專利名稱：檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法顯色劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法顯色劑及其在檢測三聚氰胺殘留量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)是一種三嗪類含氮雜環(huán)化合物，簡稱三胺，又稱作蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺等，是一種白色粉末，可溶解于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶、乙醇等有機溶劑及水，不溶于乙醚、苯和四氯化碳等。三聚氰胺是一種用途廣泛的有機化工原料和重要中間體，但并非是人或動物的食品中允許使用的添加劑成分。近年來，在包括乳制品在內(nèi)的多種食品及畜禽飼料等人和/或動物的食用品中，不斷出現(xiàn)了以添加三聚氰胺冒充蛋白質(zhì)的事件，危害了人和/或動物的身體健康，引發(fā)了食品安全性的社會公共問題。為防止食品中存在的三聚氰胺，國家標準《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》 (GB/T 22388-2008)中提出了采用高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MQ和氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(GC-MS/MQ等方法，檢查原料乳與乳制品中的三聚氰胺。這些方法專屬性強，靈敏度高，但所用儀器設(shè)備昂貴，對實驗人員的專業(yè)技術(shù)要求高，不適合對大量樣品的篩查，難以在基層檢測機構(gòu)中推廣使用。中國專利公開號CN101458M0A中提出了一種薄層色譜法(TLC)檢測三聚氰胺殘留量的方法，以正丁醇-乙酸乙酯-水為硅膠薄層板的展開劑，以二苯卡巴腙和氯化汞的乙醇溶液為顯色劑，檢測食品中的三聚氰胺殘留量。但該方法未提供其檢測限。Melanie Broszat等以mister，s blue和淀粉碘試劑為顯色劑檢查牛奶中的三聚氰胺(A new method for quantification of melamine in milk by absorption diode-array thin-layer chromatography. Journal of Planar Chromatography, 2008, 21 (6) :469), ^ ^ illj PS 30mg · L—1，靈敏度不夠高，不能滿足食品中微量三聚氰胺的檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明首先提供一種用于檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法的顯色劑，本發(fā)明進一步還提出了以該顯色劑為基礎(chǔ)的檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜方法， 以及該薄層色譜方法在檢測人或動物食品/飼料中三聚氰胺含量中的應(yīng)用。本發(fā)明所說的檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法顯色劑，為分別含有重量比例為 0. 10%的對二甲氨基苯甲醛(PDAB)JPO. 2%無機酸的乙醇溶液。其中所說的無機酸為常用的濃鹽酸(36. 5w% )或濃硫酸(98w% )，也可以使用以該濃鹽酸或濃度硫酸作為所說顯色劑乙醇溶液中無機酸含量比例計算基準的其它濃度的鹽酸或硫酸。上述顯色劑的優(yōu)選形式是顯色劑中的對二甲氨基苯甲醛的重量含量為0. 3% ；更好的是對二甲氨基苯甲醛的重量含量為 3%。在此基礎(chǔ)上，進一步的優(yōu)選是所說顯色劑中的無機酸采用重量含量為0.2% 0. 5%的鹽酸，更好的是采用重量含量為0. 3%的鹽酸。
