專利名稱：借助于受保護(hù)的分析物的控釋來(lái)檢測(cè)測(cè)試元件中酶的分解的制作方法
借助于受保護(hù)的分析物的控釋來(lái)檢測(cè)測(cè)試元件中酶的分解本發(fā)明涉及用于測(cè)定至少一種分析物的診斷元件和包含這樣的診斷元件的分析測(cè)量裝置。本發(fā)明另外涉及一種用于測(cè)定分析物的方法、一種用于校正由分析物產(chǎn)生的信號(hào)的方法和一種用于檢查使用所述診斷元件的分析測(cè)量裝置的檢測(cè)光學(xué)部件的方法。最后，本發(fā)明涉及用于控釋試劑的體系和這樣的體系作為開(kāi)關(guān)元件的用途。診斷元件是臨床上相關(guān)的分析方法的重要組分。在此，分析物(例如代謝物或底物)的測(cè)量，例如借助于所述分析物的特異性酶直接地或間接地測(cè)定所述分析物具有重要意義。在該情況下，借助于酶-輔酶復(fù)合物，將分析物轉(zhuǎn)化并隨后定量。在該過(guò)程中，使待測(cè)分析物與合適的酶、輔酶和任選的介質(zhì)接觸，其中所述輔酶通過(guò)酶促反應(yīng)得到物理化學(xué)變化，例如被氧化或還原。如果另外使用介質(zhì)，那么它通常將在分析物的轉(zhuǎn)化過(guò)程中釋放出的電子從還原型輔酶轉(zhuǎn)移到光學(xué)指示劑或電極的傳導(dǎo)組分上，這樣使得所述過(guò)程例如可以通過(guò)光度測(cè)量方法或電化學(xué)測(cè)量方法來(lái)檢測(cè)。校準(zhǔn)提供了測(cè)量值和待測(cè)分析物的濃度之間的直接關(guān)系。
從現(xiàn)有技術(shù)已知的診斷元件的特點(diǎn)在于，時(shí)間有限的穩(wěn)定性和為獲得該穩(wěn)定性對(duì)環(huán)境的特殊要求，諸如冷卻或干燥貯存。在某些應(yīng)用形式，例如在由末端用戶自己進(jìn)行測(cè)試的情況下，例如在血糖自監(jiān)測(cè)的情況下，因此可能由于錯(cuò)誤的，未被覺(jué)察的測(cè)量體系的不正確貯存而產(chǎn)生用戶難以識(shí)別的錯(cuò)誤結(jié)果，并可能導(dǎo)致各種疾病的錯(cuò)誤治療。所述錯(cuò)誤結(jié)果主要?dú)w因于下述事實(shí)在這樣的診斷元件中使用的酶、輔酶和介質(zhì)通常對(duì)水分和熱反應(yīng)靈敏，并因此被滅活。因而，例如在溫暖潮濕的環(huán)境條件下借助于葡萄糖脫氫酶/NAD體系來(lái)檢測(cè)葡萄糖時(shí)，葡萄糖脫氫酶的活性以及輔酶NAD的含量隨著時(shí)間而下降，其中輔酶的減少通常比葡萄糖脫氫酶活性的喪失明顯進(jìn)展更快。一種已知的用于提高診斷元件的穩(wěn)定性的措施是，使用穩(wěn)定的酶，例如使用得自嗜熱生物的酶。此外，存在這樣的可能性，通過(guò)化學(xué)修飾(例如交聯(lián))或通過(guò)誘變來(lái)穩(wěn)定化酶。此外，也可以加入酶穩(wěn)定劑例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清白蛋白，或者將酶例如通過(guò)光聚合包圍在聚合物網(wǎng)絡(luò)中。另一種用于提高診斷元件的穩(wěn)定性的方法是，使用穩(wěn)定化的輔酶。由于核糖和吡啶單元之間的糖基鍵的不穩(wěn)定性，天然的輔酶例如NAD和NADP或它們的還原形式NADH和NADPH在堿性或酸性條件下是相對(duì)不穩(wěn)定的，而近年來(lái)已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了不同的NAD/NADH和NADP/NADPH的衍生物，它們通過(guò)煙酰胺基團(tuán)或核糖單元的修飾來(lái)顯著提高輔酶的
穩(wěn)定性。最后，診斷元件穩(wěn)定性的提高也可以通過(guò)使用穩(wěn)定的介質(zhì)來(lái)獲得。因而，通過(guò)使用具有盡可能低的氧化還原電位的介質(zhì)來(lái)增加試驗(yàn)的特異性并消除反應(yīng)過(guò)程中的干擾。但是，酶/輔酶復(fù)合物的氧化還原電位會(huì)形成介質(zhì)的氧化還原電位的下限。如果介質(zhì)的電位低于該限度，與介質(zhì)的反應(yīng)會(huì)減慢或甚至中止。但是，在實(shí)踐中在診斷元件中使用的化學(xué)檢測(cè)試劑的組分并非全都具有相同的穩(wěn)定性，而是更確切地說(shuō)為不同速度的分解過(guò)程所決定。