié)果差別很大，因?yàn)?，酶活力的定義不同，其酶活數(shù)值有很大不同。1961年，國際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定在特定條件(25°C、最適pH及底物濃度)下， Imin內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μ mol底物(或底物中1 μ mol有關(guān)基團(tuán))所需的酶量，為1個(gè)酶活力單位。 此酶活力單位又稱國際單位(international unit，IU)，單位為μπιο /min。但實(shí)際應(yīng)用中酶活力的定義，有些是出于應(yīng)用方便，有些是沿用習(xí)慣，差別很大。例如目前所見的不同文獻(xiàn)或生產(chǎn)廠商對(duì)木聚糖酶活力的定義達(dá)6種之多，其酶活力數(shù)值大小迥異(表1-1)。表1-1木聚糖酶活力數(shù)值不同定義方法的不同國際單位(IU)其他定義所使用單位及換算值μmol/minμmol/hμmol/snmol/minnmol/sU g/min與IU換算系數(shù)1601/6010001000/60150酶活力10006000016. 7100000016700150000從表1-1中數(shù)據(jù)可見，不同定義的酶活力數(shù)值差異很大。當(dāng)然，測(cè)定方法和測(cè)定條件相同的前提下，酶活換算后是可以直接進(jìn)行比較的。但實(shí)踐中，酶活高的，在動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)中，并不一定表現(xiàn)出好的效果。一是酶活的檢測(cè)條件并不能代表動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)際環(huán)境，因此，酶在動(dòng)物體內(nèi)不一定充分發(fā)揮最佳效果；二是選用的底物不能完全代表飼料，酶發(fā)揮作用的條件必須有充足的相對(duì)應(yīng)的底物，否則不能發(fā)揮較好作用效果；三是菌種不同，產(chǎn)生的酶對(duì)底物的催化功能也不同；四是生產(chǎn)方式(固態(tài)/液態(tài)發(fā)酵)不同，酶的純度及衛(wèi)生指標(biāo)不同，就是同一生產(chǎn)方式中的不同生產(chǎn)條件也會(huì)產(chǎn)生種類不同的酶，導(dǎo)致其催化功能差異。用酶活來評(píng)估液體飼料復(fù)合酶在動(dòng)物生產(chǎn)中的實(shí)際效果是不科學(xué)的，酶活高低并不能用來預(yù)測(cè)產(chǎn)品的相對(duì)性能。于是，大多廠家開始轉(zhuǎn)向動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和比較，花費(fèi)很多的人力、物力和財(cái)力，投入動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)，做了大量的效果驗(yàn)證試驗(yàn)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶制劑的作用不穩(wěn)定，基本上呈現(xiàn)效果好與沒有效果的比率各為50%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，有些試驗(yàn)反復(fù)做，一次不行，二次，二次不行三次…，甲用戶做后，乙用戶做，乙客戶做完，丙客戶做…。耗費(fèi)很多時(shí)間的同時(shí)也浪費(fèi)了金錢。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和科學(xué)易行的評(píng)定方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種體外模擬評(píng)定液體飼料復(fù)合酶質(zhì)量的方法。一種體外模擬評(píng)定液體飼料復(fù)合酶質(zhì)量的方法，包括以下步驟步驟1 配制DNS 試劑稱取氫氧化鈉100. Og加水溶解，定容至500mL(命名為A試液)。稱取3，5- 二硝基水楊酸15. 75g，將其緩慢加入到2500mL蒸餾水中，不斷攪拌，水浴至45°C，向其中逐步加入 500mL A試液，不斷攪拌至溶液清澈透明(在加入氫氧化鈉溶液過程中，溶液溫度不要超過 480C )。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉455g、苯酚12. 5g、無水亞硫酸鈉12. 5g，繼續(xù)45°C水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)水1500mL，不斷攪拌，至上述物質(zhì)完全溶解后，冷卻至室溫，并定容到5000mL， 儲(chǔ)存于棕色瓶中，標(biāo)識(shí)名稱和配制日期，避光，室溫保存7天后可以使用。有效期3個(gè)月。步驟2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線吸取lmg/ml無水葡萄糖溶液0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1.0ml 于試管中，補(bǔ)水至20ml，加DNS試劑:3ml，混合后于沸水中煮IOmin，冷卻，定容至15ml，于分光光度計(jì)MOnm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)；以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述步驟重復(fù)三次，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值用最小二乘法擬合一元線性方程y = ax+b，求出吸光度(y)與葡萄糖量(χ)的關(guān)系；步驟3 胃蛋白酶液配制將IOg胃蛋白酶加入IOOOml水中，然后用3mol/L HCl 調(diào)節(jié)PH值至2. 5得到胃蛋白酶液備用；