以采用上述顯色劑的薄層色譜法進行三聚氰胺殘留量的檢測時，可先以沸點 ^ 100°c的三聚氰胺有機良溶劑充分溶解的含有三聚氰胺的被測樣品試液，在硅膠薄層色譜板上點樣，經(jīng)展開劑展開，然后揮除展開劑，再以上述的顯色劑顯色后，即可在紫外光或自然光下檢視薄層色譜板上的顯色斑點，由點樣量計算被測樣品中的三聚氰胺含量是否超過限量。所說的展開劑，可以采用包括上述中國專利公開號CN101458M0A等目前已有報道和/或使用形式的展開劑。所說制備被測樣品試液時的三聚氰胺有機良溶劑，雖然可包括前述的諸多溶劑種類，但在本發(fā)明方法中宜選擇其中既有利于三聚氰胺的溶解，又沸點較低(< 100°c )而容易揮發(fā)的三聚氰胺有機良溶劑，以便試液溶劑在薄層色譜板上點樣后能較快或迅速的揮發(fā)。因此，較好的溶劑選擇可以為乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，或含水重量比分別< 20%的含水乙醇、含水甲醇、含水乙腈或含水丙酮等均可以使用。其中更為優(yōu)選的是毒性最小的乙醇或濃度>80%的含水乙醇。雖然三聚氰胺在水中易溶，但因水份在薄層點樣時不易揮除，在保證溶解的前提下，宜盡量減少溶劑中的含水比例。但如果三聚氰胺的濃度較大，甚至用80% 乙醇等尚不能完全溶解時，也可適當增加溶劑中水的比例，或先以少量熱水將三聚氰胺完全溶解后，再加入乙腈、乙醇、丙酮等有機溶劑。點樣后的薄層色譜板一般可在室溫下飽和并展開。試驗顯示，展開時的溫度變化一般對展開效果并無顯著影響。根據(jù)三聚氰胺的化學性質(zhì)，對經(jīng)展開劑展開后的薄層色譜板，本發(fā)明人分別考察和試驗了包括對二甲氨基苯甲醛(PDAB)試液、碘化鉍鉀試液、稀鐵氰化鉀試液、10%磷鉬酸乙醇溶液、茚三酮試液、三氯化鐵試液等不同顯色劑的顯色效果。結(jié)果顯示，PDAB可以使三聚氰胺斑點在紫外光照射下顯示出明顯的藍色熒光，且靈敏度高，顯色效果理想。一般情況下，顯色劑中對二甲氨基苯甲醛的重量含量在0. 10%范圍內(nèi)都是允許的；更好的含量選擇范圍是1^-3 ^進一步的試驗顯示，酸性的顯色劑對于顯色是有利的。所說的酸性可以選擇加入常用的鹽酸、硫酸等無機酸方式實現(xiàn)，一般的含量比例可為0. 2w%，更好的含量范圍是 0.5w%。最佳范圍是的鹽酸。試驗顯示，使用不同種類酸酸化的顯色劑，薄層色譜板上三聚氰胺斑點可以分別在不同的顯色檢視環(huán)境下顯示出理想的顯色效果。例如，采用鹽酸酸化的顯色劑，在薄層色譜板上的三聚氰胺斑點在紫外光下可以高靈敏地顯示出藍色的熒光斑點(試驗條件下的檢測限為0.5 μ g)；使用硫酸酸化時，則其在紫外光下的顯色靈敏度較低，但在自然光下可顯示出黃色的斑點(試驗條件下的檢測限為 2 μ g)。由于在紫外光下能以高靈敏的方式顯示藍色的熒光，并且在鹽酸濃度為0. 2% 0. 5%范圍內(nèi)的熒光都較強，且強度相當，因此可優(yōu)選以濃度為0. 3%的鹽酸進行酸化，并在紫外光燈下進行顯色觀察。所說的用于觀察檢視三聚氰胺藍色熒光斑點的紫外光，一般可以選擇通常使用的 365nm或254nm波長的紫外光燈。試驗表明，三聚氰胺斑點在365nm下的熒光強度可強于在254nm波長下，故檢測波長可優(yōu)選為365nm的紫外光燈。目前常用的薄層檢測紫外儀通常都已配置有254nm和365nm兩種波長的紫外燈，因此可根據(jù)實際需要選擇在其中的任一波長下進行觀察檢視。進一步的試驗顯示，對上述薄層色譜板上三聚氰胺斑點的顯色，特別宜使經(jīng)展開
5劑展開后的薄層色譜板在50°C 120°C的加熱條件下，充分揮除展開劑(除去使用含氨成分展開劑時殘留的氨水)，以減少和/或避免其產(chǎn)生背景干擾。以所說加熱方式揮除薄層色譜板的展開劑后，立即趁熱用所說的顯色劑潤濕，可有利于提高顯色的靈敏度。例如，經(jīng)展開劑展開后的薄層色譜板，在50°C 120°C條件下加熱IOmin揮盡展開劑后，趁熱立即以上述方式用鹽酸酸性顯色劑潤濕后顯色，均出現(xiàn)藍色熒光斑點，溫度降低，檢測的靈敏度會相應(yīng)降低。例如當溫度降至ire時，檢測限會相應(yīng)降低為20 μ g0用所說的顯色劑對薄層色譜板的潤濕方式，可以選擇但不限于包括常用的浸漬、 噴霧等方式實現(xiàn)。試驗顯示，薄層色譜板用顯色劑的潤濕程度和/均勻程度，在一定程度上會影響顯色顯著性的效果。例如，以采用鹽酸進行酸化的顯色劑為例，采用浸漬方式時，將薄層色譜板在顯色劑中浸漬5 15秒鐘后取出，熱風吹干后置紫外燈光(365nm)下觀察， 三聚氰胺斑點顯色的熒光較強，重復(fù)性好，不會產(chǎn)生背景干擾，檢測限可達0. 