專利名稱：一種同位素標(biāo)記試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同位素標(biāo)記試劑及其制備方法和應(yīng)用，具體說，是涉及一種異硫氰酸基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑及其制備方法和該同位素標(biāo)記試劑在多肽N端殘基鑒定及蛋白質(zhì)比較分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(TranslationalMedicine)(參見 Clin. Sci.，2007，112，217)是應(yīng)對現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究日趨復(fù)雜化和與基礎(chǔ)臨床嚴(yán)重脫離所提出的一種研究新策略。它是不斷循環(huán)、 不斷上升、不斷深入的一種新的醫(yī)學(xué)研究模式，縮短了從實驗室到病床的距離，是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個新動力。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的重要課題之一就是發(fā)現(xiàn)及監(jiān)測人類疾病的新參數(shù)——生物標(biāo)志物(biomarker)(參見J. Clin. Pharmacol. 2003，43，329)。對于疾病研究，生物標(biāo)志物一般是指可供客觀測定和評價的一個普通生理或病理或治療過程中的某種特征性的生化指標(biāo)，如蛋白質(zhì)和多肽。通過對它的測定可以獲知機(jī)體當(dāng)前所處的生物學(xué)過程中的進(jìn)程。檢查一種疾病特異性的生物標(biāo)志物，對于疾病的鑒定、早期診斷及預(yù)防、治療過程中的監(jiān)控可能起到幫助作用。尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標(biāo)志物已經(jīng)成為目前研究的一個重要熱點。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)便是發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的重要途徑。蛋白質(zhì)組研究具有在整體水平上發(fā)掘與尋求潛在疾病標(biāo)志物的能力，蛋白質(zhì)組技術(shù)完善了以基因組學(xué)為基礎(chǔ)的方法，集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，其主要研究目標(biāo)在于對基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的測定，鑒定疾病、藥物對生命過程的影響以及解釋基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。近年來，利用蛋白質(zhì)組技術(shù)檢測與疾病相關(guān)標(biāo)志物的研究在國內(nèi)外爭相報道，為疾病的臨床診斷開辟了新的途徑。20世紀(jì)80年代末，電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)兩種軟電離技術(shù)的出現(xiàn)，極大的推動了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)，高效率的鑒定目標(biāo)蛋白的酶解肽段，進(jìn)而推測蛋白質(zhì)種類的“bottom up”模式被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)中生物標(biāo)志物的定性研究中。但是一些情況，如非正常的碎片離子、不準(zhǔn)確的質(zhì)量、不可靠地數(shù)據(jù)庫搜索方式，往往會導(dǎo)致錯誤肽段序列的產(chǎn)生，通過鑒定多肽N端殘基，可以很好的排除假陽性以及不確定的序列，進(jìn)而提升測序準(zhǔn)確性，進(jìn)而提高所鑒定的靶蛋白(生物標(biāo)志物biomarker) 的可靠性。目前具體主要對肽段的N端α氨基進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，并結(jié)合多級質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)裂解(collision induced dissociation, CID)專一性的誘導(dǎo)產(chǎn)生N端標(biāo)記產(chǎn)物離子，如 ^b1離子。對于 離子而言，Hsu等率先采用N端肽的雙甲基化的標(biāo)記方法，研究了衍生肽段在二級質(zhì)譜中的Ei1離子信號(參見J. ftOteome Res.，2005，4，101)。而另一種廣泛應(yīng)用的是異硫氰酸苯酯(PITC)的標(biāo)記方法(參見J. Mass Spectrom. 1997，32，225)，該試劑通過在串聯(lián)質(zhì)譜中誘導(dǎo)肽段發(fā)生氣相埃德曼(Edman)裂解，從而生成Id1離子，在N端氨基酸測序和MRM定量中都有較好的應(yīng)用。但是，以往的手段仍存在一些缺陷，如標(biāo)記后產(chǎn)物質(zhì)譜信號下降，標(biāo)記效率低下，某些肽段因為不能產(chǎn)生明確的N端離子，而得出錯誤的結(jié)果。此外， N端同分異構(gòu)殘基(亮氨酸、異亮氨酸)也不能夠很方便的鑒定。針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的之一是提供一種可以加快標(biāo)記反應(yīng)速率、提高標(biāo)記肽段的信號、有利于增強(qiáng)鑒定肽段的準(zhǔn)確性和可信性的同位素標(biāo)記試劑；本發(fā)明的目的之二是提供所述同位素標(biāo)記試劑的一種制備方法；本發(fā)明的目的之三是提供所述同位素標(biāo)記試劑在多肽N端殘基鑒定及蛋白質(zhì)比較分析中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的同位素標(biāo)記試劑，為異硫氰酸基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑，其化學(xué)名為[dQ]/[d6]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-異硫氰酸酯，簡寫為[dQ]/[d6]-
權(quán)利要求
1. 一種同位素標(biāo)記試劑，其特征在于為異硫氰酸基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑，其化學(xué)名為[dj / [d6] _4，6- 二甲氧基嘧啶-2-異硫氰酸酯，簡寫為[dj /