在三角瓶中按料液比為(g ml)l 3. 7加入所述胃蛋白酶液，在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三角瓶中分別加入待評(píng)定的液體復(fù)合酶lml，在38°C搖床中振蕩，分別在lh、3hjh每組取出一個(gè)三角瓶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至5. 0以上，然后在4000轉(zhuǎn)離心機(jī)中離心lOmin， 取出上清液；吸取一定量上清液至15ml刻度管中加水補(bǔ)至anl，加3mlDNS，在沸水浴中煮沸 IOmin后取出迅速用冷水冷卻；定容至15ml，于分光光度計(jì)MOnm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)；保證吸光值在0. 25-0. 35之間；步驟4 采用以下公式計(jì)算y = ax+b，根據(jù)吸光度(y)計(jì)算葡萄糖量(χ)；步驟5 結(jié)果分析還原糖含量高的，說明飼料復(fù)合酶的質(zhì)量較好。以上方法比較科學(xué)地判斷液體飼料復(fù)合酶的質(zhì)量和應(yīng)用效果。減少檢測(cè)費(fèi)用，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間。幫助飼料酶使用客戶較好地評(píng)定和判斷液體飼料復(fù)合酶的質(zhì)量。


圖1為飼料中還原糖本分含量與消化時(shí)間關(guān)系趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。主要試劑氫氧化鈉(GB629)化學(xué)純；3，5- 二硝基水楊酸化學(xué)純；四水酒石酸鉀鈉化學(xué)純；苯酚化學(xué)純；無水亞硫酸鈉化學(xué)純；葡萄糖化學(xué)純；胃蛋白酶，生化試劑，規(guī)格1 15000，產(chǎn)地中國。步驟1 :DNS試劑的配制稱取氫氧化鈉100. Og加水溶解，定容至500mL(命名為A試液)。稱取3，5_ 二硝基水楊酸15. 75g，將其緩慢加入到2500mL蒸餾水中，不斷攪拌，水浴至45°C，向其中逐步加入 500mL A試液，不斷攪拌至溶液清澈透明(在加入氫氧化鈉溶液過程中，溶液溫度不要超過 480C )。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉455g、苯酚12. 5g、無水亞硫酸鈉12. 5g，繼續(xù)45°C水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)水1500mL，不斷攪拌，至上述物質(zhì)完全溶解后，冷卻至室溫，并定容到5000mL， 儲(chǔ)存于棕色瓶中，標(biāo)識(shí)名稱和配制日期，避光，室溫保存7天后可以使用。有效期3個(gè)月。步驟2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制吸取lmg/ml無水葡萄糖溶液0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. Oml 于試管中，補(bǔ)水至2ml，加DNS試劑3ml，混合后于沸水中煮lOmin，冷卻，定容至15ml，于分光光度計(jì)MOnm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述步驟重復(fù)三次，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值用最小二乘法擬合一元線性方程y = ax+b，求出吸光度(y)與葡萄糖量(χ)的關(guān)系。步驟3 胃蛋白酶液配制將IOg胃蛋白酶加入IOOOml水中，然后用3mol/L HCl 調(diào)節(jié)PH值至2. 5備用(注此溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配)。以比較3種不同液體復(fù)合酶的效果為例取12個(gè)150ml三角瓶，每個(gè)三角瓶中準(zhǔn)確稱取IOg全價(jià)料，分成四組，一個(gè)為對(duì)照組，其它三個(gè)為實(shí)驗(yàn)組，每一組均設(shè)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為lh、3h、5h，每個(gè)三角瓶中按料液比為1 3. 7加入37ml (即10克全價(jià)料中添加 37ml胃蛋白酶液)胃蛋白酶液，在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三角瓶中分別加入待評(píng)定和比較的三種不同液體復(fù)合酶Iml (編號(hào)1、2、；3)，在38°C搖床中振蕩，分別在lh、3hjh每組取出一個(gè)三角瓶，用氫氧化鈉(0. 2mol/L，大約五滴)調(diào)節(jié)pH值至5.0以上，然后在4000轉(zhuǎn)離心機(jī)中離心 lOmin，取出上清液。吸取一定量上清液至15ml刻度管中加水補(bǔ)至20ml，加3mlDNS，在沸水浴中煮沸IOmin后取出迅速用冷水冷卻。定容至15ml，于分光光度計(jì)MOnm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度y (A)。