專利名稱：一種檢測水樣中汞離子濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測水樣中汞離子濃度的方法。
背景技術(shù)：
石英晶體微天平OiCM)是一種利用石英晶體諧振器的壓電特性制成的傳感器。它將石英晶振電極表面質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號的頻率變化，進(jìn)而通過計算機等其他輔助設(shè)備獲得高精度的數(shù)據(jù)。Sauerbrey方程是壓電質(zhì)量效應(yīng)傳感的主要理論依據(jù)，其發(fā)展使石英晶體微天平作為質(zhì)量傳感器得到廣泛應(yīng)用，檢測靈敏度可以達(dá)到ng 級。DNA寡核苷酸作為探針特異性識別汞離子的方法在很多領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用。 研究表明，胸腺嘧啶(T)在汞離子存在下可以通過與汞離子的配位作用偶聯(lián)，從而引起含有T-T錯配的DNA單鏈的相互雜交成雙鏈。堿基T與Hg2+的特異性結(jié)合作用被廣泛用于研究各種新型Hg2+傳感檢測方法，如顏色變化、熒光、電化學(xué)方法等。這些方法均具有很高的選擇性，但仍需要進(jìn)行標(biāo)記，或者借助熒光儀器、紫外-可見分光光度儀等昂貴笨重的儀器，檢測成本仍然較高。納米金顆粒是尺寸分布在納米數(shù)量級的金顆粒，它由于納米效應(yīng)而具有很多特殊性質(zhì)，常用于檢測DNA、蛋白質(zhì)等。在QCM檢測中，納米金顆粒由于其密度大穩(wěn)定性高便于修飾等特點，廣泛用QCM傳感器的信號放大，在QCM上DNA、蛋白質(zhì)等檢測中得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測水樣中汞離子濃度的方法。本發(fā)明提供的檢測水樣中汞離子濃度的方法，包括如下步驟(1)將待測水樣與溶液B混合后與交聯(lián)于QCM石英片的金電極上的單鏈DNA探針 A進(jìn)行雜交，記錄QCM石英片的讀數(shù)a ；所述溶液B為含有單鏈DNA探針B的溶液；所述QCM 石英片來自于氣相型、采用金電極的石英晶體微天平；(2)將步驟(1)雜交得到的QCM石英片與交聯(lián)于納米金顆粒上的單鏈DNA探針C 進(jìn)行雜交，記錄QCM石英片的讀數(shù)b ；(3)計算QCM石英片的頻率響應(yīng)；QCM石英片的頻率響應(yīng)=(a-b)，單位為Hz ；(4)根據(jù)QCM石英片的頻率響應(yīng)得出待測溶液中的汞離子濃度； 所述單鏈DNA探針A包括一個功能區(qū)段，即功能區(qū)段A ；所述功能區(qū)段A的長度占單鏈DNA探針A長度的60%以上；所述功能區(qū)段A的長度為6-12bp (如8_10bp，如9bp)； 所述功能區(qū)段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；
所述單鏈DNA探針B包括兩個功能區(qū)段，即功能區(qū)段Bl和功能區(qū)段B2 ；所述功能區(qū)段Bl的長度和所述功能區(qū)段B2的長度之和占單鏈DNA探針B長度的60%以上；所述功能區(qū)Bl中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述功能區(qū)段A與所述功能區(qū)段Bl遵循堿基互補配對原則甲；所述堿基互補配對原則甲中，核苷酸T與核苷酸T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對；所述單鏈DNA探針C包括一個功能區(qū)段，即功能區(qū)段C ；所述功能區(qū)段C的長度占單鏈DNA探針C長度的60%以上；所述單鏈DNA探針C的長度為9_20bp (如9_16bp，如 ll-Mbp，如13bp)；所述功能區(qū)段C與所述功能區(qū)段B2遵循堿基互補配對原則乙；所述堿基互補配對原則乙中，核苷酸A與核苷酸T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對。所述單鏈DNA探針A的核苷酸序列可如序列表的序列1所示，所述單鏈DNA探針B 的核苷酸序列可如序列表的序列2所示，所述單鏈DNA探針C的核苷酸序列可如序列表的序列3所示。所述單鏈DNA探針A的核苷酸序列可如序列表的序列4所示，所述單鏈DNA探針B 的核苷酸序列可如序列表的序列5所示，所述單鏈DNA探針C的核苷酸序列可如序列表的序列6所示。