2.—種權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟a)將金屬鈉溶于無水甲醇/氘代甲醇中，配制成甲醇鈉/氘代甲醇鈉溶液；b)將4，6-二氯-2-氨基嘧啶溶于無水甲醇/氘代甲醇中，再逐滴滴加到現(xiàn)配的甲醇鈉 /氘代甲醇鈉溶液中，在15 35°C下攪拌過夜，制得[dQ]/[d6]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗產(chǎn)物；c)將[dj/[d6]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗產(chǎn)物溶于無水二氯甲烷中，再加入硫光氣和碳酸氫鈉，進(jìn)行回流反應(yīng)7 9小時；使反應(yīng)體系冷卻到室溫，傾入水中淬滅反應(yīng)，得到 [dQ]/[d6]-4，6- 二甲氧基嘧啶-2-異硫氰酸酯粗產(chǎn)品；d)進(jìn)行柱層析，得到純化的[cU/[d6]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-異硫氰酸酯，即為本發(fā)明所述的同位素標(biāo)記試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同位素標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于甲醇鈉/氘代甲醇鈉溶液的濃度為0. 1 1. Omol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同位素標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于甲醇鈉/氘代甲醇鈉與4，6-二氯-2-氨基嘧啶的摩爾比為O 4) 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同位素標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于硫光氣與4，6_二氯-2-氨基嘧啶的摩爾比為(1.2 2.0) 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同位素標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于碳酸氫鈉與4， 6-二氯-2-氨基嘧啶的摩爾比為(3 5) 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同位素標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于柱層析的洗脫液是體積比為16的乙酸乙酯與正己烷的混合溶劑。
8.—種權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記試劑在多肽N端殘基的鑒定分析及蛋白質(zhì)的定量分析中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的同位素標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于是先將目標(biāo)分析物分別與輕質(zhì)的和重質(zhì)的標(biāo)記試劑反應(yīng)，再進(jìn)行除雜后處理，然后用氮氣吹干純化后的標(biāo)記分析物，用體積比為1 1的乙腈/水溶液溶解標(biāo)記分析物，最后進(jìn)行電噴霧-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-IT-TOF)分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的同位素標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于所述的目標(biāo)分析物為 N端α氨基無修飾多肽或蛋白質(zhì)經(jīng)過變性、酶解而得到的混合肽段或不同生理狀態(tài)下的生物體蛋白質(zhì)提取物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的同位素標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于，蛋白質(zhì)經(jīng)過變性、酶其中當(dāng)X = H時，為[dj-DMPITC ；當(dāng)X = D時，為解的操作過程如下將蛋白質(zhì)置于pH = 8. 0 8. 5，含有40 50mmol/L碳酸氫銨的緩沖溶液中，在lmg/ml的濃度下進(jìn)行變性操作75°C熱變性10分鐘；冷卻至室溫后，按照重量比50 1加入胰蛋白酶，在37°C酶解12 16小時。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的同位素標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的目標(biāo)分析物與標(biāo)記試劑的反應(yīng)條件是在體積比為2 2 1的吡啶/乙醇/水的混合溶劑中，于55 60 °C反應(yīng)90 120分鐘。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的同位素標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的除雜后處理是指將目標(biāo)分析物與標(biāo)記試劑的反應(yīng)后溶液用氮氣吹干后，用二氯甲烷萃取除去多余的標(biāo)記試齊LU
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的同位素標(biāo)記試劑的應(yīng)用，其特征在于，所述的電噴霧-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-IT-TOF)分析條件是在正離子的模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，流動相是體積比為(1 1) (7 3)的乙腈-水溶液，檢測器電壓為1.7kV，碰撞氣為氬氣，碰撞能量為10 50%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同位素標(biāo)記試劑，是異硫氰酸基嘧啶類同位素標(biāo)記試劑，其化學(xué)名為[d0]/[d6]-4，6-二甲氧基嘧啶-2-異硫氰酸酯。該試劑的制備是首先將4，6-二氯-2-氨基嘧啶與甲醇鈉/氘代甲醇鈉反應(yīng)，制得[d0]/[d6]-4，6-二甲氧基-2-氨基嘧啶粗產(chǎn)物；再將所得粗產(chǎn)物與硫光氣和碳酸氫鈉進(jìn)行回流反應(yīng)，得到最終粗產(chǎn)品；然后進(jìn)行柱層析，即得本發(fā)明所述的同位素標(biāo)記試劑。本發(fā)明的同位素標(biāo)記試劑可應(yīng)用在多肽N端殘基的鑒定分析及蛋白質(zhì)的定量分析中，可以加快標(biāo)記反應(yīng)速率、提高標(biāo)記肽段的信號、有利于增強(qiáng)鑒定肽段的準(zhǔn)確性和可信性；且標(biāo)記部分的分子量較小，結(jié)構(gòu)相對簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，具有操作簡便等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/00GK102174025SQ20111002079
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者冷嘉鵬, 張立, 張菁, 王昊陽, 郭寅龍 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所