因而，例如當(dāng)使用carbaNAD作為輔酶時(shí)，發(fā)生下述效應(yīng)由于碳環(huán)(carbazyklisch)糖單元的存在,甚至在潮濕和升高溫度的條件下，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間輔酶仍保持非常穩(wěn)定，而在診斷元件中使用的天然酶的活性持續(xù)降低。同樣地，例如在使用穩(wěn)定化的酶和天然輔酶組合的情況中，所述酶的活性可以較長(zhǎng)時(shí)間地保持，而輔酶的量由于熱分解或/和水解分解而或多或少地快速減少。為了避免測(cè)定分析物時(shí)的錯(cuò)誤結(jié)果，因此診斷元件必須能夠確定在診斷元件中使用的檢測(cè)試劑的各個(gè)組分在測(cè)量時(shí)是否還以功能形式存在，并因此該檢測(cè)試劑是否適用于分析物的定性或/和定量檢測(cè)。在這方面，例如酶活性的測(cè)定是非常有問(wèn)題的，因?yàn)槊傅臏缁钍紫扔傻鞍讟?gòu)象的變化造成，并因此由于 缺乏構(gòu)造的改變而沒(méi)有形成光學(xué)活性的或電化學(xué)活性的成分。因此，本發(fā)明的目的是，提供一種尤其用于測(cè)定葡萄糖的穩(wěn)定的診斷元件，其中至少部分地消除現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。尤其應(yīng)確保所述診斷元件在檢測(cè)試劑的各個(gè)組分極大地減少或完全缺失功能性能的情況下，避免給出待測(cè)定的分析物的誤以為正確的測(cè)量結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明將通過(guò)用于測(cè)定至少一種分析物的診斷元件實(shí)現(xiàn)該目的，所述診斷元件包括對(duì)分析物特異性的檢測(cè)試劑和確定量的待測(cè)分析物(指示劑分析物)，其中所述指示劑分析物以對(duì)于與檢測(cè)試劑的反應(yīng)來(lái)說(shuō)不可使用的可釋放形式存在。在根據(jù)本發(fā)明的診斷元件中使用的檢測(cè)試劑優(yōu)選為化學(xué)檢測(cè)試劑，且可以包括適用于測(cè)定分析物(例如使用光學(xué)或電化學(xué)方法)的任意組分。這種組分的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且尤其包括酶、輔酶、介質(zhì)、光學(xué)指示劑以及助劑或/和添加劑，但不限于這些。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑包括至少一種酶或/和輔酶，它們彼此獨(dú)立地可以是天然的、半合成的或合成的來(lái)源，且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)診斷元件需要自由地選擇。根據(jù)本發(fā)明，至少一種酶和至少一種輔酶的組合是特別優(yōu)選的，其中所述酶優(yōu)選地具有對(duì)待測(cè)分析物的高特異性，并因此在測(cè)定所述分析物的范圍內(nèi)將錯(cuò)誤結(jié)果減小到最低限度。如果根據(jù)本發(fā)明的診斷元件包括酶，所述酶優(yōu)選是輔酶依賴性的酶。這樣的酶的實(shí)例尤其包括脫氫酶、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶(EC I. I. 3. 4)或膽固醇氧化酶(ECI. I. 3. 6))、氨基轉(zhuǎn)移酶(例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、5’ -核苷酸酶、肌酸激酶和黃遞酶(EC 1.6.99.2)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)依賴性的或煙酰胺-腺嘌呤-二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)依賴性的脫氫酶，其中所述酶尤其選自醇脫氫酶(EC I. I. I. I; EC I. I. I. 2)、L-氨基酸脫氫酶(EC 1.4. I. 5)、葡萄糖脫氫酶(EC I. I. I. 47)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC I. I. I. 49)、甘油脫氫酶(EC I. I. I. 6)、3_羥基丁酸脫氫酶(EC I. I. I. 30)、乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27;