所述單鏈DNA探針A可通過末端的巰基交聯(lián)于所述QCM石英片的金電極上。所述單鏈DNA探針C可通過末端的巰基交聯(lián)于所述納米金顆粒上。所述單鏈DNA探針A可采用任何現(xiàn)有常規(guī)方法交聯(lián)于所述QCM石英片的金電極， 具體可通過如下方法交聯(lián)于所述QCM石英片的金電極在所述QCM石英片表面的金電極上滴加10 μ L溶液Α，吸附池；清洗干燥后加50 μ L ImM 6-巰基-1-己醇的乙醇溶液，吸附 Ih ；清洗干燥后得到交聯(lián)有所述單鏈DNA探針A的QCM石英片；所述溶液A為含有單鏈DNA 探針A的溶液。所述單鏈DNA探針C可采用任何現(xiàn)有常規(guī)方法交聯(lián)于所述納米金顆粒，具體可通過如下方法交聯(lián)于所述納米金顆粒上取200 μ L所述納米金顆粒的溶膠加入50 μ L溶液C，孵育Mh ；然后加入250 μ L PBS緩沖液靜置48h，離心并洗滌沉淀；最后沉淀分散到 250 μ L PBS緩沖液，得到交聯(lián)有單鏈DNA探針C的納米金顆粒；所述溶液C為含有所述單鏈DNA探針C的溶液。所述納米金顆粒的粒徑優(yōu)選為12-65nm。所述PBS緩沖液優(yōu)選為如下緩沖液pH7. 4，由Nei2HPO4、NaH2PO4、NaClO4和水組成， Na2HPO4的濃度為10mM，NaH2PO4的濃度為10mM，NaClO4的濃度為0. 1M。 所述溶液A可由所述單鏈DNA探針A和PBS緩沖液組成，所述單鏈DNA探針A的濃度優(yōu)選為20ηΜ-20 μ M (最優(yōu)選為2 μ Μ)。所述溶液B由可所述單鏈DNA探針B和PBS緩沖液組成，所述單鏈DNA探針B的濃度優(yōu)選為20 μ Μ。所述溶液C可由所述單鏈DNA探針C 和PBS緩沖液組成，所述單鏈DNA探針C的濃度優(yōu)選為20 μ Μ。所述溶液A和/或所述溶液B和/或所述溶液C中，所述PBS緩沖液優(yōu)選為如下緩沖液ρΗ7· 4，由 Na2HP04、NaH2PO4, NaClO4 和水組成，Na2HPO4 的濃度為 10mM，NaH2PO4 的濃度為IOmM, NaClO4的濃度為0. IM0所述待測溶液中汞離子的濃度可為ΙηΜ-20 μ Μ(線性最好，如果檢測后濃度在本濃度以上，可以進(jìn)行稀釋后再次檢測)。步驟(1)中，所述雜交的條件可為37°C池。步驟O)中，所述雜交的條件可為 37 0C 2h。本發(fā)明還保護(hù)一種檢測水中汞離子濃度的試劑盒，包括如下組分納米金顆粒，由單鏈DNA探針A、單鏈DNA探針B和單鏈DNA探針C組成的探針組合物和氣相型、采用金電極的石英晶體微天平；所述單鏈DNA探針A包括一個功能區(qū)段，功能區(qū)段A ；所述功能區(qū)段A的長度占單鏈DNA探針A長度的60 %以上；所述功能區(qū)段A的長度為6-12bp (如8_10bp，如9bp)；所述功能區(qū)段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述單鏈DNA探針B包括兩個功能區(qū)段，功能區(qū)段Bl和功能區(qū)段B2 ；所述功能區(qū)段Bl的長度和所述功能區(qū)段B2的長度之和占單鏈DNA探針B長度的60%以上；所述功能區(qū)Bl中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述功能區(qū)段A與所述功能區(qū)段Bl遵循堿基互補配對原則甲；所述堿基互補配對原則甲中，核苷酸T與核苷酸T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對；所述單鏈DNA探針C包括一個功能區(qū)段，功能區(qū)段C ；所述功能區(qū)段C的長度占單鏈DNA探針C長度的60 %以上；所述單鏈DNA探針C的長度為9_20bp (如9_16bp，如 ll-Mbp，如l!3bp)；所述功能區(qū)段C與所述功能區(qū)段B2遵循堿基互補配對原則乙；所述堿基互補配對原則乙中，核苷酸A與核苷酸T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對。所述納米金顆粒的粒徑優(yōu)選為12-65nm。所述單鏈DNA探針A的核苷酸序列可如序列表的序列1所示，所述單鏈DNA探針B 的核苷酸序列可如序列表的序列2所示，所述單鏈DNA探針C的核苷酸序列可如序列表的序列3所示。 