5 μ g。浸漬時間過短或過長，均會使檢測靈敏度有所降低。如果使用噴霧方式顯色，建議使用噴霧量較大的噴頭迅速噴灑，并可適當提高顯色劑中PDAB的濃度和/或酸性(例如可使用含3% PDAB 和鹽酸乙醇溶液顯色劑)，噴至薄層板微濕為宜。若顯色劑噴得過多，則顯色劑甚至可能會掩蓋熒光斑點，使薄層板正面無法觀察到斑點，但若使用玻璃載板的薄層色譜板，則從背面仍可觀察到清晰的熒光斑點。進一步，改變揮除顯色劑時的操作溫度，也會在一定程度上影響顯色效果。例如， 同樣以浸漬方式將薄層色譜板在顯色劑中浸漬5 15秒鐘后取出，用熱吹風使顯色劑盡快揮盡后，立即置紫外燈光(365nm)下觀察，三聚氰胺斑點的熒光較強，檢測限可為0. 5 μ g。 如果采用冷風吹干或者是自然晾干方式揮盡顯色劑，熒光強度會有不同程度的減弱。如上述，以薄層色譜法采用本發(fā)明上述顯色劑進行三聚氰胺殘留量的檢測時，在硅膠薄層色譜板上點樣并揮除了溶劑后，可以采用目前已有報道和/或使用的展開劑進行展開。進一步的試驗表明，一種與本發(fā)明上述顯色劑配合并可具有更理想檢測效果的展開劑，是由丙酮-氯仿-氨水以體積比例為丙酮4 10份，氯仿0 2份，氨水0. 1 10份的組成形式。其中，上述展開劑更好組成的體積比例是丙酮4 10份，氯仿0. 5 2份，氨水 0. 1 10份。進一步優(yōu)選的組成比例是丙酮4 9份，氯仿0. 5 2份，氨水0. 5 4份。 最佳組成比例建議可采用為丙酮7份，氯仿0. 5份，氨水2份。試驗顯示，適當改變和調(diào)整展開劑中丙酮、氯仿、氨水的比例，可使展開后薄層色譜板上三聚氰胺顯示斑點的&值(比移值)產(chǎn)生相應(yīng)的變化。例如，增大展開劑中氯仿的比例，可適當減小三聚氰胺斑點的&值；增加展開劑中氨水的比例，則三聚氰胺斑點的&值會有適當增大。結(jié)果表明，一般情況下，使用丙酮-氯仿-氨水的比例為7 0.5 2的展開劑時，三聚氰胺斑點的&值較為合適，且斑點形狀對稱。此外，以吡啶或三乙胺替換張開劑中的氨水的試驗顯示，由于展開劑的極性減小， 三聚氰胺斑點的&值過于小，不利于其分離。本發(fā)明上述的檢測三聚氰胺的薄層色譜法中，所說三聚氰胺被測樣品試液在薄層色譜板上的點樣量一般以2 5 μ g和/或點樣斑點的直徑< 4mm為好。試驗顯示，若點樣量過大，有時會出現(xiàn)斑點拖尾的現(xiàn)象。
可以理解，采用本發(fā)明上述顯色劑的薄層色譜法，可用于檢測人或動物食品中三聚氰胺含量。其檢測方法的基本過程是用沸點< 100°c的三聚氰胺有機良溶劑對所說分散態(tài)的被檢測物充分提取后，即可按上述內(nèi)容，用硅膠薄層色譜板進行檢測，檢視薄層色譜板上的三聚氰胺顯色斑點，并可由點樣量計算被檢測物中的三聚氰胺含量是否超過限量。 此處所說的三聚氰胺有機良溶劑，同樣可以選擇常用的乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，或含水重量比分別<20%的含水乙醇、含水甲醇、含水乙腈或含水丙酮等常用溶劑，其中同樣也以無毒性的乙醇和/或含水乙醇為優(yōu)選。本發(fā)明所說的人或動物食品被檢測物，可以是包括乳制品在內(nèi)的含蛋白質(zhì)成分的液態(tài)和/或黏稠狀食品(或飼料)，也可以是含蛋白質(zhì)成分的固態(tài)食品(或飼料)。無論何種狀態(tài)的食品(或飼料)，其首先均應(yīng)使可能存在的三聚氰胺與其它蛋白質(zhì)成分相分離的預(yù)處理后，才能采用本發(fā)明上述方法進行檢測。對于如牛奶及不同形式、狀態(tài)的奶制品等液態(tài)和/或黏稠狀食品，檢測前可以采用包括國家標準及包括前述文獻的目前已有報道和/或使用的方法，對可能存在的三聚氰胺進行分離、提取的預(yù)處理。如，可采用目前已有報道和/或使用的直接沉淀蛋白的三氯乙酸法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。本發(fā)明的試驗結(jié)果表明，這些分離、提取三聚氰胺的預(yù)處理方法中，三氯乙酸因沸點高，不易揮發(fā)，可造成濃縮時酸度過大而使樣品被破壞；鹽析法在揮干過程中有大量鹽析出來，不利于濃集；有機溶劑沉淀蛋白，凈化效果不好，陰性樣品有干擾，且供試品成分復(fù)雜，可將三聚氰胺包裹，使其無法展開。