I.I. I. 28)、蘋果酸脫氫酶(EC I. I. I. 37)和山梨醇脫氫酶。所述酶最強(qiáng)烈優(yōu)選地是葡萄糖脫氫酶(EC I. I. I. 47)或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC I. I. I. 49)。如果使用葡萄糖脫氫酶(EC I. I. I. 47)作為酶，則在根據(jù)本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)可以使用例如突變的葡萄糖脫氫酶。在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)使用的術(shù)語(yǔ)“突變體”是指，天然酶的遺傳修飾的變體，所述變體具有與野生型酶相同數(shù)目的氨基酸，但是具有改變的氨基酸序列，即它與野生型酶相差至少一個(gè)氨基酸。所述一個(gè)或多個(gè)突變的引入可以使用在本專業(yè)領(lǐng)域中已知的重組方法位點(diǎn)專一或非位點(diǎn)專一，但是優(yōu)選位點(diǎn)專一地進(jìn)行，其中根據(jù)各自的需要和條件在天然酶的氨基酸序列內(nèi)產(chǎn)生至少一個(gè)氨基酸交換。相對(duì)于野生型酶，所述突變體特別優(yōu)選具有提高的熱或水解穩(wěn)定性。這種突變體的實(shí)例描述在Baik (AppI.Environ. Microbiol. (2005), 71, 3285) > Vasquez-Figueroa (ChemBioChem. (2007),8,2295)中以及在WO 2005/045016 A2中，在此明確引用其公開(kāi)內(nèi)容。突變的葡萄糖脫氫酶可以基本上在它的氨基酸序列中的任意位置處包含相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型葡萄糖脫氫酶改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。突變的葡萄糖脫氫酶優(yōu)選地包括，在野生型葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列的位置96、170和252的至少一個(gè)位置處的突變，其中具有在位置96和位置170處的突變或在位置170和位置252處的突變的突變體是特別優(yōu)選的。已經(jīng)證實(shí)，如果突變的葡萄糖脫氫酶不含有除了這些突變以外的其它突變，則是有利的。在位置96、170和252處的突變基本上可以包括導(dǎo)致穩(wěn)定化(例如，野生型酶的熱或水解穩(wěn)定性的增加)的任意氨基酸置換。在位置96處的突變優(yōu)選地包括甘氨酸對(duì)谷氨酸的氨基酸置換，而對(duì)于位置170，精氨酸或賴氨酸對(duì)谷氨酸的氨基酸置換、尤其是賴氨酸對(duì) 谷氨酸的氨基酸置換是優(yōu)選的。至于在位置252處的突變，則它優(yōu)選包括亮氨酸對(duì)賴氨酸
的氨基酸置換。通過(guò)源自任意生物來(lái)源的野生型葡萄糖脫氫酶的突變，可以得到突變的葡萄糖脫氫酶，其中在本發(fā)明的意義上，術(shù)語(yǔ)“生物來(lái)源”既包括原核生物(例如細(xì)菌)也包括真核生物(例如哺乳動(dòng)物和其它動(dòng)物)。野生型葡萄糖脫氫酶優(yōu)選地源自細(xì)菌，其中特別優(yōu)選為來(lái)自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的葡萄糖脫氫酶,尤其是來(lái)自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，突變的葡萄糖脫氫酶是通過(guò)突變來(lái)自枯草芽孢桿菌的野生型葡萄糖脫氫酶而得到的葡萄糖脫氫酶，所述突變的葡萄糖脫氫酶具有在SEQ IDN0:1中所示的氨基酸序列(GlucDH_E96G_E170K)或在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列(GlucDH_E170K_K252L)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在這一點(diǎn)上所述的診斷元件此外包括輔酶,所述輔酶優(yōu)選地是穩(wěn)定化的輔酶。