所述單鏈DNA探針A的核苷酸序列可如序列表的序列4所示，所述單鏈DNA探針B 的核苷酸序列可如序列表的序列5所示，所述單鏈DNA探針C的核苷酸序列可如序列表的序列6所示。 本發(fā)明提供的方法的原理(參見圖1) :QCM石英片的金電極修飾單鏈DNA探針A， 單鏈DNA探針A和單鏈DNA探針B之間含有T-T錯配，二者不能雜交形成雙鏈DNA ；當(dāng)待測樣品中沒有汞離子時，納米金顆粒不會吸附到QCM石英片表面，故沒有明顯的響應(yīng)信號；當(dāng)待測樣品中含有汞離子時，由于汞離子會引起T-T配對(T-Hg2+-T)，單鏈DNA探針A與單鏈 DNA探針B雜交形成雙鏈DNA，引起很小的信號響應(yīng)，此時加入單鏈DNA探針C修飾的納米金顆粒時，通過單鏈DNA探針B與單鏈DNA探針C的雜交，納米金顆粒最終固定到QCM石英片表面，利用金顆粒的信號放大作用，引起明顯的信號響應(yīng)，從而特異性的檢測汞離子。本發(fā)明由于采用三段寡核苷酸探針，故稱為夾心法，夾心法相對于兩段寡核苷酸探針檢測的方法，具有條件調(diào)控容易，檢測響應(yīng)靈敏，立體位阻小，檢測限低等特點。本發(fā)明中，借助DNA 寡核苷酸作為探針，利用三段寡核苷酸序列的夾心法原理將納米金顆粒吸附在石英晶體微天平OiCM)的QCM石英片上，利用納米金顆粒的放大作用擴大汞離子在QCM石英片上的響應(yīng)信號，從而實現(xiàn)高靈敏高選擇性的檢測汞離子。借助金納米顆粒的信號放大作用，本檢測方法能獲得InM的汞離子檢測敏感度，符合美國環(huán)保署的飲用水檢測要求，同時也符合中國國家飲水標(biāo)準(zhǔn)中對飲用水中汞離子檢測的要求，其他金屬離子(Ni2+，Mg2+，Co2+，Cr3+，Pb2+, Cd2+，Mn2+，Ba2+)對汞離子的檢測沒有顯著的干擾。本發(fā)明提供的方法可用于檢測飲用水中汞離子的濃度，需要的檢測樣品量非常少(1微升)，操作簡單，儀器便攜，成本較低，適合推


圖1為本發(fā)明提供的方法檢測汞離子的流程示意圖。圖2為實施例1中金顆粒溶膠的掃描電鏡照片。圖3為實施例1中QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果(不同探針probe-Ι濃度)。圖4為實施例2中QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果(不同汞離子濃度)。圖5為實施例2中完成檢測的QCM石英片的掃描電鏡照片(汞離子存在下金顆粒在QCM金片石英片表面的吸附)。圖6為實施例3中金顆粒溶膠的掃描電鏡照片。圖7為實施例3中QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果(不同汞離子濃度)。圖8為實施例4中QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果(不同金屬離子)。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。石英晶體微天平購自Chenhua CO.，LTD, Sianghai，為氣相型，采用金電極，AT切割， 直徑 1. 2cm，厚度為 0. 5mm。QCM 測量儀為 Topward High Frequency Counter 1220 型，購自 Topward Electric Instrument. Co.，LTD, Taiwan0 本發(fā)明中的 PBS 緩沖液均為如下緩沖液ρΗ7· 4，由 Na2HP04、NaH2PO4, NaClO4 和水組成，Na2HPO4 的濃度為 10mM，NaH2PO4 的濃度為10mM，NaClO4的濃度為0. 1M。實驗中QCM石英片在反應(yīng)過程中均存放于密閉的容器內(nèi)并置于恒溫干燥箱中恒溫。QCM頻率響應(yīng)均為頻率的減小。汞離子母液汞離子母液由溶質(zhì)和溶劑組成；溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下 Hg(NO3)2，濃度0. Olmol/L，通過添加稀硝酸保持pH為1 2。溶液A由探針probe-Ι和PBS緩沖液組成；溶液Al中探針probe-I的濃度為20nM， 溶液A2中探針probe-Ι的濃度為200nM，溶液A3中探針probe-Ι的濃度為2 μ M，溶液Α4 中探針probe-Ι的濃度為20 μ Μ。探針Probe-I、探針 Probe-2 和探針 Probe-3 如下探針Probe-I (序列表的序列 1) :5，-HS-TTCTTTCTT-3，(單鏈 DNA)；探針Probe-2 (序列表的序列 2、:5，-CGACTGGACTTGTTTGTT-3，(單鏈 DNA)；探針Probe-3 (序列表的序列；3) :5，-GTCCAGTCGTTTT-SH-3，(單鏈 DNA)。