故僅采用這些直接沉淀蛋白的方法尚難能達到檢查的要求，還需對供試品進行進一步的凈化。例如，可參照目前的國家標準和/或相關(guān)文獻，采用固相萃取法進行凈化。其中，優(yōu)選的方式是采用三氯乙酸和乙酸鉛溶液沉淀除去被檢測物中的蛋白質(zhì)成分，再經(jīng)陽離子交換樹脂固相萃取小柱凈化處理后，用5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液并揮除溶劑后，殘留物用所說的三聚氰胺有機良溶劑完全溶解，作為薄層色譜點樣用的被檢測物樣品試液，進行三聚氰胺的含量檢測。該分離、提取方法在CN101458M0A等文獻中都已有報道，可以參照。對于如餅干、蛋糕及禽畜飼料等含蛋白質(zhì)成分的固態(tài)被檢測物，將被檢測物充分粉碎(可以參照目前對這類食品/飼料質(zhì)量檢測中已有報道和/或使用的方式處理)，再按上述液態(tài)和/或黏稠狀食品的同樣方式提取和凈化處理，制備作為薄層色譜點樣用的被檢測物樣品試液，進行三聚氰胺的含量檢測。本發(fā)明提出的檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法顯色劑和相應(yīng)的三聚氰胺殘留量薄層色譜檢測方法，及其在檢測人或動物食品中三聚氰胺含量的應(yīng)用，簡便易行，操作簡單，特別是采用對二甲氨基苯甲醛(PDAB)作為顯色劑，三聚氰胺斑點清晰，檢測靈敏度高， 三聚氰胺的最低檢出量可以達到0. 5mg · kg—1，能快速篩選出人或動物食品中含有三聚氰胺，特別適用于基層的推廣使用。以下結(jié)合由附圖所示實施例的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1是本發(fā)明顯色劑檢測方法的專屬性試驗薄層色譜圖。圖2是本發(fā)明顯色劑檢測方法的檢測限試驗薄層色譜圖。圖3是本發(fā)明顯色劑檢測方法的回收試驗薄層色譜圖。圖4是本發(fā)明顯色劑檢測方法檢測牛奶中三聚氰胺的薄層色譜圖。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明顯色劑及其檢測方法的專屬性試驗供試品溶液的制備稱取含適量三聚氰胺的牛奶5. 0g(或相當于牛奶5. Og的奶制品)，置具塞錐形瓶中，加入三氯乙酸溶液10mL，邊加邊振搖，再加入2. 2%乙酸鉛溶液 ImL及三氯甲烷4mL，充分振搖2min，轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000r · mirT1離心2min，取上清液，置于原錐形瓶中，再加入三氯乙酸溶液10mL，充分振搖混合2min，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用少量三氯乙酸溶液洗滌錐形瓶，洗液合并至離心管中，以3000r · mirT1離心 2min，取上清液備用。將上清液轉(zhuǎn)移至已活化的陽離子交換固相萃取柱中，依次用6mL水和 6mL甲醇洗滌，抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脫，洗脫過程流速不超過ImL IirT1t5收集洗脫液于IOmL梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50°C下?lián)]干，殘留物用少量80%乙醇溶解并稀釋至0. 5mL，搖勻，作為供試品溶液。對照品溶液的制備取三聚氰胺對照品適量，加80%乙醇制成每ImL中含0. 5mg 的溶液，即得。檢查方法分別吸取試劑空白溶液(由配制供試品溶液所用的試劑配制)50 μ L、 對照品溶液10yL(5yg)及供試品溶液50 μ L，分別點樣于同一硅膠G薄層板上(斑點直徑彡4mm)。以丙酮-氯仿-氨水(7 0. 5 2，V/V/V)為展開劑，飽和5min，展開，取出， 晾干，在105°C加熱lOmin，取出，趁熱浸漬于1 %對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含鹽酸 0.3%)中5至15秒，取出，立即用熱風吹干，置紫外燈光(365nm)下檢視。結(jié)果如圖1所示。圖1中第1號點為空白溶液，第2號為對照品溶液，第3號為供試品溶液。