在本發(fā)明的意義上，穩(wěn)定化的輔酶是相對(duì)于天然輔酶被化學(xué)修飾的輔酶，其在大氣壓下具有比天然輔酶更高的對(duì)濕度、溫度(特別是在0°C -50°C的范圍內(nèi))、酸和堿(特別是在pH 4至pH 10的范圍內(nèi))或/和親核試劑(例如醇類或胺類)的穩(wěn)定性，并因此在相同的環(huán)境條件下可以比天然輔酶更久地發(fā)揮作用。穩(wěn)定化的輔酶優(yōu)選地具有比天然輔酶更高的水解穩(wěn)定性，其中在試驗(yàn)條件下的完全水解穩(wěn)定性是特別優(yōu)選的。與天然輔酶相比，穩(wěn)定化的輔酶可以具有減小的對(duì)酶的結(jié)合常數(shù)，例如減小1/2或更多的結(jié)合常數(shù)。在本發(fā)明的意義上，穩(wěn)定化的輔酶的優(yōu)選實(shí)例是穩(wěn)定化的NAD (P)/NAD (P)H化合物，即天然的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)的化學(xué)衍生物，或式(I)化合物
權(quán)利要求
1.用于測(cè)定至少一種分析物的診斷元件，所述診斷元件包括 Ca)對(duì)分析物特異性的檢測(cè)試劑，和 (b)給定量的待測(cè)分析物(指示劑分析物)，其中所述指示劑分析物以對(duì)于與檢測(cè)試劑的反應(yīng)來(lái)說(shuō)不可使用的可釋放形式存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的診斷元件，其特征在于， 所述檢測(cè)試劑包括酶或/和輔酶，尤其是穩(wěn)定化的輔酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的診斷元件，其特征在于， 所述酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)依賴性的或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)依賴性的脫氫酶，尤其是葡萄糖脫氫酶(EC I. I. 1.47)或葡萄糖_6_磷酸脫氫酶(EC I. I. I. 49)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的診斷元件，其特征在于， 所述穩(wěn)定化的輔酶是穩(wěn)定化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)-化合物或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)-化合物，尤其是carbaNAD或carbaNADP，或式(I)化合物
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述檢測(cè)試劑此外包括介質(zhì)或/和光學(xué)指示劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述診斷元件包括載體層以及含有所述檢測(cè)試劑的檢測(cè)層。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷元件，其特征在于， 所述診斷元件含有在檢測(cè)層中或在單獨(dú)的貯存層中的指示劑分析物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷元件，其特征在于， 在所述貯存層和所述檢測(cè)層之間布置有可溶解的屏障層。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述檢測(cè)層、所述屏障層或/和所述貯存層包含含有至少一種能量吸收劑的聚合物基質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷元件，其特征在于， 所述聚合物基質(zhì)由至少一種疏水聚合物、尤其是選自下述的疏水聚合物形成聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚碳酸酯和它們的化學(xué)衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的診斷元件，其特征在于， 所述聚合物基質(zhì)含有至少一種共價(jià)結(jié)合的或/和游離形式的能量吸收劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述能量吸收劑是選自花青染料的疏水染料，尤其是隱花青、吲哚三羰花青(C7)、氧雜羰花青(C3),碘化頻哪氰醇、硫雜羰花青v(C3)、硫雜二羰花青(C5)和方酸菁染料,尤其是方酸菁染料III。