探針Probe-4、探針 Probe-5 和探針 Probe-6 如下探針ftx)be-4(序列表的序列 4) :5，-HS-TTCTTTCTT-3，(單鏈 DNA)；探針Probe-5 (序列表的序列幻5，-CGTACCGGACTTGTTTGTT-3，(單鏈 DNA)；探針Probe-6 (序列表的序列 6) :5，-GTCCGGTACGTTTT-SH-3，(單鏈 DNA)。實施例1、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度(采用不同濃度的探針probe-1)一、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附1、QCM石英片的預(yù)處理QCM石英片用新配置的Piranha洗液(由70體積份98 % H2SO4水溶液和30體積份H2O2組成)清洗2分鐘，之后用電阻率為18. 2M Q cm—1的純水充分清洗，之后依次用乙醇、丙酮清洗后再用純水洗滌，最后氮氣吹干。
2、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附在預(yù)處理后的QCM石英片表面的金電極上滴加10 μ L溶液A(溶液Al、溶液A2、溶液A3或溶液Α4)，室溫吸附池；用純水洗凈并用氮氣吹干；滴加50 μ L含ImM 6-巰基-1-己醇的乙醇溶液(6-巰基-1-己醇作為去除非特異吸附的保護(hù)劑)，室溫吸附Ih ；依次用乙醇和水沖洗，用氮氣吹干，得到探針probe-Ι修飾的QCM石英片。二、納米金顆粒對探針probe-3的吸附1、金顆粒溶膠的制備(檸檬酸三鈉還原氯金酸法)配制IOOmL 1 % (g/mL)的氯金酸水溶液，加熱回流，攪拌下迅速加入3. 5mL 1% (g/100mL)的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱15min放置冷卻至室溫，得到金顆粒溶膠。金顆粒溶膠的掃描電鏡照片見圖2，可見金顆粒溶膠中金顆粒的粒徑約為12nm。2、納米金顆粒對探針probe-3的吸附取200 μ L步驟1制備的金顆粒溶膠加入50 μ L的溶液C (由探針probe-3和PBS 緩沖液組成，探針probe-3的濃度為20 μ M)，室溫孵育Mh ；然后加入250 μ L PBS緩沖液靜置48h (陳化)，離心并用PBS緩沖液多次洗滌沉淀；最后將洗凈的沉淀(金顆粒)分散到 250 μ L PBS緩沖液，得到探針probe-3修飾的納米金顆粒溶膠。三、樣品中汞離子的檢測1、將5μ L溶液D(由汞離子母液和PBS緩沖液組成，汞離子的濃度為20μΜ)與 5 μ L溶液B (由探針probe-2和PBS緩沖液組成，探針probe-2的濃度為20 μ Μ)混合后滴加到探針probe-Ι修飾的QCM石英片的金電極上，儲存在密閉的樣品盒中并置于37°C下的恒溫箱內(nèi)孵育池，用純水清洗并用氮氣吹干，此時記錄QCM石英片的讀數(shù)a (單位為Hz)。2、完成讀數(shù)后，在步驟1處理后的QCM石英片上的金電極上滴加10 μ L探針 probe-3修飾的納米金顆粒溶膠，儲存在密閉的樣品盒中并置于37°C下的恒溫箱內(nèi)孵育池，用純水清洗并用氮氣吹干，此時記錄QCM石英片的讀數(shù)b(單位為Hz)。3、計算QCM石英片的頻率響應(yīng)；QCM石英片的頻率響應(yīng)(-AF) = (a_b)，單位為 Hz。QCM石英片的頻率響應(yīng)在附圖的縱坐標(biāo)中以頻率降低-AF表示(注明頻率的降低意思是a-b) οQCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果見圖3。探針probe-Ι濃度為20nM時，QCM石英片的頻率響應(yīng)為4Hz ；探針probe-1濃度為200nM時，QCM石英片的頻率響應(yīng)為18Hz ；探針probe-1 濃度為2μ M時，QCM石英片的頻率響應(yīng)為77Hz ；探針probe-Ι濃度為20 μ M時，QCM石英片的頻率響應(yīng)為69Hz。隨著探針probe-1濃度的增加，響應(yīng)信號先增大后減小，2 μ M的探針 probe-Ι響應(yīng)信號最大，這表示探針probe-Ι濃度過高時由于QCM石英片表面探針排列過于緊密，產(chǎn)生了立體位阻效應(yīng)，阻礙了 QCM石英片表面DNA的雜交，從而引起響應(yīng)信號的下降。