由圖1可以看出，空白溶液的色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上無斑點；供試品溶液中的其他組分對三聚氰胺斑點無干擾。表明本法的專屬性良好。實施例2本發(fā)明顯色劑及其檢測方法的檢測限試驗分別吸取上述實施例1同樣的對照品溶液(0. 05mg · ml/1) 5、10 μ L及對照品溶液 (0. 5mg .mr1) 2、4、10 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層板上，按照實施例1 “檢查方法”的操作，以丙酮-氯仿-氨水(7 0.5 2，V/V/V)為展開劑，飽和5min，展開，取出，晾干，在 105°C加熱lOmin，取出，趁熱浸漬于對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含鹽酸0.3% ) 中5至15秒，取出，立即用熱風吹干，置紫外燈光(365nm)下檢視。結(jié)果如圖2所示。圖中第1 5號的點樣量依次為0. 25、0. 5、1.0、2.0和5.0^8。 可以看出，在紫外燈光下，可檢視的點樣量為0. 5μ g的三聚氰胺(第2號點)，表明本法的檢測限為0. 5 μ g，在樣品中的最低檢出量為0. 5mg · kg—1。實施例3本發(fā)明顯色劑及其檢測方法的回收率試驗稱取3份不含三聚氰胺的牛奶5. Og，分別加入不同量的三聚氰胺對照品溶液，使其三聚氰胺含量分別為2、5、10mg · kg—1，編號為供試液①、供試液②、供試液③。按照實施例1 “供試品溶液的制備”的同樣方式制樣，供試液①、供試液②和供試液③中三聚氰胺的濃度分別為0. 02,0. 05,0. IOmg · mL—1。分別吸取對照品溶液(0. 5mg · mL-1) 2、4 μ L及供試液①50、100 μ L，供試液②25、50 μ L，供試液③25 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層板上， 按實施例1 “檢查方法”項同樣操作。結(jié)果如圖3所示，圖中的第1 2號為對照品溶液，點樣量分別為1.0和 2. 0 μ g ；第3 7號均為供試品溶液，依次為①50 μ L (1. 0 μ g)、①100 μ U2. 0 μ g)、 ②25μ L(l. 25μ g)、②50μ U2. 5μ g)和③25μ U2. 5μ g)。由圖3可以看出，供試液 ①100 yL(2.0yg)、供試液②50yL(2. 5μ g)和供試液③25yL(2. 5μ g)檢出的三聚氰胺斑點的熒光強度與對照品2. 0μ g相當，表明本法可檢查出牛奶中微量的三聚氰胺，回收率在80%以上。實施例4對奶制品中三聚氰胺殘留量的檢測試驗稱取含適量三聚氰胺的牛奶5. Og (或相當于牛奶5. Og的奶制品)，按照實施例 1 “供試品溶液的制備”的同樣方式制樣，對照品溶液的制備取三聚氰胺對照品適量，加80%乙醇制成每ImL中含0. 5mg 的溶液，即得。檢查方法吸取對照品溶液4 μ U2 μ g)及供試品溶液100 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層板上(斑點直徑彡4mm)，以丙酮-氯仿-氨水(7 0.5 2，V/V/V)為展開劑， 飽和5min，展開，取出，晾干，在105°C加熱lOmin，取出，趁熱浸漬于對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含鹽酸0.3%)中5至15秒，取出，立即用熱風吹干，置紫外燈光(365nm) 下檢視。結(jié)果見圖4。圖中所示的斑點即為三聚氰胺的藍色熒光斑點。圖中第1、2號點為對照品溶液，點樣量分別為1 μ g和2. 5μ g ；第3、4、5號點均為供試品溶液，供試品溶液的色譜中在與對照品溶液中三聚氰胺相同的位置上顯示藍色熒光斑點，斑點的顏色和面積均未超過對照品溶液2中三聚氰胺的斑點，說明其中三聚氰胺的含量均未超過2. 5mg -kg"1的限度。實施例5對奶制品中三聚氰胺殘留量的檢測試驗供試品溶液和對照品溶液的制備方法同實施例1。