保證吸光值在0. 25-0. 35之間。步驟4 采用公式計(jì)算葡萄糖量y = ax+b，根據(jù)吸光度(y)求出葡萄糖量(χ)，進(jìn)而可以計(jì)算出葡萄糖的百分含量(即還原糖的百分含量)。步驟5:結(jié)果分析還原糖含量高的，說明飼料復(fù)合酶的質(zhì)量好些。與動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)比顯示，動(dòng)物飼養(yǎng)效果的結(jié)果與以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很高的相關(guān)性 (> 0. 95)。即采取以上方法基本上能鑒別出液體飼料復(fù)合酶的質(zhì)量。按照上述方法，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，說明3號(hào)酶產(chǎn)品效果好于其他組酶制劑產(chǎn)品。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種體外模擬評(píng)定液體飼料復(fù)合酶質(zhì)量的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1 配制DNS試劑稱取氫氧化鈉100. Og加水溶解，定容至500mL(命名為A試液)。稱取3，5- 二硝基水楊酸15. 75g，將其緩慢加入到2500mL蒸餾水中，不斷攪拌，水浴至45°C，向其中逐步加入500mL A試液，不斷攪拌至溶液清澈透明(在加入氫氧化鈉溶液過程中，溶液溫度不要超過48°C )。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉455g、苯酚12. 5g、無水亞硫酸鈉12. 5g，繼續(xù)45°C水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)水1500mL，不斷攪拌，至上述物質(zhì)完全溶解后，冷卻至室溫，并定容到5000mL，儲(chǔ)存于棕色瓶中，標(biāo)識(shí)名稱和配制日期，避光，室溫保存7天后可以使用。有效期3個(gè)月。步驟2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線吸取lmg/ml無水葡萄糖溶液0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Oml于試管中，補(bǔ)水至20ml，加DNS試劑:3ml，混合后于沸水中煮IOmin，冷卻，定容至15ml，于分光光度計(jì)MOnm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)；以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述步驟重復(fù)三次，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值用最小二乘法擬合一元線性方程y = ax+b，求出吸光度(y)與葡萄糖量(χ)的關(guān)系；步驟3 胃蛋白酶液配制將IOg胃蛋白酶加入IOOOml水中，然后用3mol/L HCl調(diào)節(jié) pH值至2. 5得到胃蛋白酶液備用；在三角瓶中按料液比為(g ml)l 3. 7加入所述胃蛋白酶液，在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的三角瓶中分別加入待評(píng)定的液體復(fù)合酶lml，在38°C搖床中振蕩，分別在lh、3hjh每組取出一個(gè)三角瓶，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至5. 0以上，然后在4000轉(zhuǎn)離心機(jī)中離心lOmin，取出上清液；吸取一定量上清液至15ml刻度管中加水補(bǔ)至anl，加3mlDNS，在沸水浴中煮沸 IOmin后取出迅速用冷水冷卻；定容至15ml，于分光光度計(jì)MOnm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(A)；保證吸光值在0. 25-0. 35之間；步驟4 采用以下公式計(jì)算y = ax+b，根據(jù)吸光度(y)計(jì)算葡萄糖量(χ)； 步驟5 結(jié)果分析還原糖含量高的，說明飼料復(fù)合酶的質(zhì)量較好。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外模擬評(píng)定液體飼料復(fù)合酶質(zhì)量的方法，包括以下步驟步驟1配制DNS試劑步驟2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；步驟3胃蛋白酶液配制；步驟4采用以下公式計(jì)算y＝ax+b，根據(jù)吸光度(y)計(jì)算葡萄糖量(x)；步驟5結(jié)果分析還原糖含量高的，說明飼料復(fù)合酶的質(zhì)量較好。以上方法比較科學(xué)地判斷液體飼料復(fù)合酶的質(zhì)量和應(yīng)用效果。減少檢測(cè)費(fèi)用，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間。幫助飼料酶使用客戶較好地評(píng)定和判斷液體飼料復(fù)合酶的質(zhì)量。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102279163SQ201110187029
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者陳清華 申請(qǐng)人:湖南利爾康生物有限公司