實施例2、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度的靈敏度(金顆粒的粒徑約為12nm)一、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附1、QCM石英片的預(yù)處理同實施例1的步驟一的1。2、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附在預(yù)處理后的QCM石英片表面的金電極上滴加10 μ L溶液A3 (探針probe-Ι的濃度為2 μ M)，室溫吸附池；用純水洗凈并用氮氣吹干；滴加50 μ L含ImM 6-巰基-1-己醇的乙醇溶液，室溫吸附Ih ；依次用乙醇和水沖洗，用氮氣吹干，得到探針probe-Ι修飾的QCM 石英片。二、納米金顆粒對探針probe-3的吸附1、金顆粒溶膠的制備同實施例1的步驟二的1。2、納米金顆粒對探針probe-3的吸附同實施例1的步驟二的2。三、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度的靈敏度1、將5 μ L溶液D (由汞離子母液和PBS緩沖液組成，設(shè)置不同汞離子濃度)與5 μ L 溶液B (由探針probe-2和PBS緩沖液組成，探針probe-2的濃度為20 μ Μ)混合后滴加到探針probe-Ι修飾的QCM石英片的金電極上，儲存在密閉的樣品盒中并置于37°C下的恒溫箱內(nèi)孵育池，用純水清洗并用氮氣吹干，此時記錄QCM石英片的讀數(shù)a (單位為Hz)。步驟2和3同實施例1的步驟三的2和3。QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果見圖4。隨著汞離子濃度的增加，頻率響應(yīng)信號逐漸增大，最終達(dá)到飽和。當(dāng)汞離子濃度低于20nM時，QCM石英片頻率響應(yīng)信號隨著汞離子濃度的增加逐漸增大，特別是在汞離子濃度為4nM-12nM區(qū)段，QCM石英片頻率響應(yīng)信號與濃度增大呈線性相關(guān)，可以作為檢測汞離子的最佳檢測濃度區(qū)間。當(dāng)汞離子濃度大于12nM時，QCM 石英片頻率響應(yīng)信號的增大逐漸減少，這是由于QCM石英片表面吸附的納米金顆粒量逐漸增多后，由于空間位阻效應(yīng)，它們之間相互干擾從而影響了其在QCM石英片上的吸附。當(dāng)汞離子濃度到達(dá)40nM以上時，QCM石英片基本達(dá)到飽和吸附，QCM石英片頻率響應(yīng)信號不隨汞離子的增大而增加。根據(jù)信號噪聲比為3 1，可以推算出汞離子的檢測限為5nM。實際應(yīng)用時，可用已知汞離子母液的梯度稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將待測溶液或待測溶液的梯度稀釋液代替溶液D進(jìn)行步驟三的實驗，將待測溶液的QCM石英片的頻率響應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，即可得到待測溶液中的汞離子濃度。完成檢測的QCM石英片的掃描電鏡照片見圖5。從圖中可以看出，汞離子引起的納米金顆粒在QCM石英片上的吸附效果很明顯，白色的小圓點就是吸附的納米金顆粒。實施例3、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度(金顆粒的粒徑約為65nm)一、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附1、QCM石英片的預(yù)處理同實施例1的步驟一的1。2、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附同實施例2的步驟一的2。二、納米金顆粒對探針probe-3的吸附配制30mL 1 % (g/100mL)的氯金酸水溶液，加熱回流，攪拌下迅速加入0. 16mL 1% (g/100mL)的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱15min放置冷卻至室溫，得到金顆粒溶膠。金顆粒溶膠的掃描電鏡照片見圖6，可見金顆粒溶膠中金顆粒的粒徑約為65nm。2、納米金顆粒對探針probe-3的吸附同實施例1的步驟二的2。三、樣品中汞離子的檢測