檢查方法吸取對照品溶液4 μ U2 μ g)及供試品溶液100 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層預(yù)制板上(斑點直徑彡4mm)，以丙酮-氯仿-氨水(7 0.5 2，V/V/V)為展開劑，飽和5min，展開，取出，晾干，在105°C加熱lOmin，取出，趁熱迅速噴灑3%對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含鹽酸)，噴至薄層板微濕，立即用熱風吹干，置紫外燈光(365nm) 下檢視。通過比較供試品色譜與對照品色譜中三聚氰胺斑點的大小，可判斷樣品中三聚氰胺是否超過限量。試驗結(jié)果表明，采用噴霧顯色的方式也能檢查三聚氰胺的殘留量。薄層板被噴至微濕為宜，若顯色劑噴得過多，則顯色劑可能掩蓋熒光斑點，使從薄層板正面無法觀察到三聚氰胺的斑點，若使用以玻璃為載板的薄層板，從背面仍可觀察到清晰的熒光斑點。實施例6對液態(tài)奶中三聚氰胺殘留量的檢測試驗分別稱取三個不同公司來源的各一批次液態(tài)奶5. Og,按照實施例1的方式制備供試品溶液，并進行薄層色譜分析。經(jīng)試驗，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上無斑點，表明其三聚氰胺含量均低于0. 5mg · kg—1，符合要求。實施例7對奶粉中三聚氰胺殘留量的檢測試驗稱取奶粉5. 0g，置具塞錐形瓶中，加入三氯乙酸溶液25mL，邊加邊振搖，再加入2. 2%乙酸鉛溶液3mL及三氯甲烷10mL，充分振搖2min，轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000rpm離心2min，取上清液，置于原錐形瓶中，再加入1 %三氯乙酸溶液25mL，充分振搖混合2min， 將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用少量三氯乙酸溶液洗滌錐形瓶，洗液合并至離心管中，以 3000rpm離心2min，取上清液，轉(zhuǎn)移至已活化的陽離子交換固相萃取柱中，依次用6mL水和 6mL甲醇洗滌，抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脫，洗脫過程流速不超過ImL ^inA收集洗脫液于IOmL梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50°C下?lián)]干，殘留物用少量80%乙醇溶解并稀釋至0. 5mL，搖勻，作為供試品溶液。檢查方法吸取對照品溶液(0. 5mg/ml) 2、4、6 μ L及供試品溶液100 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層預(yù)制板上(斑點直徑彡4mm)，以丙酮-氨水(10 2，V/V)為展開劑， 飽和5min，展開，取出，晾干，在105°C加熱lOmin，取出，趁熱迅速噴灑3 %對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含鹽酸1%)，噴至薄層板微濕，立即用熱風吹干，置紫外燈光(365nm)下檢視。通過比較供試品色譜與對照品色譜中三聚氰胺斑點的大小，判斷樣品中三聚氰胺是否超過限量。實施例8對奶糖中三聚氰胺殘留量的檢測試驗稱取奶糖5. Og于研缽中，加入適量海砂研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入具塞錐形瓶中，加入三氯乙酸溶液80mL，邊加邊振搖，再加入2. 2%乙酸鉛溶液5mL及三氯甲烷25mL，充分振搖 2min,轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000rpm離心2min，取上清液，置于原錐形瓶中，再加入1 %三氯乙酸溶液80mL，充分振搖混合2min，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用少量三氯乙酸溶液洗滌錐形瓶，洗液合并至離心管中，以3000 rpm離心aiiin，取上清液，加于已活化的陽離子交換固相萃取柱中，依次用6mL水和6mL甲醇洗滌，抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脫，洗脫過程流速不超過ImL · mirT1。收集洗脫液于IOmL梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50°C下?lián)]干，殘留物用少量80%乙醇溶解并稀釋至0. 