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述指示劑分析物被封裝在聚合物基質(zhì)中。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述指示劑分析物包含光化學(xué)或/和電化學(xué)可裂解的保護(hù)基。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14之一所述的診斷元件，其特征在于， 所述診斷元件被設(shè)計(jì)成測(cè)試帶、測(cè)試盤、測(cè)試墊、測(cè)試條或測(cè)試條卷盤。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15之一所述的診斷元件，其特征在于， 它被設(shè)計(jì)成用于測(cè)定幾種分析物。
17.分析測(cè)量裝置，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-16之一所述的診斷元件。
18.用于測(cè)定分析物的方法，所述方法包括下述步驟 (a)使所述分析物與根據(jù)權(quán)利要求1-16之一所述的診斷元件接觸，和 (b)測(cè)定所述分析物的存在或/和量。
19.用于校正由分析物產(chǎn)生的信號(hào)的方法，所述方法包括下述步驟 Ca)將根據(jù)權(quán)利要求1-16之一所述的診斷元件引入分析測(cè)量裝置中， (b)通過(guò)使所述分析物與所述診斷元件接觸，在所述分析測(cè)量裝置中產(chǎn)生第一個(gè)可檢測(cè)的信號(hào)， (C)通過(guò)釋放出在所述診斷元件中的指示劑分析物，在所述分析測(cè)量裝置中產(chǎn)生第二個(gè)可檢測(cè)的信號(hào)，和 Cd)使用在步驟(C)中產(chǎn)生的信號(hào)，校正在步驟(b)中產(chǎn)生的信號(hào)。
20.用于檢查分析測(cè)量裝置的檢測(cè)光學(xué)部件的方法，所述方法包括下述步驟 Ca)將根據(jù)權(quán)利要求1-16之一所述的診斷元件引入分析測(cè)量裝置中， (b)通過(guò)釋放出在所述診斷元件中的指示劑分析物，在所述分析測(cè)量裝置中產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，和 (C)用參照信號(hào)校正在步驟(b)中產(chǎn)生的信號(hào)。
21.用于控釋試劑的體系，所述體系包括 (a)載體，其包含所述試劑和所述試劑的單獨(dú)的反應(yīng)體系，其中所述試劑以對(duì)于所述反應(yīng)體系的反應(yīng)來(lái)說(shuō)的不可使用的可釋放形式存在，且可以在給定的條件下釋放，和 (b)用于釋放在所述載體上的所述試劑的方式。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的體系，其特征在于， 所述試劑被封裝在可溶解的基質(zhì)中，通過(guò)可溶解的屏障層與所述反應(yīng)體系分離，或/和包含化學(xué)保護(hù)基。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的體系作為開(kāi)關(guān)元件的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定至少一種分析物的診斷元件以及包含這樣的診斷元件的分析測(cè)量裝置。此外，本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定分析物的方法，一種用于校正由分析物產(chǎn)生的信號(hào)的方法，以及一種使用所述診斷元件的分析測(cè)量裝置來(lái)檢查檢測(cè)光學(xué)部件的方法。最后，本發(fā)明涉及一種用于控釋試劑的體系和這樣的體系作為開(kāi)關(guān)元件的用途。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102741694SQ201080063966
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者C.霍爾恩, D.海因德?tīng)? H-P.哈爾, N.施泰因克 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司