同實施例2的步驟三。QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果見圖7?？梢钥吹?，65nm金顆粒同樣可以用于檢測汞離子，而且檢測中對低濃度下的信號放大效果明顯好于12nm的金顆粒。當(dāng)汞離子濃度低于 20nM時，QCM石英片頻率響應(yīng)信號隨著汞離子濃度的增加逐漸增大，特別是在汞離子濃度為InM-IOhM區(qū)段，QCM石英片頻率響應(yīng)信號與濃度增大呈線性相關(guān)，可以作為檢測汞離子的最佳檢測濃度區(qū)間。根據(jù)信號噪聲比為3 1，可以推算出汞離子的檢測限為InM。實施例4、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度的特異性一、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附1、QCM石英片的預(yù)處理同實施例1的步驟一的1。2、QCM石英片對探針probe-Ι的吸附同實施例2的步驟一的2。二、納米金顆粒對探針probe-3的吸附1、金顆粒溶膠的制備同實施例1的步驟二的1。2、納米金顆粒對探針probe-3的吸附同實施例1的步驟二的2。三、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度的特異性溶液El由硝酸汞和PBS緩沖液組成，汞離子(Hg2+)的濃度為20nM;溶液E2由 NiCl2和PBS緩沖液組成，鎳離子(Ni2+)的濃度為20 μ M ；溶液Ε3由Mg (NO3) 2和PBS緩沖液組成，鎂離子(Mg2+)的濃度為20 μ M ；溶液Ε4由CrCl3和PBS緩沖液組成，鉻離子(Cr3+)的濃度為20 μ M ；溶液Ε5由1 (NO3) 2和PBS緩沖液組成，鉛離子0 2+)的濃度為20 μ M ；溶液 Ε6由Cd(NO3)2和PBS緩沖液組成，鎘離子(Cd2+)的濃度為20 μ M ；溶液Ε7由MnCl2和PBS 緩沖液組成，錳離子(Mn2+)的濃度為20 μ M ；溶液Ε8由Ba (NO3) 2和PBS緩沖液組成，鋇離子 (Ba2+)的濃度為20 μ M ；以PBS緩沖液作為空白對照。1、將5 μ L溶液E (溶液El、溶液Ε2、溶液Ε3、溶液Ε4、溶液Ε5、溶液Ε6、溶液Ε7或溶液Ε8)與5 μ L溶液B (由探針probe-2和PBS緩沖液組成，探針probe-2的濃度為20 μ Μ) 混合后滴加到探針probe-Ι修飾的QCM石英片的金電極上，儲存在密閉的樣品盒中并置于 37°C下的恒溫箱內(nèi)孵育2h，用純水清洗并用氮氣吹干，此時記錄QCM石英片的讀數(shù)a (單位為 Hz)。步驟2和3同實施例1的步驟三的2和3。QCM石英片的頻率響應(yīng)結(jié)果見圖8。濃度為汞離子濃度1000倍的其它金屬離子引起的頻率響應(yīng)信號并不明顯，與空白對照差不多，和汞離子的頻率響應(yīng)信號相差很遠(yuǎn)。這是由于空白實驗條件下，或者是加入其它金屬離子條件下，由于探針probe-Ι和探針probe-2 不能發(fā)生雜交配對，因此納米金顆粒最終無法固定在QCM石英片表面，故不能導(dǎo)致明顯的質(zhì)量響應(yīng)信號。實施例5、應(yīng)用本發(fā)明的方法檢測汞離子濃度(不同夾心探針)一、QCM石英片對探針probe-4的吸附1、QCM石英片的預(yù)處理
同實施例1的步驟一的1。2、QCM石英片對探針probe-4的吸附在預(yù)處理后的QCM石英片表面的金電極上滴加10 μ L探針probe-4溶液(由探針 probe-4和PBS緩沖液組成，探針probe-4的濃度為2 μ M)，室溫吸附池；用純水洗凈并用氮氣吹干；滴加50 μ L含ImM 6-巰基-1-己醇的乙醇溶液，室溫吸附Ih ；依次用乙醇和水沖洗，用氮氣吹干，得到探針probe-4修飾的QCM石英片。二、納米金顆粒對探針probe-6的吸附1、金顆粒溶膠的制備同實施例1的步驟二的1。2、納米金顆粒對探針probe-6的吸附取200 μ L金顆粒溶膠加入50 μ L的探針probe-6溶液(由探針probe-6和PBS 緩沖液組成，探針probe-6的濃度為20 μ M)，室溫孵育Mh ；然后加入250 μ L PBS緩沖液靜置48h (陳化)，離心并用PBS緩沖液多次洗滌沉淀；最后將洗凈的沉淀(金顆粒)分散到 250 μ L PBS緩沖液，得到探針probe-6修飾的納米金顆粒溶膠。