5mL，搖勻，作為供試品溶液。檢查方法吸取對照品溶液(0. 5mg/ml) 5、10 μ L及供試品溶液200 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層預(yù)制板上，以丙酮-氯仿-氨水(5 0.5 1，V/V/V)為展開劑，飽和5min，展開，取出，晾干，在105°C加熱lOmin，取出，趁熱迅速噴灑3%對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含硫酸1%)，噴至薄層板微濕，立即用熱風吹干，置自然光下檢視。通過比較供試品色譜與對照品色譜中三聚氰胺黃色斑點的大小，判斷樣品中三聚氰胺是否超過限量。實施例9對飼料中三聚氰胺殘留量的檢測試驗稱取飼料5. Og，粉碎后置具塞錐形瓶中，加入三氯乙酸溶液50mL，邊加邊振搖，再加入2. 2%乙酸鉛溶液2mL，充分振搖2min，轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000rpm離心2min， 取上清液，置于原錐形瓶中，再加入1 %三氯乙酸溶液50mL，充分振搖混合2min，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，用少量三氯乙酸溶液洗滌錐形瓶，洗液合并至離心管中，以3000rpm離心2min，取上清液加于已活化的陽離子交換固相萃取柱中，依次用6mL水和6mL甲醇洗滌， 抽至近干，用5%氨化甲醇6mL洗脫，洗脫過程流速不超過ImL mirT1。收集洗脫液于IOmL 梨形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50°C下?lián)]干，殘留物用少量80%乙醇溶解并稀釋至0. 5mL，搖勻，作為供試品溶液。 檢查方法吸取對照品溶液(0. 5mg/ml) 5、10 μ L及供試品溶液200 μ L，分別點于同一預(yù)制硅膠G薄層預(yù)制板上，以丙酮-氯仿-氨水(8 1 2, V/V/V)為展開劑，飽和 5min，展開，取出，晾干，在105°C加熱lOmin，取出，趁熱迅速噴灑3%對二甲氨基苯甲醛鹽酸乙醇溶液(含硫酸1%)，噴至薄層板微濕，立即用熱風吹干，置日光下檢視。通過比較供試品色譜與對照品色譜中三聚氰胺黃色斑點的大小，判斷樣品中三聚氰胺是否超過限量。
權(quán)利要求
1.檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法顯色劑，為分別含有重量比例為0. 10%的對二甲氨基苯甲醛和0. 2%無機酸的乙醇溶液，所說的無機酸為鹽酸或硫酸。
2.如權(quán)利要求1所述的顯色劑，其特征是所說顯色劑中的對二甲氨基苯甲醛的重量含量為0. 3%。
3.如權(quán)利要求2所述的顯色劑，其特征是所說顯色劑中的對二甲氨基苯甲醛的重量含量為 3%。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的顯色劑，其特征是所說顯色劑中的無機酸是重量含量為0.2% 0.5%的鹽酸。
5.如權(quán)利要求4所述的顯色劑，其特征是所說顯色劑中的無機酸是重量含量為0.3% 的鹽酸。
6.以權(quán)利要求1至5的顯色劑檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法，其特征是以沸點 ^ 100°c的三聚氰胺有機良溶劑充分溶解的含有三聚氰胺的被測樣品試液，在硅膠薄層色譜板上點樣，經(jīng)展開劑展開后，揮除展開劑，以權(quán)利要求1至5之一的顯色劑顯色后，在紫外光或自然光下檢視薄層色譜板上的顯色斑點，由點樣量計算被測樣品中的三聚氰胺含量是否超過限量。
7.如權(quán)利要求6所述的薄層色譜法，其特征是所說的三聚氰胺有機良溶劑為乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，或含水重量比分別< 20%的含水乙醇、含水甲醇、含水乙腈或含水丙酮。
8.如權(quán)利要求6所述的薄層色譜法，其特征是所說的展開劑體積份數(shù)組成為丙酮 4 10份，氯仿0 2份，氨水0. 1 10份。