三、樣品中汞離子的檢測1、將5yL汞離子溶液(由汞離子母液和PBS緩沖液組成，汞離子的濃度為IOnM) 與5 μ L探針probe-5溶液(由探針probe-5和PBS緩沖液組成，探針probe-5的濃度為 20 μ Μ)混合后滴加到探針probe-4修飾的QCM石英片的金電極上，儲存在密閉的樣品盒中并置于37°C下的恒溫箱內(nèi)孵育池，用純水清洗并用氮氣吹干，此時記錄QCM石英片的讀數(shù) a (單位為Hz)。2、完成讀數(shù)后，在步驟1處理后的QCM石英片上的金電極上滴加10 μ L探針 probe-6修飾的納米金顆粒溶膠，儲存在密閉的樣品盒中并置于37°C下的恒溫箱內(nèi)孵育池，用純水清洗并用氮氣吹干，此時記錄QCM石英片的讀數(shù)b (單位為Hz)。3、計算QCM石英片的頻率響應(yīng)；QCM石英片的頻率響應(yīng)(-AF) = (a_b)，單位為 Hz。QCM石英片的頻率響應(yīng)為18Hz，大于三倍的噪聲比，說明變換探針中的能自然雜交的那段堿基序列后，仍然能夠檢測溶液中的汞離子。
權(quán)利要求
1.一種檢測水樣中汞離子濃度的方法，包括如下步驟(1)將待測水樣與溶液B混合后與交聯(lián)于QCM石英片的金電極上的單鏈DNA探針A進(jìn)行雜交，記錄QCM石英片的讀數(shù)a ；所述溶液B為含有單鏈DNA探針B的溶液；所述QCM石英片來自于氣相型、采用金電極的石英晶體微天平；(2)將步驟(1)雜交得到的QCM石英片與交聯(lián)于納米金顆粒上的單鏈DNA探針C進(jìn)行雜交，記錄QCM石英片的讀數(shù)b ；(3)計算QCM石英片的頻率響應(yīng)；QCM石英片的頻率響應(yīng)=(a-b)，單位為Hz；(4)根據(jù)QCM石英片的頻率響應(yīng)得出待測溶液中的汞離子濃度；所述單鏈DNA探針A包括一個功能區(qū)段，即功能區(qū)段A ；所述功能區(qū)段A的長度占單鏈 DNA探針A長度的60%以上；所述功能區(qū)段A的長度為6-12bp ；所述功能區(qū)段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述單鏈DNA探針B包括兩個功能區(qū)段，即功能區(qū)段Bl和功能區(qū)段B2 ；所述功能區(qū)段 Bl的長度和所述功能區(qū)段B2的長度之和占單鏈DNA探針B長度的60%以上；所述功能區(qū) Bl中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述功能區(qū)段A與所述功能區(qū)段 Bl遵循堿基互補配對原則甲；所述堿基互補配對原則甲中，核苷酸T與核苷酸T互補配對， 核苷酸G與核苷酸C互補配對；所述單鏈DNA探針C包括一個功能區(qū)段，即功能區(qū)段C ；所述功能區(qū)段C的長度占單鏈 DNA探針C長度的60%以上；所述單鏈DNA探針C的長度為9_20bp ；所述功能區(qū)段C與所述功能區(qū)段B2遵循堿基互補配對原則乙；所述堿基互補配對原則乙中，核苷酸A與核苷酸 T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述單鏈DNA探針A的核苷酸序列如序列表的序列1所示，所述單鏈DNA探針B的核苷酸序列如序列表的序列2所示，所述單鏈DNA 探針C的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述單鏈DNA探針A的核苷酸序列如序列表的序列4所示，所述單鏈DNA探針B的核苷酸序列如序列表的序列5所示，所述單鏈DNA 探針C的核苷酸序列如序列表的序列6所示。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述單鏈DNA探針A通過末端的巰基交聯(lián)于所述QCM石英片的金電極上；所述單鏈DNA探針C通過末端的巰基交聯(lián)于所述納米金顆粒上；所述納米金顆粒的粒徑為12-65nm。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述單鏈DNA探針A通過如下方法交聯(lián)于所述QCM石英片的金電極在所述QCM石英片表面的金電極上滴加10 μ L溶液Α，吸附池； 清洗干燥后加50 μ L ImM 6-巰基-1-己醇的乙醇溶液，吸附Ih ；清洗干燥后得到交聯(lián)有所述單鏈DNA探針A的QCM石英片；所述溶液A為含有單鏈DNA探針A的溶液。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述單鏈DNA探針C通過如下方法交聯(lián)于所述納米金顆粒上取200 μ L所述納米金顆粒的溶膠加入50 μ L溶液C，孵育 24h ；然后加入250 μ L PBS緩沖液靜置48h，離心并洗滌沉淀；最后沉淀分散到250 μ L PBS 緩沖液，得到交聯(lián)有單鏈DNA探針C的納米金顆粒；所述溶液C為含有所述單鏈DNA探針C 的溶液；所述PBS緩沖液優(yōu)選為如下緩沖液ρΗ7. 4，由Na2HPCV NaH2PO4, NaClO4和水組成， Na2HPO4的濃度為10mM，NaH2PO4的濃度為10mM，NaClO4的濃度為0. 1M。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述溶液A由所述單鏈DNA探針A和PBS緩沖液組成，所述單鏈DNA探針A的濃度優(yōu)選為20ηΜ-20 μ M ；所述溶液B由所述單鏈DNA探針B和PBS緩沖液組成，所述單鏈DNA探針B的濃度優(yōu)選為20 μ M ；所述溶液C由所述單鏈 DNA探針C和PBS緩沖液組成，所述單鏈DNA探針C的濃度優(yōu)選為20 μ Μ。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述溶液A和/或所述溶液B和/或所述溶液C中，所述PBS緩沖液為如下緩沖液ρΗ7. 4，由Na2HP04、NaH2P04、NaC104和水組成，Na2HPO4 的濃度為10mM，NaH2PO4的濃度為10mM，NaClO4的濃度為0. 1M。
9.如權(quán)利要求1至8中所述的方法，其特征在于所述待測溶液中汞離子的濃度為1ηΜ-20μΜ;步驟(1)中，所述雜交的條件為37°C2h;步驟⑵中，所述雜交的條件為 37 0C 2h。
10.一種檢測水中汞離子濃度的試劑盒，包括如下組分納米金顆粒，由單鏈DNA探針 A、單鏈DNA探針B和單鏈DNA探針C組成的探針組合物和氣相型、采用金電極的石英晶體微天平；所述單鏈DNA探針A包括一個功能區(qū)段，功能區(qū)段A ；所述功能區(qū)段A的長度占單鏈DNA 探針A長度的60%以上；所述功能區(qū)段A的長度為6-12bp ；所述功能區(qū)段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述單鏈DNA探針B包括兩個功能區(qū)段，功能區(qū)段Bl和功能區(qū)段B2 ；所述功能區(qū)段Bl 的長度和所述功能區(qū)段B2的長度之和占單鏈DNA探針B長度的60%以上；所述功能區(qū)Bl 中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸總數(shù)的75%上；所述功能區(qū)段A與所述功能區(qū)段Bl 遵循堿基互補配對原則甲；所述堿基互補配對原則甲中，核苷酸T與核苷酸T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對；所述單鏈DNA探針C包括一個功能區(qū)段，功能區(qū)段C;所述功能區(qū)段C的長度占單鏈DNA 探針C長度的60%以上；所述單鏈DNA探針C的長度為9-20bp ；所述功能區(qū)段C與所述功能區(qū)段B2遵循堿基互補配對原則乙；所述堿基互補配對原則乙中，核苷酸A與核苷酸T互補配對，核苷酸G與核苷酸C互補配對。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測水樣中汞離子濃度的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)將待測水樣與溶液B混合后與交聯(lián)于QCM石英片的金電極上的單鏈DNA探針A雜交，記錄QCM石英片的讀數(shù)a；溶液B為含有單鏈DNA探針B的溶液；QCM石英片來自于氣相型、采用金電極的石英晶體微天平；(2)將步驟(1)雜交得到的QCM石英片與交聯(lián)于納米金顆粒上的單鏈DNA探針C雜交，記錄QCM石英片的讀數(shù)b；(3)計算QCM石英片的頻率響應(yīng)；QCM石英片的頻率響應(yīng)＝(a-b)，單位為Hz；(4)根據(jù)QCM石英片的頻率響應(yīng)得出待測溶液中的汞離子濃度；本發(fā)明的方法可用于檢測飲用水中汞離子的濃度，需要的檢測樣品量非常少，操作簡單，儀器便攜，成本較低，適合推廣。
文檔編號G01N5/02GK102183433SQ201110046138
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者張建平, 江龍, 盛仲翰, 韓建華 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所