9.如權(quán)利要求8所述的薄層色譜法，其特征是所說的展開劑體積份數(shù)組成為丙酮 4 10份，氯仿0. 5 2份，氨水0. 1 10份。
10.如權(quán)利要求9所述的薄層色譜法，其特征是所說的展開劑體積份數(shù)組成為丙酮 4 9份，氯仿0. 5 2份，氨水0. 5 4份。
11.如權(quán)利要求10所述的薄層色譜法，其特征是所說的展開劑體積份數(shù)組成為丙酮7 份，氯仿0.5份，氨水2份。
12.如權(quán)利要求6至11之一所述的薄層色譜法，其特征是經(jīng)所說展開劑展開后的薄層色譜板在50°C 120°C的加熱條件下?lián)]除展開劑。
13.如權(quán)利要求12所述的薄層色譜法，其特征是以所說加熱方式揮除薄層色譜板中的展開劑后，立即趁熱用所說的顯色劑潤濕。
14.如權(quán)利要求6至11之一所述的薄層色譜法，其特征是所說揮除展開劑后的薄層色譜板以浸漬方式用所說的顯色劑潤濕。
15.如權(quán)利要求6至11之一所述的薄層色譜法，其特征是所說揮除展開劑后的薄層色譜板以噴霧方式用所說的顯色劑潤濕。
16.如權(quán)利要求6至11之一所述的薄層色譜法，其特征是所說顯色劑中的無機酸是鹽酸，將熱吹風吹干后的薄層色譜板置紫外光下檢視三聚氰胺的藍色熒光斑點。
17.如權(quán)利要求16所述的薄層色譜法，其特征是所說用熱吹風吹干后的薄層色譜板在 365nm或254nm波長的紫外光下檢視三聚氰胺的藍色熒光斑點。
18.如權(quán)利要求6至11之一所述的薄層色譜法，其特征是所說顯色劑中的無機酸是硫酸，經(jīng)顯色劑顯色后的薄層色譜板在自然光下檢視三聚氰胺的黃色斑點。
19.如權(quán)利要求18所述的薄層色譜法，其特征是所說揮除顯色劑后的薄層色譜板在陽光下檢視三聚氰胺的黃色斑點。
20.薄層色譜法檢測人或動物食品中三聚氰胺含量的方法，其特征是用沸點<100°C 的三聚氰胺有機良溶劑對所說分散態(tài)的被檢測物充分提取后，按權(quán)利要求5至18的方法， 用硅膠薄層色譜板進行檢測，檢視薄層色譜板上的三聚氰胺顯色斑點，并由點樣量計算被檢測物中的三聚氰胺含量是否超過限量。所說的三聚氰胺有機良溶劑為乙醇、甲醇、乙腈， 或含水重量比分別< 20%的含水乙醇、含水甲醇或含水乙腈。
21.如權(quán)利要求20的檢測方法，其特征是所說的被檢測物為包括乳制品在內(nèi)的含蛋白質(zhì)成分的液態(tài)和/或黏稠狀食品，用三氯乙酸和乙酸鉛溶液沉淀除去被檢測物中的蛋白質(zhì)成分，再經(jīng)陽離子交換樹脂固相萃取小柱凈化處理后，用5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液并揮除溶劑后，殘留物用所說的三聚氰胺有機良溶劑完全溶解，作為薄層色譜點樣用的被檢測物樣品試液，進行三聚氰胺的含量檢測。
22.如權(quán)利要求20的檢測方法，其特征是所說的被檢測物為含蛋白質(zhì)成分的固態(tài)食品，將被檢測物充分粉碎后，用三氯乙酸和乙酸鉛溶液沉淀除去被檢測物中的蛋白質(zhì)成分， 再經(jīng)陽離子交換樹脂固相萃取小柱凈化處理后，用5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液并揮除溶劑后，殘留物用所說的三聚氰胺有機良溶劑完全溶解，作為薄層色譜點樣用的被檢測物樣品試液，進行三聚氰胺的含量檢測。
全文摘要
檢測三聚氰胺殘留量的薄層色譜法顯色劑及其應(yīng)用。該顯色劑為分別含有重量比例為0.1％～10％的對二甲氨基苯甲醛和0.1％～2％的鹽酸或硫酸等無機酸的乙醇溶液。檢測時，以沸點≤100℃的三聚氰胺有機良溶劑充分溶解的含有三聚氰胺的被測樣品試液，在硅膠薄層色譜板上點樣，以常規(guī)方式經(jīng)展開劑展開后，揮除展開劑，以該顯色劑顯色后，在紫外光或自然光下檢視薄層色譜板上的顯色斑點，由點樣量計算被測樣品中的三聚氰胺含量是否超過限量。該方法的三聚氰胺斑點清晰，檢測靈敏度高，三聚氰胺的最低檢出量可達到0.5mg·kg-1，適用于對包括乳制品在內(nèi)的人和/或動物食品中三聚氰胺含量的檢測。
文檔編號G01N30/90GK102175812SQ20111000904
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月17日
發(fā)明者晁若冰, 王雪彥 申請人:四川大學